0] 引物 2序列：Tgcaggtcgactc1:agaggatccatatgAATAAATCTCAATTGATCG。
[0041 ] 其中：gaattc为EcoRI酶切位点，化化tg为Ndel酶切位点。
[0042] 2.按 W 下条件进行 PCR 反应:95°Clmin; 95°C30s，57°C30s，72°C30s，34 个循环；72 °C5min;4°C〇〇。
[0043] 3.使用胶回收试剂盒对片段A进行回收纯化。胶回收产物检测：取3ul胶回收产物 W1%琼脂糖凝胶为电泳支持介质，在1XTAE和90V电压下电泳30min，用紫外透射仪观察， 具体电泳结果见图1。
[0044] 图1中Μ为lOObp DNA Ladder Maker。片段A为引入EcoRI/Ndel双酶切位点的目的 片段，符合实际大小。
[0045] 上述片段A为大肠杆菌化scherichia coli)中所提取。
[0046] 实施例二双酶切片段A和阳T22b质粒
[0047] INdel 酶切
[004引 l.lNdel酶切片段A体系
[0049]
[0053] ~1.2按照 W下程序进行酶切反应:37°C化30min，65°C5min，4°C w . '
[0054] 1.3使用快速纯化回收试剂盒回收一次酶切产物。
[0化5] 沈coRI酶切
[0化6] 2.化coRI酶切片段A体系
[0化7]
[0060] 2.2酶切程序如下：37°(3化3〇111111，65°05111111，4°(3^。
[0061] 2.3 1%琼脂糖凝胶进行电泳检测
[0062] 2.4使用胶回收试剂盒对双酶切后的片段AW及PET2化质粒进行回收纯化。胶回收 产物检测:取3ul胶回收产物W1%琼脂糖凝胶为电泳支持介质，在1XTAE和90V电压下电泳 30min，用紫外透射仪观察，具体电泳结果见图2。
[0063] 图2中Ml为lOObp DNA Ladder Maker,片段A为经过EcoRI/Ndel双酶切后的回收片 段，符合实际大小，M2为化b DNA Ladder Maker,阳T22b为经过EcoRI/Ndel双酶切后的回收 片段。
[0064] 实施例3连接体系中加入不同浓度聚乙締亚胺并转化 [00化]lT4Sticky-end Ligation
[0066] 1.1在Τ4连接酶体系（20ul)中分别加入不同浓度阳I0.5ul。
[0067]
[006引 1.2 连接程序如下：22°C 化，65°C10min，4°Cw。
[0069] 2转化:分别取lOul连接液加入lOOul BL2UDE3)感受态细胞，冰浴30min，42°C水 浴75s，冰浴5min，随后置于超净台内加入300ulS0C培养基，37°C、225巧m摇菌化，取150ul菌 液涂布加入amp的平板，37°C过夜培养。
[0070] 实验结果如图3所示，其中3-1:对照(不加 PEI的T4连接酶连接反应液)的菌落生长 情况;3-2:加入0.加1 5X1〇-7m PEI的菌落生长情况。3-3:加入0.加11〇-8m PEI的菌落生长 情况。3-4:加入0.加1 5X1〇-8m PEI的菌落生长情况。
[0071] 结果显示，加入浓度5X1〇-7(w/v)~5X1〇-8(w/v)PEI的连接液转化后平板内菌落 生长数量明显多于不加 PEI的对照组。
[0072] 综上，在使用中T4连接酶构建重组质粒的过程中，加入适当浓度的聚乙締亚胺可 W显著提高T4连接酶的连接效率，获得更多的重组子。本技术操作简单，且聚乙締亚胺价格 低廉，可W有效解决现有T4DNA连接酶连接效率低的问题。
[0073] 本发明中所设及的大肠杆菌化scherichia coli)中的IHF-β蛋白基因序列如SEQ ID NO: 1所示，引物1序列如SEQ ID NO:2所示，引物2序列如SEQ ID NO:3所示，具体情况参 见序列表。
[0074] 虽然W上描述了本发明的【具体实施方式】，但是熟悉本技术领域的技术人员应当理 解，我们所描述的具体的实施例只是说明性的，而不是用于对本发明的范围的限定，熟悉本 领域的技术人员在依照本发明的精神所作的等效的修饰W及变化，都应当涵盖在本发明的 权利要求所保护的范围内。
【主权项】
1. 一种利用聚乙烯亚胺提高T4DNA连接酶连接效率的方法，其特征在于：包括以下步 骤： 步骤(1)对目的DNA片段设计带有酶切位点的引物； 步骤(2)通过PCR反应获得两端带有酶切位点的目的DNA片段； 步骤(3)经酶切得到待连接的线性化载体和目的DNA片段； 步骤(4)配置聚乙烯亚胺溶液备用； 步骤(5)在连接体系中添加预设体积的聚乙烯亚胺溶液进行连接反应； 步骤(6)在大肠杆菌中进行转化和克隆，得到重组DNA分子的克隆。2. 根据权利要求1所述的一种利用聚乙烯亚胺提高DNA连接酶连接效率的方法，其特征 在于:所述步骤⑷中的聚乙稀亚胺溶液的浓度为5 X 1 0-7 (w/v)~5 X 1 0-8 (w/v)。3. 根据权利要求2所述的一种利用聚乙烯亚胺提高DNA连接酶连接效率的方法，其特征 在于:所述步骤(5)中反应条件是将待连的DNA片段、T4DNA连接酶、聚乙烯亚胺溶液、T4DNA ligase buffer以及适量ddH2〇混合成20ul体系，22°〇111，65°(^1〇111；[11，4°(^00进行连接。4. 根据权利要求2或3所述的一种利用聚乙烯亚胺提高DNA连接酶连接效率的方法，其 特征在于:所述步骤(5)中，连接体系中加入的聚乙烯亚胺溶液加入的量为0.5ul。5. 根据权利要求1所述的一种利用聚乙烯亚胺提高DNA连接酶连接效率的方法，其特征 在于:所述步骤(6)使用BL21 (DE3)感受态细胞进行转化。
【专利摘要】本发明提供一种利用聚乙烯亚胺提高T4DNA连接酶连接效率的方法，包括以下步骤：对目的DNA片段设计带有酶切位点的引物；通过PCR反应获得两端带有酶切位点的目的DNA片段；经酶切得到待连接的线性化载体和目的DNA片段；配置聚乙烯亚胺溶液备用；在连接体系中添加预设体积的聚乙烯亚胺溶液进行连接反应；在大肠杆菌中进行转化和克隆，得到重组DNA分子的克隆。本发明可以显著地提高T4DNA连接酶的连接效率，填补了将电正性高分子聚合物(聚乙烯亚胺)应用于提高T4DNA连接酶连接效率这一领域的空白。
【IPC分类】C12N15/66, C12N15/70
【公开号】CN105505972
【申请号】CN201610040618
【发明人】戚智青, 刘楠辛, 侯丹
【申请人】华侨大学
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2016年1月21日