正常的kit流程中，HIV-1整合酶从HIV-1LTRDSDNA暴露的3'-末端裂解末端的两个碱基然后催化链转移重组反应，将DSDNA整合入TSDNA。接下来加入 的HRP-标记的TSDNA3 ' -末端修饰物的抗体就会结合到反应链上，加入HRP底物后即可通过 酶标仪比色读数，经进一步计算得出抑制率。
[0128] 实验材料：
[0129]XpressBio公司购买的HIV-lIntegraseAssayKit，14.3M的β-疏基乙醇，移液枪， 枪头，一次性手套，纸巾，去离子水，37°C孵育器，37°C水浴，酶标仪（Thermo，Varioskan Flash) 〇
[0130] 实验方法：
[0131] (1)预热试剂
[0132] 实验前将reactionbuffer和blockingsolution置于37°C水浴 10min，除HIV-1 整 合酶以外，将kit里所有其他成分放至室温条件预热。
[0133] (2)DSDNA覆盖
[0134] 将需要量的DSDNA用reactionbuffer稀释 100倍（10yL100XDSDNA+990y Lreactionbuffer)。每孔加入 100yL1XDSDNA溶液，37°C孵育30 分钟，将reaction buffer再放入37°C水浴。
[0135] (3)封板
[0136] 将液体从96孔板中吸出，用300yLlXwashbuffer洗5次。每孔加入200yL blockingbuffer并于37°CfP?育30分钟。
[0137] (4)加入整合酶
[0138] 用前将整合酶在湿冰上解冻（或2-8°C)5min并用离心机简单离心（lOOOOrpmX 5sec)。用reactionbuffer将酶稀释300倍（2yLHIV_l整合酶+598yLreactionbuffer)。
[0139] 吸出96孔板中的液体，用200yLreactionbuffer洗3次。每孔加入100yL的 reactionbuffer(空白对照)或整合酶溶液（阴性对照和实验组)37°C孵育30min。空白对照 做复孔。将reactionbuffer重新置于37°C水浴。
[0140] (5)加入抑制剂
[0141 ] 将要测试的化合物用reactionbuffer稀释至终浓度的两倍。例如，如果实验需要 1〇41或1(^8/1111^，就准备2(^1或2(^8/1]1]^的溶液并连续用163〇1:;[011131^€61'稀释。叠氮溶液稀 释至0.3 % (2X浓度或0.15 %终1X浓度）大概抑制50 %整合酶的活性。设50yLreaction buffer的空白和阴性(不加化合物)对照复孔。化合物最多可含5 %DMS0体积比的终浓度。
[0142] 将液体从孔里吸出，用200yLreactionbuffer洗三次。每孔加入50yL化合物的 reactionbuffer溶液(空白和阴性对照只有reactionbuffer)，室温下孵育5min。
[0143] (6)加入TSDNA
[0144] 将需要量的 100XTSDNA用reactionbuffer稀释 100倍（10yL+990yL)，每孔加50μ L1XTSDNA，在桌上水平轻摇平板3-5次将反应液混匀，37°C孵育30min。
[0145] (7)加入HRP抗体
[0146] 吸出孔里的液体，用300yLwashsolution洗五遍。每孔加入100yL辣根抗体溶液， 37°C孵育 30min。
[0147] (8)加入TMB过氧化物酶底物
[0148] 吸出板孔中的液体，用300yLwashsolution洗五遍。每孔加入100yLTMB过氧化 物酶底物溶液，室温下孵育1 〇min。
[0149] (9)加入TMB终止液
