一种pac1-r和glp-1r的双向激动剂ot23及应用
【专利说明】—种PAC1-R和GLP-1R的双向激动剂0T23及应用
[0001]
技术领域
[0002]本发明涉及生物化学领域，具体地说，涉及一种PACl-R和GLP-1R的双向激动剂0T23及应用。
【背景技术】
[0003]胃泌酸调节肽(oxyntomodulin，OXM)是由胰高血糖素原基因在肠道L细胞和中枢神经元内转录加工后得到的37个氨基酸组成的脑肠肽。OXM通过同时激活胰高血糖素样肽-Kglucagon-like peptide-1 ,GLP-1)受体和膜高血糖素受体(glucagon receptor，GCGR)发挥显著抑制食欲，减少能量摄入，增加能量消耗，促进胰岛素释放及远期细胞保护的功能。其中GLP-1R介导的有效降低血糖和保护胰岛辟田胞的功能，是目前糖尿病药物开发的重要靶点[1]。
[0004]垂体腺苷酸环化酶激活多肽(pituitaryadenylate cyclase activatingpolypeptide，PACAP)是由垂体分泌的、或目的组织自分泌和旁分泌的、具有重要生物学功能的神经多肽，属于是促胰液素/高血糖素/血管活性肠肽(vasoactive intestinalpeptide)家族中的新成员。PACAP的具有3个B类G蛋白偶联受体:PACl-R是PACAP的特异受体;VPACl-R和VPAC2-R是PACAP和VIP的共同受体;PACAP对3个受体具有相同的激动功能。PACAP特异受体PACl-R主要分布在中枢神经系统、周围神经系统及内分泌组织和器官，包括睾丸、卵巢、呼吸道、肺、胰腺、胸腺等;介导PACAP显著的抗细胞凋亡，调节细胞增殖分化;神经保护和促进神经修复;调节血管功能;促进激素分泌，调节内分泌平衡；调节性腺功能和生殖细胞的产生;参与消化活动调节能量代谢平衡;调节内分泌平衡;促进觉醒，帮助提升学习和记忆能力；等的作用。而已有研究显示PACl的激活有效抑制胸腺的衰退[2]，具有调节免疫系统功能的作用。
[0005]我们将OXM与PACAP进行比对后发现:它们的N端13个氨基酸高度同源，如图1所示，提示13个氨基酸可能承载OXM与PACAP共同的作用。并且作为内源性的多肽类激素，OXM和PACAP均容易受到体内二肽基肽酶-4(dipeptidyl peptidase _4，DPP_4)的对多肽N端的水解，造成活性减退和丧失，甚至形成自身的抑制剂；因此体内额外补充OXM和PACAP的N端高同源性的13氨基酸组成的短肽，可能有效稀释DPP-4对OXM和PACAP的降解作用，从而增强OXM和PACAP的相关活性。
[0006]由11个氨基酸组成TAT序列(YGRKKRRQRRR)是最初发现于HIV病毒Tat蛋白中的具有穿膜功能的短肽，含有8个碱性氨基酸，生理条件下带较高的正电荷，并形成稳定的a螺旋结构。TAT具有强大的运载潜能，能将与之共价结合的外源性蛋白质、DNA、RNA、化学药物等转运至细胞内，甚至可以穿越血脑屏障。此过程不受所结合的化合物或复合物分子类型和大小的限制，并且对宿主细胞没有显著毒副作用。并且我们已发表的文章提示TAT可能有效促进VIP对PACl-R的结合和激活。
[0007]我们首次尝试了将OXM的N端与PACAP高度同源13个氨基酸组成的短肽与TAT的C端10个氨基酸融合，构建出新的23个氨基酸组成的人工多肽，命名为0T23(序列:HSQGTFTSDYSKYGRKKRRQRRR);并就其体内的生物学活性开展了探索性的研究。
【发明内容】
[0008]本发明的目的在于构建既有效激活GLP-1R又能有效激活PACl-R的双向激动剂，并能够高效穿越生物屏障的人造多肽;本发明首次将OXM与PACAP高度同源的N端13个氨基酸与有穿膜功能的TAT的C端10个氨基酸融合，人工构建一个由23个氨基酸组成的PACl-R和GLP-1R的双向激动剂0Τ23，其氨基酸序列如下所示:
