一种实现大肠杆菌基因无痕同源重组的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物化工领域，特别设及一种基于Lac阻遏系统和抗性筛选实现大肠杆菌 基因无痕同源重组的方法。
【背景技术】
[0002] 大肠杆菌具有基因操作相对简单、生长快、发酵成本低等优点，是目前基因工程中 最常用的模式菌株之一。对大肠杆菌基因组进行基因的突变、删除、插入或替换等操作是大 肠杆菌代谢工程的核屯、技术。Red同源重组技术是一种可在染色体水平上进行遗传操作的 基因打祀技术，具有同源序列短、使用范围广和操作策略灵活等特点，是目前在大肠杆菌中 最常用到的同源重组技术。但利用传统的Red同源重组技术对大肠杆菌的基因组进行编辑 后会留下抗性筛选基因序列，即使此序列中的抗性基因可W利用质粒PCP20所表达的化P重 组酶来消除，但最终还是会在基因组上残留FRT位点序列。此类同源重组后残留的位点序列 会对后续的基因同源重组操作的准确性和重组效率产生严重的负面影响。
[0003] Lac操纵子是大肠杆菌中参与乳糖分解的一个基因群，由乳糖系统的阻遏物和操 纵序列组成，使得一组与乳糖代谢相关的基因受到同步的调控。Lac操纵序列包含了lac P 启动子序列和紧随的操纵序列lac 0,当菌体中含有laci阻遏物基因所表达的阻遏物时，该 阻遏物会结合到lac 0上从而关闭lac P启动子。本专利首先将构建的由lac操纵序列启动 的抗性基因 A操纵子，将其同源重组替换大肠杆菌染色体上的野生型lacI基因及其启动子， 再用正筛选标记抗性基因 B与负筛选标记lacI阻遏物基因反向连接构成的无痕重组工具基 因串同源替换基因组上的祀位点序列，利用此工具基因串上laci基因所表达的阻遏物抑制 抗性基因 A的表达，最后用目标DNA片段同源替换此工具基因串W激活抗性基因 A的表达，实 现利用抗性I筛选得到重组成功的无痕同源重组子的目标。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于克服现有技术的缺点和不足，提供一种基于Lac阻遏系统和抗 性筛选实现大肠杆菌基因无痕同源重组的方法。
[0005] 本发明的目的是通过W下技术方案实现的：一种实现大肠杆菌基因无痕同源重组 的方法，包括W下步骤： (1) 将抗性基因 A与lac操纵序列相连，得到操纵子，所述抗性基因 A为可用于大肠杆菌 抗性软帝选的基因； (2) 将操纵子同源重组替换大肠杆菌染色体上的野生型laci基因及其启动子； (3) 用无痕重组工具基因串对步骤2同源重组替换后的大肠杆菌的祀位点序列进行同 源替换;所述无痕重组工具基因串由正筛选标记抗性基因 B与负筛选标记laci阻遏物基因 反向连接而成，抗性基因 B为可用于大肠杆菌抗性：0筛选的基因；负筛选标记laci阻遏物基 因包含placlq启动子； (4)利用抗性:Η对步骤3同源替换后的大肠杆菌进行筛选，获得重组成功的重组子； 巧）用目标DNA片段同源替换步骤4所得到的阳性大肠杆菌重组子中的工具基因串，利 用抗性;I对目标DNA片段同源替换后的大肠杆菌进行筛选，得到重组成功的无痕同源重组 子。
[0006] 进一步地，所述抗性?和抗性巧均选自抗氨节青霉素、抗氯霉素、抗卡那霉素、抗四 环素等，且抗性I不同于抗性Β。
[0007] 本发明的有益效果是:本发明所公开的方法中无痕重组工具基因串和目标DNA片 段的两步同源重组所产生的阳性重组子均可W用抗生素进行快速而有效的筛选，并能够达 到用目标基因对大肠杆菌祀位点进行无痕重组的效果。此方法的建立对大肠杆菌染色体进 行基因编辑研究工作具有重要的意义。
【附图说明】
[000引图1 :Plac-lac0-kan操纵子替换野生型laci基因及其启动子的过程示意图 图2:含无痕重组工具基因串cat-PlacIq-lacI的重组载体pUC19-cat-PlacIq-lacI的 结构示意图 图3:含无痕重组工具基因串tet-PlacIq-lacI的重组载体pUC19-tet- PlacIq-lacI的 结构示意图 图4:利用cat-PlacIq-lacI工具基因串将天然化1B基因启动子替换为trc启动子的过 程示意图 图5:利用tet-PlacIq-lacI工具基因串将天然化1B基因启动子替换为trc启动子的过 程示意图。
[0009]
【具体实施方式】
