一种利用聚乙烯亚胺提高dna连接酶连接效率的方法
【专利说明】-种利用聚乙稀亚胺提高DNA连接酶连接效率的方法 【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，设及一种利用电正性高分子聚合物聚乙締亚胺 (Polyethylenimine，阳I)提高T4DNA连接酶连接效率的方法。 【【背景技术】】
[0002] 体外DNA重组技术是指在体外将来源相同或不相同的两个或多个DNA片段连接成 新的重组DNA分子，并转化到受体菌中进行自主复制，最后筛选鉴定正确的克隆的过程。该 技术是基因工程中的基本技术。
[0003] 体外DNA重组技术的基本程序包括：外源目的DNA片段的获取，载体的选择，连接， 转化和克隆化。其中连接一步是获得重组体DNA的关键环节。连接最常用的方法是在DNA连 接酶的作用下，有Mgh、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经相同的限制酶酶切的载体分子 和外源DNA分子进行连接。其中，DNA连接酶(ligase)的作用是催化DNA片段之间的5'憐酸基 和3'径基之间形成3'5'-憐酸二醋键，主要用于连接两个独立的DNA片段或修复双链DNA中 一条链上的切口。目前常用的DNA连接酶有两种：Τ4隧菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接 酶。运两种DNA连接酶都有将两个带有互补粘性末端的DNA分子连接在一起的功能，但Τ4隧 菌体DNA连接酶还拥有一种大肠杆菌连接酶没有的特性，即能将两个平末端的双链DNA分子 连接起来，因而得到了更为广泛的应用。然而在使用Τ4隧菌体DNA连接酶的过程中，仍然存 在连接效率不高的问题，尤其是当连接的DNA片段太长或欲连接的载体分子和外源DNA片段 的浓度比偏高或偏低时。
[0004] 目前，有一种通过增加 T4DNA连接酶浓度或增加 DNA浓度来提高连接效率的方法， 但该方法的促进效果不是特别明显，而且不够经济。Pheiffer和Zimmerman等人提出在连接 反应体系中加入可促进大分子群聚作用的多聚物来提高连接效率，诸如聚乙二醇 (polyethylene glycol,PEG),聚薦糖化icoll),牛血浆白蛋白（bovine plasma a化umin) 或糖原（glycogen) ;Rusche和Howard-Flanders将化合物氯化六氨合钻化examine cobalt chloride，HCC)加入连接反应中，同样也起到了促进T4DNA连接酶连接效率的作用。然而运 些增效剂均是电中性的。迄今为止国内外还没有关于利用电正性高分子聚合物来有效提高 T4DNA连接酶连接效率的报道。 【
【发明内容】
】
[0005] 本发明要解决的技术问题，在于提供一种利用聚乙締亚胺提高T4DNA连接酶连接 效率的方法，其可W显著地提高T4DNA连接酶的连接效率，且操作简单，成本低。
[0006] 本发明是运样实现的：
[0007] -种利用聚乙締亚胺提高T4DNA连接酶连接效率的方法，包括W下步骤：
[0008] 步骤(1)对目的DNA片段设计带有酶切位点的引物；
[0009] 步骤(2)通过PCR反应获得两端带有酶切位点的目的DNA片段；
[0010]步骤(3)经酶切得到待连接的线性化载体和目的DNA片段；
[0011] 步骤(4)配置聚乙締亚胺溶液备用；
[0012] 步骤(5)在连接体系中添加预设体积的聚乙締亚胺溶液进行连接反应；
[0013] 步骤(6)在大肠杆菌中进行转化和克隆，得到重组DNA分子的克隆。
[0014] 进一步地，所述步骤(4)中的聚乙締亚胺溶液的浓度为5X10-7(w/v)~5X10-8(w/ V)。
[001引进一步地，所述步骤(5)中反应条件是将待连的DNA片段、T4DNA连接酶、聚乙締亚 胺溶液、T4DNA 1 igase bufferW及适量dd此0混合成20ul体系，22°C化，65°ClOmin，4°CW 进行连接。
[0016] 进一步地，所述步骤(5)中，连接体系中加入的聚乙締亚胺溶液加入的量为0.加1。
[0017] 进一步地，所述步骤(6)使用化21 (DE3)感受态细胞进行转化。
[0018] 本发明具有如下优点：
[0019] 本发明中使用的聚乙締亚胺(Polyethylenimine,阳I)是电正性高分子聚合物，可 W通过静电作用将分散在连接体系中的载体分子和外源DNA片段聚集起来，提高了两者的 相对浓度，增加了二者间的连接几率，在很大程度上解决了 T4DNA连接酶连接效率低的问 题;另外本发明方法操作简单，成本低，经济适用性高。本发明可W显著地提高T4DNA连接酶 的连接效率，填补了有关利用电正性高分子聚合物(聚乙締亚胺)来提高T4DNA连接酶连接 效率的方法和应用领域的空白。 【【附图说明】】
[0020] 下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的说明。
[0021] 图1是本发明实施例一片段A的电泳检测图。
[0022] 图2是本发明实施例二双酶切后片段A及双酶切后质粒PET2化电泳检测图。
[0023] 图3是本发明实施例Ξ不同浓度PEI对T4连接酶连接效率影响效果图。 【【具体实施方式】】
[0024] 本发明所设及的一种利用聚乙締亚胺提高T4DNA连接酶连接效率的方法，包括W 下步骤：
[0025] 步骤(1)对目的DNA片段设计带有酶切位点的引物；
[0026] 步骤(2)通过PCR反应获得两端带有酶切位点的目的DNA片段；
[0027] 步骤(3)经酶切得到待连接的线性化载体和目的DNA片段；
[00%]步骤(4)配置聚乙締亚胺溶液备用；
[0029] 步骤(5)在连接体系中添加预设体积的聚乙締亚胺溶液进行连接反应；
[0030] 步骤(6)在大肠杆菌中进行转化和克隆，得到重组DNA分子的克隆。
[00川进一步地，所述步骤(4)中的聚乙締亚胺溶液的浓度为5X10-7(w/v)~5X10-8(w/ V)。
[0032] 所述步骤（5)中反应条件是将待连的DNA片段、T4DNA连接酶、聚乙締亚胺溶液、 T4DNAligasebuffe;rW及适量dd此0混合成20ul体系，22°C化，65°C10min，4°Coo进行连 接。
[0033] 所述步骤(5)中，连接体系中加入的聚乙締亚胺溶液加入的量为0.加1。
[0034] 所述步骤(6)使用化21 (DE3)感受态细胞进行转化。
[0035] 请参阅图1~3所示，对本发明的实施例进行详细的说明。
[0036] 实施例一 DNA目的片段准备(片段A)
[0037] 1.PCR体系（lOOul体系）如下 [00；3 引
[0039] 引物 1 序列：gtgaattcgagctcggtacccggaattcTTAGTTTACCGCGTCTT。
[004