一种信号肽及其在利用魔芋粉产l-谷氨酸重组菌中的应用
【技术领域】
[0001] 利用一种信号肤使重组菌高效分泌特定酶代谢廉价碳源进行氨基酸生产的方法 和高效生产某种蛋白的方法，属于基因工程、蛋白质与酶工程和代谢工程领域。
【背景技术】
[0002] 魔芋粉，主要含魔芋葡甘露聚糖，其来源是非粮食作物魔芋。据相关报道在我国云 南、贵州、四川、湖北和湖南的西部、陕西南部等地均适宜魔芋种植，目前已有一定的规模， 仅湖北省魔芋种植面积就达41万亩。目前魔芋粉主要用于部分食品，其水解低聚糖可作为 功能性食品，应用还不是很广泛。大部分微生物无法直接利用，因此，改造微生物利用魔芋 作为碳源发酵生产高附加值产品具有良好的应用前景。现国内外已有报道，改造酿酒酵母 直接W淀粉为碳源生产乙醇，导入α-淀粉酶基因使谷氨酸棒状杆菌利用可溶性生产k赖氨 酸的相关报道，未见有W魔芋粉底物的相关微生物改造。
[0003] 本研究室已授权的专利(公开号:CN103243128A)所述并保藏的高产k谷氨酸的菌 种天津短杆菌SW07-1，只能W葡萄糖为主要碳源发酵生产k谷氨酸，不能直接利用魔芋粉 作为主要碳源。
[0004] k谷氨酸主要用于生产味精、香料，W及用作代盐剂、营养增补剂和生化试剂等。 通过基因工程和代谢工程技术进一步改造高产k谷氨酸菌种，使其能利用魔芋粉作为碳源 发酵生产心谷氨酸。对简化心谷氨酸生产工艺、节约生产成本有一定的参考应用价值。
【发明内容】
[0005] 本发明通过基因工程技术将去除自身信号肤的β-甘露聚糖基因与来源谷氨酸棒 状杆菌和枯草芽抱杆菌的Sec和化t两个主要分泌途径的十二条信号肤分别融合，替换对比 不同信号肤引导分泌0-甘露聚糖基因在不同k谷氨酸高产菌的效果，得到经密码子优化的 0-甘露聚糖基因信号肤一一Mannase Signal化ptide(MSP)为分泌胞外酶效果较好的一种 新发现信号肤。
[0006] 所述MSP核巧酸序列是SEQ ID NO. 1所示的序列。
[0007] 本发明在已有高产k谷氨酸菌种的基础上，通过基因工程技术不同信号肤引导分 泌β-甘露聚糖基因在构建的不同k谷氨酸高产菌中表达。使其能W魔芋粉和葡萄糖作为混 合碳源进行k谷氨酸发酵。
[000引本发明构建的重组菌天津短杆菌SW07-1/PMS化an优化后化发酵4她心谷氨酸的 产量为65±1.2g/L，发酵液中β-甘露聚糖酶的酶活为1210±4.6U/mLD(碳源添加方式:初始 lOg/L魔芋粉和30g/L葡萄糖，后期分批补加80g/L魔芋粉。）
[0009] 所述的技术方案：
[0010] 1.根据NCBI上公布的相关基因序列设计信号肤和目的基因融合引物。
[0011] 2.重组菌的构建
[0012]从相关菌种中抽提染色体DNA为模板，根据预先设计好的引物、PCR扩增条件和扩 增体系进行PCR。采用凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，琼脂糖核酸凝胶电泳检 验回收产物的浓度。用相同的限制性内切酶相关表达载体和纯化后的PCR产物进行双酶切， 琼脂糖核酸凝胶电泳检测酶切产物并用凝胶回收试剂盒对其回收，并用超微量分光光度计 检测其浓度。将酶切后的载体和PCR产物按一定比例混合，在T4DNA连接酶的作用下过夜连 接。将连接产物用化Cl2转化法转入E.coli BL21，获得含重组质粒的E.coli BL21。提取质 粒，通过单双酶切及PCR验证后用电转化方法将重组质粒导入相关菌种中。最后，将含15% 甘油的重组菌液保存-70°C冰箱。
[0013] 3.重组菌的产酸培养