[0010] 本发明采用了具有抗性、且具有lac阻遏作用的工具基因串，实现对基因重组的筛 选;首先，采用操纵子(包含抗性基因 A)同源重组替换大肠杆菌染色体上的野生型lacI基因 及其启动子;然后用无痕重组工具基因串（包含抗性基因 B和lacI阻遏物基因）对同源重组 替换后的大肠杆菌的祀位点序列进行同源替换，使得抗性基因 A的表达被抑制，而抗性基因 B能有效表达，从而能利用抗性II筛选出成功重组替换的大肠杆菌；最后用目标DNA片段进 一步同源替换阳性大肠杆菌重组子中的工具基因串，使得抗性,〇消失，而抗性基因 A有效表 达，从而能利用抗性I筛选出成功重组了目标DNA片段的大肠杆菌。
[0011] 目标DNA片段为根据需要设计的基因片段，目标DNA片段的设计为本领域的常用技 术手段，祀位点序列为目标DNA片段需要替换的序列，祀位点序列的挑选为本领域的公知常 识。
[0012] 本发明中，基因的同源重组为本领域的常用技术手段，例如使用电穿孔法、氯化巧 法等公知的方法将外源片段或质粒载体导入大肠杆菌细胞。包含祀位点基因两端同源臂的 外源片段可W利用Red同源重组技术和染色体上的祀位点基因发生同源重组。
[0013] 下面结合实施例对本发明做进一步说明，但不应理解为对本发明的限制。若未特 别指明，本实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0014] 实施例1构建由lac操纵序列启动的卡那霉素抗性基因 kan操纵子，并同源重组替 换大肠杆菌DH5a的野生型laci基因及其启动子，构建包含由氯霉素抗性基因 cat与laci阻 遏物基因反向连接组成的无痕重组工具基因串的重组质粒pUC19-cat-PlacIq-lacI，利用 cat-PlacIq-lacI工具基因串，将大肠杆菌D册α中talB基因的天然启动子替换为化C启动 子，步骤如下： 1.1. 将质粒地D46电转入大肠杆菌D册α，用氨节青霉素平板筛选获得成功导入该质粒 的菌株。
[0015] 1.2.用上下游引物lacI-Plac-kan-F和lacI-kan-R(DNA序列分别如沈Q ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示)从质粒地D4上per扩增得到Plac-lacO-kan操纵子基因，将其同源重 组替换野生型laci基因及其启动子，用卡那霉素平板筛选获得正确重组的阳性菌株。Plac-lacO-kan操纵子基因结构如图1所示，此操纵子基因包括Lac启动子(Plac)，lacl阻遏物结 合位点（lacO)和卡那霉素抗性基因（kan)S个部分，序列如SEQ ID NO. 3所示。
[0016] 1.3 用上下游引物Bgl II-lacI-F和Κρη I-lacI-R(DNA序列分别如沈Q ID NO. 4 和SEQ ID NO. 5所示)从质粒pTrc99a上per扩增得到包含laci结构基因及其突变型启动子 的基因片段PlacIq-lacI。
[0017] 1.4用上下游引物Ba恤I-cat-F和Hind III-cat-R(DNA序列分别如沈Q ID NO. 6 和SEQ ID NO. 7所示)从质粒地D3上per扩增得到氯霉素抗性基因片段cat。
[001引 1.5将步骤4所得的cat基因和质粒PUC19分别用限制性内切酶BamH I、化nd III双 酶切后，回收cat基因和质粒PUC19大片段，将两者连接获得重组质粒pUC19-cat。将重组质 粒pUC19-cat和步骤3所得PlacIq-lacI基因分别用限制性内切酶BamH Ι、Κρη I双酶切后， 回收质粒pUC19-cat大片段和PlacIq-lacI基因，将两者连接获得重组质粒pUC19-cat-PlacIq-lacK质粒结构如图2所示），此质粒中包含的无痕重组工具基因串cat- Placlq-lacl的序列如沈Q ID NO. 8所示； 1.6 用上下游引物cat-lacI-talB-F和cat-lacI-talB-R(DNA序列分别如沈Q ID NO. 12和沈Q ID NO. 13所示)从步骤5所得的质粒pUC19-cat-PlacIq-lacI上per扩增得到工具 基因串cat-PlacIq-lacI，所得基因的两侧序列与talB基因的天然启动子两侧序列同源。将 扩增所得基因导入步骤2所得的重组大肠杆菌，同源重组替换该大肠杆菌基因 talB的启动 子，用氯霉素平板筛选，得到重组菌株D册α P化1B:: cat-PlacIq-lacI。
[0019] 1.7 tre启动子基因片段(DM序列如SEQ ID NO. 14所示）由公司合成，将其导入 步骤6所得的重组菌株D册α PtalB:: cat-PlacIq-lacI，同源重组替换菌株基因组上的 cat-PlacIq-lacI片