一种从皱瘤海鞘中分离黑麦草内酯的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于药物分离工艺领域，具体地说，涉及一种从皱瘤海鞘中分离黑麦草内 酯的方法。
【背景技术】
[0002] 海鞘是尾索动物亚门海鞘纲的尾索动物，在自然界中已知有1500余种，主要分布 在热带及亚热带海域。我国海鞘资源丰富，已记录的中国沿海海鞘种类有100余种，且有很 多为我国所特有。据报道，海鞘中含有多种具有抗肿瘤、抗病毒、抗菌、抗炎等活性的化合 物，因此，近年来，海鞘的化学成分及其生物活性成为了海洋天然产物研究的热门领域。
[0003] 皱瘤海鞘（Styelaplicata)是海鞘中的一种，主要分布于我国中南沿海，福建、广 东和海南等，部分地区也有人工养殖。皱瘤海鞘经常在一些海产养殖过程中一同生长起来， 虽然皱瘤海鞘在部分地区有作为食物食用的习惯，但大部分的皱瘤海鞘仍然是作为养殖过 程中的副产物被丢弃掉，造成了大量的浪费。因此，如果能将皱瘤海鞘进行有效的利用，不 仅具有一定的经济价值，也可以解决浪费问题。
[0004] 黑麦草内酯（Loliolide)的化学结构式如下所不，其分子式为CnH1603，相对分子 量为196. 246。经报道，黑麦草内酯具有抗菌、抗肿瘤的生物活性，还可以抑制EB病毒的早 期抗原EBV-EA的产生；另有报道其具有一定的免疫抑制作用；此外，黑麦草内酯还可以抑 制藻类生长，是一种潜在的水体富营养化控制剂。因此，黑麦草内酯具有一定的研究价值与 经济价值。目前，黑麦草内酯的主要来源是从植物中提取分离，而从皱瘤海鞘中提取分离黑 麦草内酯的方法还未见报道。
[0005]
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供了一种从皱瘤海鞘中分离黑麦 草内酯的方法，方法简单，提取时间短，效率高，得到的黑麦草内酯纯度高。
[0007] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
[0008] -种从皱瘤海鞘中分离黑麦草内酯的方法，包括：
[0009] 1)取皱瘤海鞘，用乙醇浸提得到乙醇粗提物；乙醇粗提物用甲醇溶解后过滤，滤 液浓缩得到粗提物溶液，按粗提物溶液与正相硅胶体积比为1:4~8的比例，用100~200 目的正相硅胶进行柱层析；以二氯甲烷-甲醇混合液作为洗脱液，且依次按100%二氯甲烷 -0. 5~1. 5%甲醇一8~12%甲醇一45~55%甲醇一100%甲醇进行梯度洗脱，每一梯 度洗脱1~7个柱体积，分别收集每个柱体积的洗脱液，浓缩至干，进行TLC分离；所述TLC 分离条件为：硅胶G254薄层板，体积比8~12:1的二氯甲烷-甲醇混合液作为展开剂；
[0010] 2)取步骤1)TLC中Rf值为0. 45~0. 55的组分，合并后进行反相固相萃取分离， 采用BondElutC18固相萃取柱，真空固相萃取装置，湿法上样，以甲醇-水混合液作为洗 脱液，且依次按100%水一25~35%甲醇一65~75%甲醇一100%甲醇进行梯度洗脱，每 一梯度洗脱1~7个柱体积，收集各梯度的洗脱液，得到100%水组分、25~35%甲醇组分、 65~75%甲醇组分、100%甲醇组分；
[0011] 3)取步骤2)中得到的25~35%甲醇组分，浓缩至干，得到粗品；
[0012] 4)取步骤3)中得到的粗品，用甲醇配置成0. 8~1. 2mg/mL，采用HPLC进行纯化； HPLC条件为：固定相：HPLC半制备柱0DS-A，20X250mm，柱内径5μπι;流动相：45~55%甲 醇；流速：6~10mL/min;进样量：0· 95~1. 05mL;检测器：检测波长：210nm和220nm;收集 22~28min大峰出现时的洗脱液，浓缩，即得黑麦草内酯。
[0013] -实施例中：所述步骤1)中，粗提物溶液与正相硅胶体积比为1:5. 5~6. 5 ;以二 氯甲烷-甲醇混合液作为洗脱液，且依次按100%二氯甲烷一〇. 8~1. 2%甲醇一9. 5~ 10. 5%甲醇一49~51 %甲醇一100%甲醇进行梯度洗脱，每一梯度洗脱2~6个柱体积， 分别收集每个柱体积的洗脱液，浓缩至干，进行TLC分离；所述TLC分离条件为中，展开剂为 体积比9~11:1的二氯甲烷-甲醇混合液。
[0014]一实施例中：所述步骤2)中，取步骤1)TLC中Rf值为0.48~0.52的组分；反相固 相萃取分离中，以甲醇-水混合液作为洗脱液，且依次按100%水一29~31%甲醇一69~ 71 %甲醇一100%甲醇进行梯度洗脱，每一梯度洗脱2~6个柱体积，收集各梯度的洗脱液， 得到100%水组分、29~31 %甲醇组分、69~71 %甲醇组分、100%甲醇组分。
