，2XTaqDNAMasterMix12yL，上下游引物各0·5μLΧ25μπιο1/ L)，质粒模板各lyL，ddH2〇补足25yL。反应条件为：95°C5min，94°Clmin，58°C30s，72°C30s， 35个循环，72°C延伸lOmin。取5yLRT-PCR扩增产物于2%琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定。
[0053] 1.7多重RT-PCR反应
[0054]先对多重RT-PCR反应条件，包括退火温度(53~60°C)，引物终浓度(0.1~Ιμπιο?/L)，2XTaqPCRMix酶浓度，反应体积(25~50yL)进行优化，确定最佳反应条件为25yL反应 体系，包括2XTaqDNAMasterMix12yL，2对引物上下游各0.5μLΧ25μπιο1/υ，质粒模板各1 yL，ddH2〇 补足 25yL。反应条件为：95°C5min，94°Clmin，58°C30s，72°C30s，35 个循环，72°C延 伸1Omin。取5yLPCR扩增产物于2 %琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定。
[0055] 1.8特异性试验
[0056] 采用建立的多重RT-PCR方法对PDCoV、PEDV、TGEV、PBoV、RV、PRRSV进行扩增，并选 择灭菌水做阴性对照，检验所建立方法的特异性。
[0057] 1.9敏感性试验
[0058]将测序正确的阳性质粒作为DNA标准品，用分光光度仪测定浓度后将两种质粒混 合后进行10倍系列稀释。根据公式计算出每微升质粒液体中含有的质粒拷贝数。用优化后 的反应条件进行多重RT-PCR扩增。
[0059] 1.10重复性试验
[0060]应用建立的多重RT-PCR，用优化后条件每隔一周重复检测一次，连续检测3次，以 检测结果的可靠性。
[0061] 1.11临床样品
[0062] 收集河南地区的25份猪腹泻肠内容物样品（编号1~25)、32份粪便样品（编号26~ 57)，用已经建立的多重RT-PCR和单一RT-PCR反应条件同时对这57份样品进行检测。
[0063] 2结果
[0064]2.1多重RT-PCR产物的电泳分析
[0065]以PDCoV、PEDV为模板做单重和多重RT-PCR，并以ddH20做阴性对照，分别扩增出PDCoV383bp、PEDVlOlbp特异性条带；多重RT-PCR可同时扩增出两条相应的特异性条带， 阴性对照未扩出条带（图1)。
[0066] 2.2特异性试验
[0067]用建立的多重RT-PCR方法对PDCoV、PEDV的单一及混合质粒为模板，TGEV、PBoV、PRRSV、RV为模板分别使用建立的多重RT-PCR方法进行扩增，只有PDC〇V、PEDV单一和混合 cDNA模板扩增出与相应目的片段大小符合的条带，而其它病毒均无条带（图2)。
[0068]2.3单重RT-PCR敏感性试验
[0069]分别以PDCoV和PEDV10倍倍比稀释的质粒（108~10Q)作为模板，用建立好的多重RT-PCR方法进行扩增，扩增结果显示PDCoV最低检测量为4.05X101拷贝AxL(图3)，PEDV最 低检测量为4.52X101拷贝ΛΛ(图4)。
[0070]2.4多重RT-PCR敏感性试验
[0071]以PDCoV和PEDV的混合质粒10倍倍比稀释后作为模板，用建立好的多重RT-PCR方 法进行扩增，扩增结果显示PDCoV最低检测量为4.05X101拷贝AxL，PEDV最低检测量为4.52 \1〇3拷贝/^(图5)。
[0072]2.5多重RT-PCR重复性试验
[0073]以PDCoV和PEDV的混合质粒107~102拷贝AxL为模板，利用建立好的多重RT-PCR方 法每隔1周扩增一次，连续扩增4周。结果表明4次扩增结果一样，表明该多重RT-PC方法具有 较高的可重复性。
[0074]2.6多重RT-PCR临床样品检测结果
[0075]用建立的多重RT-PCR和单一RT-PCR对河南地区的57份样品进行检测，检测结果见 表2,两种方法检测无论是PDC〇V、PEDV单一感染阳性符合率还是二者混合感染阳性符合率 均是100%。
[0076]表2临床样品检测结果
[0077]Tablel2DetectionResultofclinicalsamples
[0078]
[0079]3 讨论
[0080]2014年初，WangLeYi在PEDV阴性的腹泻致死仔猪中，PDCoV首次被辨认。2014年2 月，美国俄亥俄州和印第安纳州首次检测到roc〇v，随后美国其他州以及加拿大相继检测出 该病毒。目前国内对roc〇v的基因型、致病性、稳定的体外培养研究很少，对PDCoV的感染无 有效的治疗方法和疫苗。2015年本发明室分离到一株roCoV(命名HN-2015)，为roCoV的相关 研究以及预防提供了基础。
