ms。电转化完毕后，立即将菌液转至1ml LB培养基中，复壮比，涂布于含10化 g/ml氨节青霉素的LB平板上，30°C好氧培养12h，得到邸205(地D46)重组菌。
[0042] EB205(p邸46)感受态细胞:将上述涂布的平板上长出的邸205(p邸46)重组菌菌落 转接至含10化g/ml氨节青霉素的液体LB中，30°C培养至OD600值约为0.2时，加入终浓度为 lOmmol/1的阿拉伯糖进行诱导表达2小时，制备得到邸205(地D46)感受态细胞。
[0043] 图1为邸205体内的下醇生产途径。
[0044] 2、敲除m化的重组菌邸205Δπκ11ι: :kan
[0045] 1)、111化同源重组片段的制备
[0046] 使用pKD4为模板，用1032-mdh-KoF和1032-mdh-KoR引物进行PCR扩增，得到约 1.6化的PCR扩增产物（图2)，为m化同源重组片段，经过测序，m化同源重组片段的核巧酸序 列为序列表中序列2。
[0047] m化同源重组片段包括m化基因上游同源臂、上游FRT、卡那霉素抗性基因、下游FRT 和ndh基因下游同源臂；其中，m化基因上游同源臂为序列2第1-40位、上游FRT为序列2第59-106位、卡那霉素抗性基因为序列2第468-1262位、下游FRT为序列2第1453-1498位和m化基 因下游同源臂为序列2第1535-1574位。
[0048] 1032-nKlh-KoF:
[0049] AAAACCCAACTGCCTTCAGGTTCAGAACTCTCTCTGTATGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC，
[0050] 1033-nKlh-KoR:
[0051 ] CGTTTTTACCCAGCAGCAGCGGTTGAGAGAAGAAACGGGCTGGGAATTAGCCATGGTCC，
[0052]上述引物序列中下划线部分是m化基因的同源片段，其它部分是来自地D4模版的 序列。
[0化3] 上述PCR使用的DNA聚合酶为TAKARA PrimeSTAR服高保真酶，上述PCR程序如表1:
[0化4] 表1为PCR程序
[0化5]
[0056] 2)、通过同源重组敲除ndh
[0化7] 将化1上述1)制备的πκ?ι同源重组片段与上述1制备的邸205(地D46)感受态细胞混 合，按照上述1中的电击转化方法进行转化，30°C复壮1.化，涂布于含50μg/ml卡那霉素的LB 平板上，37°C培养2地，得到重组菌。
[0化引将重组菌作为模板，用引物1034-111化-1和1034-111化-2进行PCR扩增。W邸205为对 照。
[0059] l〇：M-mdh-l:ATGAAAGTCGCAGTCCTCGGCGCTGCTGGC;
[0060] 1035-mdh-2:GTTCTGTTCAAATGCGCTCAGGGTACCGAT，
[0061 ] 将上述PCR产物电泳检测，结果如图3,得到约1.化b片段的重组菌为阳性重组菌， EB205得到约0.8化片段。
[0062] 该阳性重组菌命名为邸205Δπκ?: :kan，该菌为将邸205基因组上的ΠΚ比替换为两 端带有FRT的卡那霉素抗性基因片段(序列2第41-1534位)的重组菌。
[0063] 实施例2、重组菌邸205Δπκ?ι: :kan的发酵
[0064] 将实施例1得到的重组菌邸205AnKlh::kan和对照菌株邸205用灭菌的牙签接种到 15ml容量的离屯、管中的10ml M9Y培养基中，利用牙签接种后置于37°C恒溫培养箱中静置发 酵2天，得到发酵液。实验重复Ξ次。
[00化]上述M9Y培养基由 17.1g/l 化2册〇4 · 12出0、3.0g/l K出P〇4、0.5g/l NaCl、2.5g/l NH4Cl、2g/l Yeast Extract、22g/1 C6Hi2〇6 ·出0、2mM MgS〇4 · 7出0、0.1mM CaCl2和水组成。
[0066] 取上述发酵液离屯、后的上清液经孔径大小为0.22WI1的过滤器过滤后进行高效液 相色谱分析，分析采用Agilent 1260液相色谱仪，示差折光检测器，BioRad Aminex HPX-87H有机酸柱，柱溫15°C，流动相为5mm〇Vl硫酸水溶液，流速0.5ml/min，进样量10μ1。