[0015]-实施例中：所述步骤3)中，取步骤2)中得到的29~31%甲醇组分，浓缩至干， 得到粗品。
[0016] -实施例中：所述步骤4)中，取步骤3)中得到的粗品，用甲醇配置成0.9~ 1.lmg/mL;HPLC条件中：流动相：49~51 %甲醇；流速：7~9mL/min;溶液传输单元： LC-6AD;进样器：SIL-10AP;进样量：0.95~1.05mL;检测器：光电二极管阵列检测器 STO-M20A;收集24~26min大峰出现时的洗脱液，浓缩，即得所述之黑麦草内酯。
[0017] -实施例中：所述步骤1)中，用乙醇浸提得到乙醇粗提物的方法为：取皱瘤海鞘， 阴干，切碎，向切碎后皱瘤海鞘中加入1~1. 5倍体积的乙醇，置均质机中破碎后，浸提6~ 8d，浸提液取出备用；重新加入1~1. 5倍体积的乙醇，浸提2~4d后，浸提液取出备用；再 次加入1~1. 5倍体积的乙醇，浸提2~4d后，取出备用；三次得到的的浸提液相互合并， 回收溶剂，即得乙醇粗提物。
[0018]-实施例中：所述浸提过程中，每天超声振动提取0.5~2h。
[0019]一实施例中：其特征在于：所述步骤1)中，正相硅胶型号为SY01。
[0020] -实施例中：所述步骤2)中，真空固相萃取装置为12管或24管真空固相萃取装 置。
[0021] -实施例中：所述步骤2)中，所述固相萃取柱为若干根固相萃取柱并联。
[0022] 本技术方案与【背景技术】相比，它具有如下优点：
[0023] 1.黑麦草内酯的传统来源之一是从植物中提取，但植物提取方法比较繁琐，其中 具有叶绿素等色素，还有纤维素等，这些物质干扰性较强且不易除去，且植物细胞具有细胞 壁，相对提取效率较低；本发明提供了一种从皱瘤海鞘中分离黑麦草内酯的方法，皱瘤海鞘 作为一种海洋动物，不具有细胞壁，而且其中的成分较为单纯，含有的氨基酸、糖类的物质 也相对容易去除，因此，从皱瘤海鞘中提取黑麦草内酯，比从植物中提取，方法更为简单，且 提取效率更高，纯度更高。
[0024] 2.皱瘤海鞘经常在其他海产养殖中一并成长起来，以往都是作为副产物被丢弃 掉，造成了大量的浪费，本发明提供了从皱瘤海鞘中提取黑麦草内酯的方法，为皱瘤海鞘的 再利用提供了思路，可以有效减少了浪费，实现节约资源的目的。
[0025] 3.本发明的从皱瘤海鞘中提取黑麦草内酯的方法，采用了反相固相萃取的方式， 与传统的分子筛相比，所需时间大大缩短，能够缩短提取时间一倍以上，提取效率更高，而 且成本可比分子筛降低至少一倍；与反相液相色谱提取方法相比，能够大大减少提取过程 中样品损耗较大的问题。
【附图说明】
[0026] 下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
[0027] 图1为本实施例1中得到的黑麦草内酯在流动相为50%甲醇时的HPLC分析谱图。
[0028] 图2为本实施例1中得到的黑麦草内酯的MS谱图。
[0029] 图3为本实施例1中得到的黑麦草内酯的1Η谱谱图。
[0030] 图4为本实施例1中得到的黑麦草内酯的13C谱谱图。
【具体实施方式】
[0031] 下面通过实施例具体说明本发明的内容：
[0032] 实施例1
[0033] 1)取湿重10kg的皱瘤海鞘，阴干，切碎，向切碎后皱瘤海鞘中加入1. 25倍体积的 乙醇，置均质机中破碎后，置于5L烧杯中，浸提7d且浸提过程中每天超声振动提取lh以加 速提取，浸提液取出备用；重新加入1. 25倍体积的乙醇，浸提3d且浸提过程中每天超声振 动提取lh以加速提取，浸提液取出备用；再次加入1. 25倍体积的乙醇，浸提3d且浸提过程 中每天超声振动提取lh以加速提取，浸提液取出备用；三次得到的的浸提液相互合并，以 旋转蒸发仪蒸发回收溶剂，即得乙醇粗提物120g;向乙醇粗提物中加入甲醇直至溶剂呈无 色，过滤，除去不溶性杂质如盐类等，滤液用旋转蒸发仪蒸发回收溶剂并浓缩至50ml，得到 粗提物溶液；按粗提物溶液与正相硅胶体积比为1:6的比例量取正相硅胶进行柱层析；本 实施例之中，所述正相硅胶为SY01，100~200目，用量为600g;以二氯甲烷-甲醇混合液 作为洗脱液，依次按100%二氯甲烧一1 %甲醇一10%甲醇一50%甲醇一100%甲醇进行梯 度洗脱，每一梯度洗脱3~5个柱体积，分别收集每个柱体积的洗脱液，浓缩至干，进行T