[0150] 向含有TMB底物的孔里直接加入100yLTMB终止液。用枪头把大气泡戳破。用酶标 仪读取450nm下的吸光度值。读数应在加入TMB终止液后10min内完成。
[0151] (10)数据处理
[0152] ①吸光度校正
[0153] 计算空白对照的平均吸光度(一般小于0.250D单位)作为背景吸光度(Ao)。阴性对 照与实验组每个孔的吸光度读数(A)都减去这个背景吸光度得到校正过的吸光度(At征)。
[0154] Ακε=Α-Αο
[0155] ②吸光度平均值与误差计算
[0156] 阴性对照及实验组经背景校正后，计算吸光度平均值以及SD值和CV值(SD/meanX 100%)〇
[0157] ③抑制率计算 [0158]首先计算活性百分比
[0159] 整合酶活性=测试化合物的平均吸光度/阴性对照的平均吸光度值X100%。
[0160] SD|钲=整合酶活性XCV隨侧資
[0161] 抑制率=1-整合酶活性土SDffiE
[0162] 实验结果：
[0163] 对表1所示10个化合物进行抗HIV-1整合酶活性筛选，其HIV-1整合酶抑制活性数 据见表2。阳性对照药设为埃替拉韦、雷特格韦。
[0165] 表2 5yg/mL时目标化合物对野生型HIV-1IN的抑制活性
[0168]如表2所示，目标化合物在5yg/mL浓度下对野生型HIV-1整合酶的抑制率在 48.43 %~86.22 %区间内。除化合物7al(48.43 % )外，所有化合物在该浓度下对整合酶的 抑制率均达到50%以上，其中三个化合物(7bl、7b2和7b7)抑制率达到80%以上。化合物7b2 在5以8/11^浓度下对野生型!11￥-1整合酶的抑制率最高，为86.2%，接近于整合酶抑制剂上市 药物雷特格韦(RAL)(90.6%)和埃替拉韦(EVG)(94.1%)。
【主权项】
1.4-(I，2,3_三氮唑取代苯胺基)-吡啶骈嘧啶酮衍生物，具有如下通式I所示的结构：其中， 1，2，3-三氮唑环为胺基苯邻位取代或间位取代； R为4-氣苄基、4-甲基苄基、苯乙基、苯丙基、1-萘基、苯胺酰基甲基、4-氣-苯胺酰基甲 基、4-氟-苯酰基甲基或4-三氟甲基-苯胺酰基甲基。2.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，化合物为下列之一：3. 如权利要求1所述的化合物，其特征在于，其制备方法如下： 以2-氟烟酸甲酯（1)为原料，与O-苄基羟胺经芳香性亲核取代反应，环合得到中间体1-(苄氧基)吡啶骈[2,3-(1]嘧啶-2,4(1!1，3!〇-二酮(3)，再依次经氯代、与炔取代苯胺的亲核 取代反应、与叠氮取代基的环加成反应、脱苄基反应得到目标化合物； 合成路线如下：反应试剂与反应条件：（i)二异丙基乙胺，0-苄基羟胺，140°C，微波，120min; (i i)三氯 乙酰异氰酸酯，二氯乙烷，三乙胺，MeONa，室温；（iii)二异丙基乙胺，三氯氧磷，100°C;(iv) N，N-二甲基甲酰胺，相应炔基取代的苯胺，室温；（V)相应的叠氮取代基，维生素 C钠盐，五水 合硫酸铜，四氢呋喃，水，室温；（vi)三氟乙酸，60°C，过夜； 其中，1，2，3-三氮唑环为氨基苯邻位取代、间位取代、对位取代;R如上述通式I中所述； 所述的相应炔基取代的苯胺选自：邻炔基苯胺、间炔基苯胺； 所述的相应的叠氮取代基选自：4_氟苄基叠氮、4-甲基苄基叠氮、苯乙基叠氮、苯丙基 叠氮、1 -萘基叠氮、苯胺酰基甲基叠氮、4-氟-苯胺酰基甲基叠氮、4-氟-苯酰基甲基叠氮、4-三氟甲基-苯胺酰基甲基叠氮。4. 