一种提高大肠杆菌生产丁醇的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物技术领域，尤其设及一种提高大肠杆菌生产下醇的方法。
【背景技术】
[0002] 下醇是一种重要的化学品，可直接用作有机溶剂和合成多种醋类化合物的前体， 同时它也是一种比乙醇更有优势的生物燃料。生物下醇可由一些梭菌菌株在厌氧条件下经 过ABE(Acetone-Bu化nol-化hanol)发酵产生，至今已有超过一百年的历史。但是由于梭菌 菌株本身是严格厌氧的革兰氏阳性细菌，遗传操作困难，并且由于本身复杂的代谢调控机 审IJ，因此很难提升梭菌发酵生产下醇的能力，从而限制了生物下醇市场竞争力。借助于现代 生物技术，科学家开始利用易于操作的模式细菌大肠杆菌来生产下醇，取得了显著的进展。
[0003] 2008年，Shota Atsumi , James C丄iao等首先在大肠杆菌中实现了下醇的合成 (Atsumi S,Cann A F,Connor M R,et al.Metabolic engineering of Escherichia coli for 1-butanol production.Metabolic engineering,2008,10(6):305-311.),该研究组 将丙酬下醇梭菌体内的下醇合成途径转移至大肠杆菌内，致使其可产生少量下醇。在随后 的几年里，大量的相关工作逐渐开展和发表，目前报道最高的大肠杆菌下醇产量是14-15g/ L，接近了梭菌产量，但是与梭菌相比较并没有表现出充分的优势，还远未达到有市场竞争 力的产业化水平，仍需要更多的改进，比如产量、产率、底物利用等。因此还需要更进一步的 菌株改造，提高下醇生产性能，运就需要寻找新的有效改造祀点。
【发明内容】
[0004] 本发明一个目的是提供了一种构建重组菌的方法。
[0005] 本发明提供的方法，为抑制或沉默生产下醇的出发菌基因组上的苹果酸脱氨酶基 因 m化表达，得到重组菌。
[0006] 上述方法中，上述抑制或沉默生产下醇的出发菌基因组上的苹果酸脱氨酶基因 m化表达为敲除生产下醇的出发菌基因组上的苹果酸脱氨酶基因111化。
[0007] 上述方法中，上述敲除生产下醇的出发菌基因组上的苹果酸脱氨酶基因 m化采用 入-r ed同源重组系统、sacB基因介导筛选的同源重组系统或CRISPR/化S系统。
[000引上述方法中，上述敲除生产下醇的出发菌基因组上的苹果酸脱氨酶基因 m化为采 用λ-red同源重组系统将生产下醇的出发菌基因组上的苹果酸脱氨酶基因 m化替换为两端 带有FRT的标记基因。
[0009] 上述方法中，所述标记基因为卡那霉素抗性基因；
[0010] 所述两端带有FRT的标记基因片段的核巧酸序列为序列表中序列2第41-1534位。
[0011] 上述方法中，所述生产下醇的出发菌为大肠杆菌，所述大肠杆菌为将丙酬下醇梭 菌体内的下醇合成途径转移至出发大肠杆菌得到的菌；
[0012] 所述大肠杆菌具体为邸205CGMCC No.11985;
[0013] 所述出发大肠杆菌为BW25113。
[0014] 上述方法中，所述苹果酸脱氨酶的氨基酸序列为序列3;
[0015] 所述苹果酸脱氨酶m化基因的核巧酸序列具体为序列1。
[0016] 上述方法中，所述将生产下醇的出发菌基因组上的苹果酸脱氨酶基因 mdh替换为 两端带有FRT的标记基因的方法包括如下步骤:将含有两端带有FRT的卡那霉素抗性基因的 同源重组DNA片段导入邸205(地D46)，得到重组菌；
[0017] 所述邸205(地046)为将质粒导入邸205〔610：齡.11985中得到的菌；
[0018] 所述含有两端带有FRT的卡那霉素抗性基因的同源重组DNA片段包括m化基因上游 同源臂、上游FRT、卡那霉素抗性基因、下游FRT和m化基因下游同源臂；
[0019] 所述含有两端带有FRT的卡那霉素抗性基因的同源重组DNA片段的核巧酸序列具 体为序列2。
[0020] 由上述方法制备的重组菌也是本发明保护的范围。
[0021] 上述方法或上述重组菌在生产下醇或提高下醇产量中的应用也是本发明保护的 范围。
[0022] 本发明另一个目的是提供一种生产下醇的方法。
[0023] 本发明提供的方法，包括如下步骤:发酵上述重组菌，得到下醇。
[0024] 大肠杆菌邸205菌已于2016年1月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普 通微生物中屯、(简称CGMCC，地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究 所，邮编100101 )，保藏号为CGMCC No. 11985，分类命名为大肠埃希氏菌Escherichia coli。
[0025] 本发明的实验证明，本发明中可促进大肠杆菌生产下醇的改造祀点为苹果酸脱氨 酶基因（Genbank:NC_000913.3序列中的中的m化基因化3236))，通过λ-red同源重组系统敲 除技术，在一株产下醇的大肠杆菌工程菌株中敲除mdh基因，下醇产量可提高283%，得率可 提高89 %。
【附图说明】
[0026] 图1为邸205体内的下醇生产途径。
[0027] 图2为PCR扩增含有m化基因同源片段的卡那霉素抗性基因操纵子的DNA片段。
[002引图3为m化基因敲除突变体的PCR验证。
[00巧]图4为邸205AnKlh::kan发酵液使用高效液相色谱化PLC)分析的结果示意图。
【具体实施方式】
[0030] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0031] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0032] 下述实施例大肠杆菌为将丙酬下醇梭菌体内的下醇合成途径转移至BW25113得到 的菌，具体为邸205CGMCC No.11985。
[0033] 大肠杆菌邸205菌已于2016年1月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普 通微生物中屯、(简称CGMCC，地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究 所，邮编100101 )，保藏号为CGMCC No. 11985，分类命名为大肠埃希氏菌Escherichia coli。
[0034] 实施例1、敲除大肠杆菌邸205中m化基因制备重组菌
[0035] 下面的实施例用的是λ-red同源重组系统进行敲除m化基因，其中设及的质粒：
[0036] 地D4记载在如下文献中：Datsenko,Kirill A. ,and BariT L.Wanner.One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12using PCR products.Proceedings of the National Academy of Sciences 97.12(2000):6640-6645；
[0037] p邸46记载在如下文献中：Datsenko,Kirill A. ,and BariT L.Wanner.One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12using PCR products.Proceedings of the National Academy of Sciences 97.12(2000):6640-6645；
[0038] ndh基因的核巧酸序列为序列表中序列1，其编码的蛋白苹果酸脱氨酶的氨基酸序 列为序列表中序列3。
[0039] 1、重组菌邸205(地D46)的制备
[0040] EB205感受态细胞：在Ξ角瓶中培养至对数生长中期的200ml EB205菌液，冰浴 30111；[]1。4°(3,3000旨离屯、51]1；[]1。弃掉上清液，用预冷的无菌10%甘油重悬菌体，洗涂两次。最后 加入1ml预冷的10%甘油重悬菌体，5化1每管分装至预冷的1.5ml无菌离屯、管中备用，得到 EB205感受态细胞。
[0041 ] 邸205(地D46)重组菌：取化1 P邸46与上述邸205感受态细胞混合，冰浴5min，将混 合物转移至2mm电击杯内进行转化，电击转化参数为：电压2.化ν，25μΡ，电阻200 Ω。典型电 击持续时间为5