[0014] 将重组菌接种于新鲜的LB+0.5%Glucose液体培养基中进行活化，接种量为1%。 次日W1 %转接于发酵培养基中（底物为可溶性淀粉和葡萄糖混合），0.8mM IPTG诱导表达， 生长后期收集发酵液利用氨基酸自动分析仪测定其氨基酸含量化-谷氨酸及相关氨基酸 等）。发酵培养基具备微生物生长所需的营养成分，并通过相关优化。
[0015] 4.重组菌的产酶培养
[0016] 将重组菌接种于新鲜的LB+0.5%Glucose液体培养基中进行活化，接种量为1%。 次日W1%转接于发酵培养基中（底物为葡萄糖），〇.8mM IPTG诱导表达，生长后期收集发酵 液测其酶活和蛋白含量。
【具体实施方式】
[0017]实施例1:信号肤引物与β-甘露聚糖酶串联的引物设计
[0018] 根据NCBI上公布的相关基因序列和β-甘露聚糖酶基因序列设计信号肤和基因串 联的大片段引物。
[0019] Pl:pMSPma址indlllF
[0020] 5 '-CCCAAGCTTATGTTCAAGAAGCACACCATCTCCCTGCTGATCATCTTCCTGCTGGCT
[0021] TCCGCTGTTCTGGCTAAGCCAATCGAGGCTCATACTGTGTCGCCTGTGAATC-3 '
[0022] P2:pMSPmanBamHIR
[0023] 5 '-CGCGGATCCTTACTCAACGATTGGCGTTA-3'
[0024] 实施例2:β-甘露聚糖酶基因信号肤替换及其克隆
[00巧][1]从B.subtilis CCTCC Μ 209200提取染色体作为模板DNA。
[0026] [2]根据NCBI网站上公布的β-甘露聚糖酶基因序列设计信号肤和基因串联的PCR 引物。WB.subtilis CCTCC Μ 209200的基因组为模板利用大片段引物PCR，得到带有经密 码优化的核巧酸序列如SEQ ID Ν0:1所示Mannase si即al Ρ邱tide(简称MSP)信号肤的β-甘露聚糖酶基因。PCR扩增体系（5化L):模板化L，上下游引物各0.扣L，dNTP Mix化L，10 X Ex Taq Buffer扣L，灭菌dd肥0 38.扣L，Ex Taq DNA聚合酶0.扣LdPCR反应条件：94°C预变 性，5min，一个循环；94°C变性，30s，56°C退火，30s，72°C延伸，lmin30s，30个循环；72°C， lOmin，一个循环;4°C，10min，一个循环(其中退火溫度和延伸时间根据不同引物和基因进 行相对的调节）。采用凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓 度。回收产物存放在1.5mL的离屯、管中，-20°C冰箱保存备用。
[0027] 实施例3:重组质粒阴MJ19-MSPman的构建
[002引 [1]构建重组质粒pMD18-T-MSPman，导入E.coliJM109。将[2]中PCR回收的产物与 克隆载体pMDlS-T连接，连接体系为solutionis化，目的基因4.祉L，pMD18-T质粒0.化L，16 °0过夜连接。连接接产物转化E.coilJM109,涂布于含lOOug/mL氨节青霉素的LB平板，经37 °0培养过夜，挑取单菌落到含lOOug/mL氨节青霉素的lOmL液体LB培养基中，37°C摇床过夜 培养后提取质粒，命名为pMD18-T-MSPman，经PCR和酶切验证连接成功后，将菌液加入甘油 于-70°C冰箱保藏。
[0029] [2]将[1]中提取的pMD18-T-MS^an质粒与表达载体PXMJ