如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，具体步骤如下： (1)将2-氟烟酸甲酯（1 )，0-苄基羟胺和二异丙基乙胺加入反应瓶，140°C条件下微波反 应120min，反应完毕，减压条件下蒸除过量二异丙基乙胺，所得粗品经硅胶柱层析分离纯化 得到中间体2-(苄基氧基胺基)烟酸酯(2); (2) 向2-(苄基氧基胺基）烟酸酯（2)的二氯乙烷溶液中加入三氯乙酰异氰酸酯的二氯 乙烷溶液，室温搅拌反应50min，加入三乙胺，30min后，减压蒸除多余溶剂，向反应瓶中加入 甲醇钠的甲醇溶液，质量溶度为25%，室温搅拌5min，加入甲醇后继续反应3小时;反应完毕 后将溶剂减压蒸除，用IN盐酸溶液将反应混合物pH调至3,得到的悬浊液用乙酸乙酯萃取， 合并有机相;将合并的有机相用饱和食盐水洗涤后无水硫酸钠干燥，减压浓缩，所得粗品经 硅胶柱层析分离纯化后，重结晶得中间体1_(苄氧基)吡啶骈[2,3-d]嘧啶-2,4(1H，3H)_二 酮⑶； (3) 向1_(苄氧基)吡啶骈[2,3-d]嘧啶-2,4(1H，3H)_二酮(3)的二异丙基乙胺溶液中滴 加三氯氧磷，完毕后反应温度升至l〇〇°C，45min后将多余的溶剂减压蒸除得到黑色油状物 (中间体4);将中间体4的粗品立即溶于N，N-二甲基甲酰胺，随后向上述混合溶液中加入相 应炔基取代的苯胺的N，N-二甲基甲酰胺溶液，室温搅拌反应50min~2h;反应完毕，将反应 液倾入水中，乙酸乙酯萃取;不溶物过滤并收集，合并的有机相用无水硫酸镁或无水硫酸钠 干燥，过滤浓缩后与上述不溶物滤饼合并;所得粗品用适当溶剂重结晶或经硅胶柱层析分 离纯化分别得到中间体5a，b;所述的相应炔基取代的苯胺选自：邻炔基苯胺、间炔基苯胺。 (4) 将相应的叠氮取代基、维生素 C钠盐和五水合硫酸铜依次加入相应炔基取代片段 (5a，b)的四氢呋喃/水混合溶液;所得反应混合液室温搅拌反应，薄层层析监测反应进度； 反应完毕后用乙酸乙酯萃取，不溶物分离用N，N-二甲基甲酰胺溶解后与萃取得到的有机相 合并，无水硫酸镁或无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，所得粗品经快速柱分离得到相应的 中间体6a，b;所述叠氮取代基选自：4_氟苄基叠氮、4-甲基苄基叠氮、苯乙基叠氮、苯丙基叠 氮、1-萘基叠氮、苯胺酰基甲基叠氮、4-氟-苯胺酰基甲基叠氮、4-氟-苯酰基甲基叠氮、4-三 氟甲基-苯胺酰基甲基叠氮； (5) 将中间体6a，b分别加入反应瓶，三氟乙酸作溶剂60°C过夜反应;反应完毕减压蒸除 溶剂，所得固体用甲醇洗涤，过滤得到相应的目标化合物粗品，经制备液相分离得到目标化 合物4-( 1，2，3-三氮唑取代苯基胺基)-吡啶骈嘧啶酮衍生物(7a，b)。5. 如权利要求1-2所述的4-(1，2,3_三氮唑取代苯胺基)-吡啶骈嘧啶酮衍生物在制备 HIV-I整合酶抑制剂中的应用。6. -种抗HIV药物组合物，其特征在于用权利要求1-2所述的4-(1，2，3-三氮唑取代苯 胺基)_吡啶骈嘧啶酮衍生物或其可药用盐与药用辅料制成不同剂型的药物制剂。
【专利摘要】本发明提供了一种4-(1,2,3-三氮唑取代苯胺基)-吡啶骈嘧啶酮衍生物，具有如下通式Ⅰ所示的结构。其中，1,2,3-三氮唑环为胺基苯邻位取代、间位取代；R为4-氟苄基、4-甲基苄基、苯乙基、苯丙基、1-萘基、苯胺酰基甲基、4-氟-苯胺酰基甲基、4-氟-苯酰基甲基、4-三氟甲基-苯胺酰基甲基。本发明还涉及该类衍生物的制备方法及其作为HIV抑制剂在制备抗艾滋病药物中的应用。
【IPC分类】A61P31/18, C07D471/04, A61K31/519
【公开号】CN105418609
【申请号】CN201511030119
【发明人】刘新泳, 张凌子, 展鹏, 孙林, 高萍
【申请人】山东大学
【公开日】2016年3月23日
【申请日】2015年12月31日