猪德尔塔冠状病毒和猪流行性腹泻病毒多重rt-pcr检测引物及检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种病毒的检测方法，具体涉及一种猪德尔塔冠状病毒和猪流行性腹 泻病毒多重RT-PCR检测引物及检测方法。
【背景技术】
[0002] 猪德尔塔冠状病毒（PoreineDe1tacoronavirus，PDCoV)属于尼多病毒目 (Nidovirales)、冠状病毒科(Coronaviridae)、冠状病毒属(Coronavirus)的Delta冠状病 毒，为有囊膜的单股正链RNA病毒。早在2012年，Woo等发表的文章中就有H)CoV的报道:他们 对广东和香港等地采集的哺乳动物和禽类病料进行Delta冠状病毒检测，其中在猪粪便样 品（169份）中检测到近10%的PDCoVdOH年初，美国俄亥俄州首次检测报道一种新的猪肠 道冠状病毒H)C〇V，截止2014年底，美国发现roc〇v感染病例达17个州。随后在加拿和韩国也 报道检测到了PDCoV，其阳性检出率高达25 %。猪流行性腹泻病毒（Porcineepidemic diarrheavirus，PEDV)与FOCoV属于同一个科，但是属于Alpha冠状病毒。首次报道于英国， 此后在世界多国均见有PEDV感染的报道，我国于1976年有PEDV感染的报道。自20世纪80年 代后期PEDV在我国呈现大面积流行
【发明内容】
[0003]本发明的目的是提供一种猪德尔塔冠状病毒和猪流行性腹泻病毒多重RT-PCR检 测引物及检测方法。
[0004]本发明的技术方案是:猪德尔塔冠状病毒和猪流行性腹泻病毒多重RT-PCR检测引 物：
[0005]猪德尔塔冠状病毒的引物序列如下：
[0006]上游引物PI :5'-GCGTTTCCTGGGCTGATT-3'
[0007]下游引物P2:5 ' -ATGGCTACTGGCTGCGTTAC-3 '
[0008]扩增猪德尔塔冠状病毒基因部分片段383bp;
[0009]猪流行性腹泻病毒的引物序列如下：
[0010]上游引物P3:5' -TGGCGACTGTGACGAAAT-3 '
[0011]下游引物P4:5'-TGTAACGCTAACACTCCTT-3'
[0012] 扩增猪流行性腹泻病毒基因部分片段101bp。
[0013]利用所述引物检测猪德尔塔冠状病毒和猪流行性腹泻病毒多重RT-PCR的方法，该 方法不用于疾病的诊断和治疗，包括提取病毒的DNA后，按如下多重荧光定量RT-PCR反应体 系和反应条件对病毒进行检测：
[0014]所述多重荧光定量RT-PCR反应体系，在25μ1体系中加入以下成份：
[0016]所述反应条件为：95°C5min，94°Clmin，58°C30s，72°C30s，35个循环，72°C延伸 10min〇
[0017] 本发明的有益效果是:本发明根据GenBank中登录的猪Deltacoronavirus(PDCoV) 和猪流行性腹泻病毒(PEDV)基因序列，设计了2对引物分别用于扩增roCoVN基因和PEDVΜ基因的目的片段。通过对PCR反应条件进行优化，建立了检测PDCoV和PEDV的多重RT-PCR诊 断方法。敏感性和特异性结果显示，该多重RT-PCR对H)C〇V和PEDV的最低检测量分别是4.05 X101拷贝和4.52X103拷贝/VL，而对猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)，博卡病毒(PBoV)，猪 繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪轮状病毒(RV)的扩增结果均为阴性。应用该方法和单 重PCR对57份临床样品的多重PCR检测结果显示，同时感染这2种病毒的阳性率为8.77%，感 染H)CoV阳性率为19.30 %，感染PEDV阳性率为26.32 %。结果表明，建立多重PCR方法能够对 PDCoV和PEDV单个或混合感染的临床样品进行快速鉴别诊断。
【附图说明】
[0018]图1多重RT-PCR电泳图，M:DL2000DNA marks l:PDCoV and PEDV 2:PDCoV 3: PEDV4:阴性对照；
[0019]图2多重RT-PCR特异性试验，M:DL2000DNA marks l:PDCoV、PEDV多重PCR产物；2~ 7分别是:PDCoV、PEDV、TGEV、PBoV、PRRSV、RV的PCR产物;8:阴性对照；
[0020]图3PDCoV的RT-PCR敏感性试验，M:DL2000DNA marks 1~9:4·05Χ108拷贝/yL~ 4.05X10°拷贝ΛΛ10:阴性对照；