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Gly Arg Lys Lys ArgArg Gln Arg Arg Arg。序列表如SEQ N0.1所示。
[0009]本发明研究发现0T23具有:
(1)有效激活PACl-R和GLP-1R，是一个双向激动剂；
(2)显著协助机体提高糖耐受，并抵抗胰岛细胞凋亡，具有治疗糖尿病的潜能；
(3)体内体外显著抵抗胸腺细胞的凋亡，抑制胸腺衰退，具有增强胸腺相关免疫功能的作用；
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果:
1.本发明的多肽是PACl-R和GLP-1R的双向激动剂，具有一石二鸟的作用;例如对于糖尿病合并胸腺衰退相关免疫低下或免疫失调有双重治疗效果；可用于胸腺发育不全综合征，免疫缺陷病，全身性红斑狼疮、类风湿性关节炎等自身免疫性疾病，重症感染、慢性感染、慢性肾炎等等伴有细胞免疫功能低下伴随代谢障碍，如消瘦、厌食或糖尿病的症状治疗。
[0010]2.本发明具有穿越生物屏障运输的功能有效提高其到达靶点部位效率。
【附图说明】
[0011]图1为0Τ23序列的设计思路；
图2为化学合成0Τ23的质谱图和高效液相纯度分析图；
图3为0Τ23的受体选择性鉴定；
图4为0Τ23促进糖耐受；
图5为0Τ23抑制胸腺细胞凋亡;细胞活性的MTT检测；
图6为0Τ23抑制胸腺衰退;A) sjTREC扩增曲线；B)胸腺和脾脏sjTREC的水平检测；图7为0T23同时治疗糖尿病合并胸腺衰退的免疫低下;A)糖耐受测定；B)体重;C)胸腺指数;D)胸腺sjTREC的水平检测。
【具体实施方式】
[0012]下面结合具体实施例对本发明做进一步地描述，但具体实施例并不对本发明做任何限定。
[0013]实施例1:0T23的化学合成与鉴定
0T23的序列为:HSQGTFTSDYSKYGRKKRRQRR;采用化学合成的方法制备，0T23序列的设计思路如图1所示。如图2A所示，质谱结果显示化学合成多肽分子量为2988.25，与理论值相符;HPLC结果显示纯度大于99%(图2B)。
[0014]实施例2: 0T23是PACl-R和GLP-1R双向激动剂
受体竞争性结合实验结果表明:如图3A所示，0T23竞争125I标记的GLP-1对GLP-1R的半有效浓度EC5q为31.7±2.1nM，而对GCGP的EC5()大于10uM，因此0T23是GLP-lR的特异激动剂。
[0015]如图3B所示，0T23有效竞争125I标记的PACAP对PACl-R的结合，其EC50为13.1 土
0.9nM，而0T23不能有效竞争125I标记的PACAP对VPACl-R和
VPAC2-R的结合(EC5q大于1uM)；因此0T23是PACl-1R的特异激动剂。
[0016]细胞增殖实验结果显示，0T23有效促进PACl-CHO细胞的增殖，但不能促进VPACl-CHO和VPAC2-R的增殖;进一步证明0T23是PACl-1R的特异激动剂。
[0017]综上所述，0T23是PAQ-R和GLP-1R的双向激动剂。
[0018]实施例3:0T23有效提高糖耐受
当GLP-l(10nmol/kg)和0T23(10nmol/kg)分别与高浓度葡萄糖(5mg/kg)共同腹腔注射小鼠，收集注射前(Oh)和注射后0.5-2h内每隔0.5h的血糖，血糖指数(如图4)显示，0T23显著降低了血糖指数的升高，提高机体处理高糖的能力。
[0019]实施例4:0T23促进胸腺淋巴细胞增殖，抑制胸腺淋巴细胞凋亡