[0067] 标准品葡萄糖和下醇保留时间分别为10.2min和39.8min左右，发酵液上清液中有 保留时间10.2min和39.8min左右的峰值，因此上清液中含有葡萄糖和下醇。
[0068] 根据标准物质浓度与峰面积的实际关系，确定的计算公式为：
[0069] 葡萄糖浓度的计算公式:7 = 194111义，护=0.9999，其中义表示葡萄糖浓度^/1)，7 表示实际峰面积；
[0070] 下醇浓度的计算公式^ = 138232义，护=0.9998，其中义表示下醇浓度(邑/1)，7表示 实际峰面积。
[0071] 计算菌株的下醇产量结果如下表2和图4所示，发酵液上清液中含有葡萄糖和下 醇，与未敲除nKlh基因的邸205相比，敲除111化基因重组菌邸205Δπκ11ι:: kan的下醇产量提高 了283%，得率(下醇产量/葡萄糖消耗量)提高了89%，证明在大肠杆菌中敲除m化基因有利 于下醇的生产。
[0072] 表2敲除mdh基因后对下醇产量的影响
[0075] 上述葡萄糖消耗量=M9Y培养基中葡萄糖浓度-发酵液的上清液中葡萄糖浓度。
[0073]
[0074]
【主权项】
1. 一种构建重组菌的方法，为抑制或沉默生产丁醇的出发菌基因组上的苹果酸脱氢酶 基因 mdh表达，得到重组菌。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述抑制或沉默生产丁醇的出发菌基因组 上的苹果酸脱氢酶基因 mdh表达为敲除生产丁醇的出发菌基因组上的苹果酸脱氢酶基因 mdh〇3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于:所述敲除生产丁醇的出发菌基因组上的苹 果酸脱氢酶基因 mdh采用λ-red同源重组系统、sacB基因介导筛选的同源重组系统或 CRISPR/Cas 系统。4. 根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于:所述敲除生产丁醇的出发菌基因组上 的苹果酸脱氢酶基因 mdh为采用λ-red同源重组系统将生产丁醇的出发菌基因组上的苹果 酸脱氢酶基因 mdh替换为两端带有FRT的标记基因。5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于:所述标记基因为卡那霉素抗性基因； 所述两端带有FRT的标记基因片段的核苷酸序列为序列表中序列2第41-1534位。6. 根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于： 所述生产丁醇的出发菌为大肠杆菌，所述大肠杆菌为将丙酮丁醇梭菌体内的丁醇合成 途径转移至出发大肠杆菌得到的菌； 所述大肠杆菌具体为EB205 CGMCC No. 11985; 所述出发大肠杆菌为BW25113。7. 根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于： 所述苹果酸脱氢酶的氨基酸序列为序列3; 所述苹果酸脱氢酶mdh基因的核苷酸序列具体为序列1。8. 由权利要求1-7中任一所述方法制备的重组菌。9. 权利要求1-7中任一所述方法或权利要求8所述重组菌在生产丁醇或提高丁醇产量 中的应用。10. -种生产丁醇的方法，发酵权利要求8所述重组菌，得到丁醇。
【专利摘要】本发明公开了一种提高大肠杆菌生产丁醇的方法。本发明提供了一种构建重组菌的方法，为抑制或沉默生产丁醇的出发菌的基因组上的苹果酸脱氢酶基因mdh表达，得到重组菌。本发明的实验证明，本发明中可促进大肠杆菌生产丁醇的改造靶点为苹果酸脱氢酶基因(Genbank：NC_000913.3序列中的中的mdh基因(b3236))。通过λ-red同源重组系统敲除技术，在一株产丁醇的大肠杆菌工程菌株敲除mdh基因后，丁醇产量可提高283％，得率可提高89％。CGMCC No.1198520160111
【IPC分类】C12N1/21, C12N15/70, C12P7/16, C12R1/19
【公开号】CN105505971
【申请号】CN201610035150
【发明人】董红军, 赵春华, 张延平, 李寅
【申请人】中国科学院微生物研究所
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2016年1月19日