[0081]PDCoV和PEDV是导致仔猪腹泻疾病的常见病毒，发病率高，目前均无有效的药物， 并且两者在临床症状、流行病学和病理变化上无明显差异。到目前为止，美国已有20多个州 暴发了猪群腹泻，PDCoV可以单独感染，也可以与PEDV、TGEV混合感染。在H)C〇V感染的猪场， 猪的发病率和致死率非常高，给养猪业造成了巨大的经济损失。传统的检测方法，如细胞培 养、免疫学和动物实验等虽能对二者鉴别诊断，但是最大的缺点是检测周期长，灵敏度低。 RT-PCR技术是目前鉴别诊断二者的最敏感、特异的方法。相对于单重RT-PCR方法，多重RT-PCR能同时进行多种病原微生物的鉴别诊断，且具有灵敏度高、特异性好，方便快捷等特点， 适用于大规模检测，在动物疫病的流行病与预防中，具有不可替代的作用。
[0082]本发明通过设计合成2对引物，以PEDV和PDCoV混合质粒为模板，在单一RT-PCR基 础上，优化RT-PCR体系和反应条件，建立了同时检测PEDVM基因、PDCoVN基因特异性片段的 多重RT-PCR方法。2013年，霍金耀建立的多重RT-PCR检测方法中对PEDV的最低检测浓度为 125pg。2015年，逢凤娇在国内首次建立了H)C〇V的RT-PCR检测方法，对H)C〇V最低检测浓度 为4.05X103拷贝AiL。而本发明建立的多重RT-PCR对TODV和PDCoV最低检测浓度分别为 4.52X103拷贝ΛΛ和4.05X101拷贝。虽然PEDV与本试验中单重RT-PCR相比，拷贝数降低 了 1〇2个数量级，但仍然具有很强的敏感性。表明，建立的多重RT-PCR反应具有很好的敏感 性。利用此方法对河南省地区的57份进行检测，PDCoV单一感染率是19.30%，PEDV单一感染 率是26.32 %，PDCoV和PEDV混合感染率是8.77 %。与单重RT-PCR方法比较，两种方法的阳性 检出符合率为100%，完全可以替代单重RT-PCR，节约了时间和成本。
[0083]综合分析表明，该方法具有良好的特异性、敏感性及可重复性，不但可以应用与PDCoV和PEDV的流行性病学调查，也为H)CoV和PEDV早期感染的快速诊断奠定了重要基础。
【主权项】
1. 猪德尔塔冠状病毒和猪流行性腹泻病毒多重RT-PCR检测引物，其特征在于： 猪德尔塔冠状病毒的引物序列如下： 上游引物Pl: 5 ' -GCGTTTCCTGGGCTGATT-3' 下游引物P2:5 ' -ATGGCTACTGGCTGCGTTAC-3 ' 扩增猪德尔塔冠状病毒基因部分片段383bp; 猪流行性腹泻病毒的引物序列如下： 上游引物 P3:5' -TGGCGACTGTGACGAAAT-3' 下游引物P4:5 ' -TGT AACGCTAACACTCCTT-3' 扩增猪流行性腹泻病毒基因部分片段lOlbp。2. 利用权利要求1所述引物检测猪德尔塔冠状病毒和猪流行性腹泻病毒多重RT-PCR的 方法，该方法不用于疾病的诊断和治疗，包括提取病毒的DNA后，按如下多重荧光定量RT-PCR反应体系和反应条件对病毒进行检测，其特征在于： 所述多重荧光定量RT-PCR反应体系，在25μ1体系中加入以下成份：所述反应条件为:95°C5min，94°C Imin，58°C30s，72°C30s，35 个循环，72°C 延伸 IOmin。
【专利摘要】本发明公开了一种猪德尔塔冠状病毒和猪流行性腹泻病毒多重RT-PCR检测引物：猪德尔塔冠状病毒的引物序列如下：上游引物P1：5＇-GCGTTTCCTGGGCTGATT-3＇下游引物P2：5＇-ATGGCTACTGGCTGCGTTAC-3＇扩增猪德尔塔冠状病毒基因部分片段383bp。本发明多重RT-PCR对PDCoV和PEDV的最低检测量分别是4.05×101拷贝/μL和4.52×103拷贝/μL，而对猪传染性胃肠炎病毒，博卡病毒，猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪轮状病毒的扩增结果均为阴性。应用该方法和单重PCR对57份临床样品的多重PCR检测结果显示，同时感染这2种病毒的阳性率为8.77%，感染PDCoV阳性率为19.30%，感染PEDV阳性率为26.32%。
【IPC分类】C12Q1/68, C12Q1/70, C12R1/93, C12N15/11
【公开号】CN105420412
【申请号】CN201511016093
【发明人】胡慧, 曹贝贝, 韩丽, 靳晓慧, 周雍, 张利卫
【申请人】河南农业大学
【公开日】2016年3月23日
【申请日】2015年12月31日