体外制备地塞米松(Dex)诱导淋巴细胞凋亡模型，CCK8检测细胞增殖率，流式细胞术Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡，进行统计学分析。实验数据表明DeX(0.04yg/mL)显著抑制小鼠胸腺淋巴细胞的增殖，诱导细胞凋亡，而0T23有效促进胸腺淋巴细胞的增殖，增加细胞存活率，且呈剂量相关效应(图5);Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡结果表明，与061组相比(凋亡率86.3±5.8)，(^23(10醒01/1111)显著降低细胞凋亡率(45.7±6.2)，明显抑制淋巴细胞凋亡，可有效保护胸腺淋巴细胞。
[0020]实施例5:0T23有效恢复胸腺功能，逆转胸腺萎缩
建立D半乳糖诱导免疫衰老(胸腺萎缩)小鼠模型后，腹腔注射lOnmol/kg 0T23，对照组小鼠注射相同剂量的生理盐水，连续注射10天。处死小鼠，无菌条件下取胸腺和脾脏称重后用研磨，收集细胞悬液，利用实时定量PCR定量分析小鼠胸腺T淋巴细胞及脾脏(外周)T细胞的sjTRECs水平(如图6A)，从而评价小鼠胸腺生成和输出功能。结果表明，注射0T23后，与对照组相比，胸腺和外周的sjTRECs含量均显著上升(图6)，证实0T23可有效回复胸腺功能，逆转胸腺萎缩。
[0021 ]实施例6:0T23有效治疗糖尿病合并免疫低下
建立D半乳糖联合链脲佐菌素诱导免疫衰老(胸腺萎缩)合并糖尿病小鼠模型后，腹腔注射lOnmol/kg 0T23，对照组小鼠注射相同剂量的生理盐水，连续注射20天。糖耐受测定显示，0T23治疗小鼠糖耐受显著比对照组高(图7A)，而且0T23有效逆转体重下降，增加小鼠体重接近正常值(图7B)。处死小鼠，无菌条件下取胸腺，测定胸腺指数，发现0T23有效提高胸腺指数(图7C)，抑制胸腺萎缩;胸腺研磨后，收集细胞悬液，利用实时定量PCR定量分析小鼠胸腺T淋巴细胞及脾脏(外周)T细胞的sjTRECs水平，评价小鼠胸腺生成和输出功能，结果显示注射0T23后，与对照组相比，胸腺和外周的sjTRECs含量均显著上升(图7D)。证实0T23可同时治疗糖尿病并有效回复胸腺功能，提高免疫力。
【主权项】
1.一种PACl-R和GLP-1R的双向激动剂0T23，其氨基酸序列如下所示: His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Gly Arg Lys Lys ArgArg Gln Arg Arg Arg02.权利要求1所述的PACl-R和GLP-1R的双向激动剂0T23在制备与PACl-R和GLP-1R受体相关疾病治疗方面中的应用。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述疾病为糖尿病、代谢失调合并免疫功能低下、或胸腺衰退。
【专利摘要】本发明公开了一种PAC1-R和GLP-1R的双向激动剂OT23及应用。本发明首次将OXM与PACAP高度同源的N端13个氨基酸与有穿膜功能的TAT的C端10个氨基酸融合，人工构建一个由23个氨基酸组成的双向激动剂OT23，其氨基酸序列如下所示：His？Ser？Gln？Gly？Thr？Phe？Thr？Ser？Asp？Tyr？Ser？Lys？Tyr？Gly？Arg？Lys？Lys？Arg？Arg？Gln？Arg？Arg？Arg。本发明的双向激动剂对于糖尿病合并胸腺衰退相关免疫低下或免疫失调有双重治疗效果；可用于糖尿病及（或）代谢失调（如严重消瘦）合并免疫功能低下及（或）胸腺衰退的症状治疗。
【IPC分类】A61P3/10, A61K38/16, A61P37/04, C07K14/00
【公开号】CN105504026
【申请号】CN201510996270
【发明人】张华华, 余榕捷
【申请人】广东医学院
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2015年12月24日