[0021] 图4PEDV的RT-PCR敏感性试验，M:DL2000DNAmarksl~9:4·52X108拷贝/μL~ 4.52X10°拷贝ΛΛ10:阴性对照；
[0022]图5多重RT-PCR的敏感性试验，M:DL2000DNA marks 1~8:107~10Q拷贝/yL 9:阴 性对照。
【具体实施方式】
[0023] 本发明根据GenBank登录的PDCoV的HKU15-155株N基因序列，PEDV的JXNC1302株Μ 基因序列，通过序列分析获得其高度保守的特异性序列，并根据该特异性保守序列设计了 两对特异性引物。在此基础上建立了roCoV和PEDV的多重RT-PCR检测方法，并对此方法进行 了评价分析。对河南地区送检的病料样品进行检测分析，进一步在实践中验证方法的可靠 性，从而为兽医临床的诊断和治疗提供理论依据。
[0024]猪德尔塔冠状病毒和猪流行性腹泻病毒多重RT-PCR检测引物：
[0025]猪德尔塔冠状病毒的引物序列如下：
[0026]上游引物PI:5'-GCGTTTCCTGGGCTGATT-3,
[0027]下游引物P2:5 ' -ATGGCTACTGGCTGCGTTAC-3'
[0028]扩增猪德尔塔冠状病毒基因部分片段383bp;
[0029]猪流行性腹泻病毒的引物序列如下：
[0030]上游引物P3:5' -TGGCGACTGTGACGAAAT-3 '
[0031]下游引物P4:5'-TGTAACGCTAACACTCCTT-3'
[0032]扩增猪流行性腹泻病毒基因部分片段lOlbp。
[0033]利用所述引物检测猪德尔塔冠状病毒和猪流行性腹泻病毒多重RT-PCR的方法，该 方法不用于疾病的诊断和治疗，包括提取病毒的DNA后，按如下多重荧光定量RT-PCR反应体 系和反应条件对病毒进行检测：
[0034]所述多重荧光定量RT-PCR反应体系，在25μ1体系中加入以下成份：
[0036]所述反应条件为：95°C5min，94°Clmin，58°C30s，72°C30s，35个循环，72°C延伸 10min〇
[0037] 本发明具体操作为：
[0038] 1材料和方法
[0039] 1.1病毒和细胞
[0040]猪DeltaC〇r〇naViruS(PDC〇V)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒 (TGEV)、猪博卡病毒(PBoV)、猪轮状病毒(RV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、LLC-PK细 胞、Vero细胞均由河南农业大学河南省动物性食品安全重点实验室保存。PDCoV接种ST细 胞、PEDV接种Vero细胞传至8代后出现80%以上的细胞病变(CPE)时收毒。同时设正常未接 毒的细胞为阴性对照。
[0041 ] 1 · 2主要试剂
[0042]pMD18-T载体、QIAampViralRNAMiniKit提取试剂盒和QIAGEN反转录试剂盒购 自QIAGEN公司、2XTaqPCRMix酶、DNAMarker、DNA凝胶回收试剂盒均购自TaKaRa公司； TRIzol试剂购自Invitrogen公司。
[0043] 1.3引物的设计及合成
[0044]应用PrimerPremier5 · 0基因分析软件，参照Genbank中登录的]^CoVN基因、 PEDVΜ基因设计2对引物（表1)，扩增PDCoVN基因部分片段383bp，TODVΜ基因部分片段 l〇lbp，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。用双蒸水稀释为25ymol/L，-20°C 保存。
[0045] 表1多重RT-PCR引物信息
[0046]
[0047] 1.4病毒核酸的提取
[0048]接毒细胞悬液和临床样品于_80°C反复冻融3次后用于病毒核酸的提取。参照 QIAampViralRNAMiniKit提取试剂盒提取病毒总RNA，并利用反转录试剂盒制备反转录 为cDNA，-80°C保存。
[0049] 1.5PCR产物的鉴定
[0050] 单一病毒的RT-PCR反应在25yL体系中进行，包括2XTaqDNAMasterMix15yL，上 下游引物各ΙμLΧ25μL?〇1/υ，cDNA模板4yL，ddH2〇补足25μΙ^ΡΟ?反应扩增参数为：95°C5min， 94°Clmin，58°C30s，72°C30s，35个循环，72°C延伸lOminJCR产物经2.0 %琼脂糖凝胶电泳 检测，用胶回收试剂盒回收目的产物，将回收的目的片段与PMD18-T载体连接，转化感受态 细胞，用质粒提取试剂盒提取质粒，由上海生工生物工程技术服务有限公司测序。
[0051 ] 1 · 6单一RT-PCR反应条件优化
[0052]在25yL体系中进行