19分别进行Hindlll与 BamHI的双酶切，利用凝胶回收试剂盒回收后进行连接，获得重组质粒pXMJ19-MSPman。上述 重组质粒都通过PCR和酶切验证。
[0030] 实施例4:重组质粒阴MJ19-MSPman电转化至天津短杆菌SW07-1
[0031] 挑取天津短杆菌SW07-1分别接种于lOmL LB液体培养基摇瓶中，30°C摇床培养过 夜，取1(Κ)化过夜培养的菌液，接种于50mL的感受态培养基中，30°C摇床培养地至0D562nm = 0.9左右，用无菌管离屯、去上清，再用10 %的甘油悬浮菌体并离屯、，重复此步骤3次。最后分 装于1.5血的离屯、管，加入3uL重组质粒，于电压1800V，50mS条件下电转化。迅速向将电转化 完成的菌体中加入800uL的新鲜LBG培养基(0.5 %酵母提取物，1 %蛋白腺，1 %化C1，0.5 % 葡萄糖），并放置46°C的水浴锅中静置6min，之后在30°C摇床培养化左右，离屯、涂布于含氯 霉素抗性的平板。在30°C的恒溫培养箱培养6地，挑取菌落形态正常的单克隆并进行培养。 将培养后的单克隆进行质粒提取，酶切验证和PCR验证，得到阳性的重组菌株，并保藏于-70 °C冰箱。
[0032] 实施例5:重组天津短杆菌SW07-l/pMSPman分泌的β-甘露聚糖酶酶活测定
[0033] 在试管中加入2. OmL 5. Og/L刺槐豆胶底物溶液，65°C预热lOmin，加入2. OmL经过 适当稀释的粗酶液，65°C精确反应15min。立即加入5. OmL DNS试剂，振荡摇匀，沸水浴中放 置lOmin，置于冰水中冷却，然后加水补齐至10.0 mL并摇匀。空白对照W2.0血水代替适当稀 释的粗酶液，540nm处测定吸光值。结合甘露糖标准曲线计算酶活力。酶活力单位定义:在上 述测定条件下，W每Imin产生?μL?ο?还原糖的酶量定义为1个β-甘露聚糖酶活力单位化）。
[0034] 实施例6:重组天津短杆菌SW07-l/pMSPman的发酵培养基
[0(X3日]将重组天津短杆菌SW07-1/PMS化an种子液接种至魔芋粉培养基，在30°C，500r/ min培养条件下进行发酵培养，培养4她后心谷氨酸的产量为65±1.2g/L，发酵液中β-甘露 聚糖酶的酶活为1210 ± 4.抓/mL。
[0036] 魔芋粉粉培养基(g/L):
[0037] 初始培养基中含有魔芋粉10,葡萄糖30,玉米浆3，（NH4)2S04 20，K2HP04 1.5， MgS04·7出0 0.8，FeS04·7出0 0.02，MnS04·此0 0.02，尿素5.5g/L，维生素 B1 200ug/レPH 7.0~7.2;发酵12h后开始分批补加魔芋粉总补加量为80g/L。
[003引对照组：
[0039] (1)采用实施例1-6类似的方法，仅仅是将核巧酸序列如SEQ ID NO: 1的信号肤，替 换成β-甘露聚糖酶基因自身原有的信号肤(核巧酸序列如SEQ ID N0:2所示），发酵显示:L-谷氨酸的产量为43 ± 3.2g/L，发酵液中β-甘露聚糖酶的酶活为867 ± 7.8U/mL
[0040] (2)采用实施例1-6类似的方法，仅仅是将核巧酸序列如SEQ ID NO: 1的信号肤，替 换成如：谷氨酸棒状杆菌来源的表层蛋白信号肤P S (核巧酸序列为 ATGTTTAACAACCGTATCCGCACTGCAGCTCTCGCTGGTGCAATCGCAATCTCCACCGCAGCTTCTGGCGTAGCTAT CCCAGCATTCGCTCAGGAGACCACT)或者是枯草芽抱杆菌来源的α-淀粉酶信号肤AE(核巧酸序列 为 ATGTTTGCAAAACGATTCAAAACCTCTTTACTGCCGTTATTCGCTGGATTTTTATTGCTGTTTCATTTGGTTCTGGC AGGACCG)，发酵显示:k谷氨酸的产量分别为30±1.2g/L和25±2.4g/L，发酵液中β-甘露聚 糖酶的酶活分别为680 ± 3.抓/mL和578 ± 5.7U/mL。
[0041 ] 实施例7:重组天津短杆菌SW07-l/pMSPman发酵k谷氨酸测定。
[0042] 发酵液中的k谷氨酸含量通过生物传感仪初测，之后再通过氨基酸分析仪精确测 定。
[0043] 虽然本发明已W较佳实施例（WMSP信号肤和天津短杆菌SW07-1为例）公开如上， 但其并非用W限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做 各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该W权利要求书所界定的为准。
【主权项】
1. 一种提高微生物利用魔芋粉合成产物的方法，其特征在于，所述方法是将信号肽与 β-甘露聚糖酶基因融合，然后将融合片段连接到表达载体上并转化到宿主微生物内得到重 组微生物，利用重组微生物在以魔芋粉为主要碳源的培养基中发酵生产产物； 所述信号肽的核苷酸序列是(a)~(d)中任意一项： (a) SEQ ID N0:1所示的序列， (b) 包含SEQ ID N0:1所示的碱基序列、并且具有信号肽活性的DNA， (c) 包含在SEQ ID NO: 1所示的碱基序列中缺失、取代或添加至少1个碱基所得的碱基 序列、 并且具有信号肽活性的DNA， (d) 与SEQ ID NO: 1所示的碱基序列在严紧条件下杂交、并且具有信号肽活性/来源于 枯草芽 孢杆菌属细菌的DNA。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述β_甘露聚糖酶基因来源于枯草芽孢杆 菌属，但不限于枯草芽孢杆菌属。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述产物为L-谷氨酸。4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微生物为天津短杆菌，但不限于天津 短杆菌属。5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述表达载体为PXMJ19，但不限于pXMJ19。6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养基中初始含有10g/L魔芋粉和 30g/L葡萄糖，在发酵后期通过分批补料方法补加80g/L魔芋粉。7. -种重组天津短杆菌，其特征在于，所述重组天津短杆菌表达与SEQ ID NO: 1的信号 肽融合的β-甘露聚糖酶基因；所述信号肽与β-甘露聚糖酶基因融合后，连接到表达载体上 并转化到宿主菌内。
【专利摘要】一种信号肽及其在利用魔芋粉产L-谷氨酸重组菌中的应用，属于基因工程和酶工程领域。本发明通过分子克隆技术和基因工程技术将经筛选和密码子优化后的信号肽即SEQ？ID？N0.1与来源B.subtilis？CCTCC？M？209200的β-甘露聚糖酶融合构建表达载体，在高产L-谷氨酸的菌种中表达。首次报道，以该信号肽介导分泌β-甘露聚糖酶的重组菌天津短杆菌SW07-1/pMSPman能利用廉价魔芋粉发酵生产L-谷氨酸，最优碳源添加条件下5L发酵罐上产量为65g/L。
【IPC分类】C12N1/21, C12N15/77, C12P13/14, C12N15/31, C12N15/56, C12R1/13
【公开号】CN105505977
【申请号】CN201510817025
【发明人】饶志明, 郑俊贤, 徐美娟, 杨套伟, 张显
【申请人】江南大学
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2015年11月23日