一种利用三孢布拉霉菌制备β-胡萝卜素的发酵方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种制备β-胡萝卜素的发酵方法，特别是涉及一种利用三孢布拉霉菌制备β-胡萝卜素的发酵方法。
【背景技术】
[0002]β_胡萝卜素是一种脂溶性不饱和脂肪族碳氢化合物，是类胡萝卜素族的典型代表，也是自然界中最普遍存在最稳定的天然色素，广泛存在于绿色和黄色蔬菜以及水果中。其分子式为C4qH56，分子量为536.88，外观呈深红色至暗红色，对氧、热和光不稳定，易发生氧化还原反应，不易溶于水、酸和碱，易溶于氯仿、苯和植物油，微溶于乙醇和乙醚。除了常用作着色剂以外，胡萝卜素还具有多种生物活性，是一种与人体健康密切相关的药用有效成分。研究发现，由于胡萝卜素的分子式含有2个β_紫罗酮环和4个异戊二烯侧链，中间断裂后即产生两个维生素A分子，在被人体吸收后可以作为维生素A的前体物质;此外，其分子中含有的不饱和结构使它具有较强的抗氧化活性和清除自由基的能力，能够有效的预防、延缓和治疗某些疾病，尤其是癌症，同时也能提高机体的免疫功能。因此，在食品、药品、化妆品、和保健品行业得到了广泛的应用。
[0003]天然来源的β-胡萝卜素与合成的β-胡萝卜素相比，由于其来源广泛、不含致癌物质、成本较低且生理活性好，在市场上占有主导地位。近年来，国内外天然胡萝卜素的生产多采用微生物发酵的方法，利用微生物进行发酵生产具有生产周期短、过程容易控制、不受地域及气候的影响、容易进行规模化操作等优势。在实验过程中，研究人员已经获得了一些具有生产价值的优良菌株，如三孢布拉霉、分歧杆菌、红假单胞菌及红法夫酵母等，其中三孢布拉霉的性能较佳，在生产上也得到较广泛的使用。
[0004]三孢布拉霉(Blakeslea trispora)属于毛霉目、弈霉科，是单细胞低等真菌。在一定的培养条件下生长迅速，能在较短的时间内达到较大的生物量，适用于规模化的生产。此外，还有一个特殊之处是三孢布拉霉属于异宗结合菌，分为正、负2种，这两种单性菌株在形态上没有明显的差别，单独培养能够进行无性繁殖，当它们混合发酵时正负菌株的菌丝体互相接触，发生异宗配合进行有性繁殖，即可获得较高产量的胡萝卜素。目前，国内外许多学者都在着手探索提高三孢布拉霉发酵生产β-胡萝卜素的工艺条件，以使其更适合工业化大生产。由于丝状真菌三孢布拉霉本身的生长特性，其发酵培养基多采用粘性较大的物质(如淀粉、大豆粉等)来充当碳氮源，以有利于丝状真菌菌丝的延长，最终形成菌丝球，但粘度较大的发酵液多数时间属于非牛顿性流体，对氧的传递有较大的影响;而且在发酵前期，菌体的快速生长使其对溶氧及营养物质的需求比较高，随着菌体浓度的增加进一步加大了发酵液粘度，从而导致溶氧成为限制菌体生长、产物合成的关键因素，甚至引起代谢异常，影响目标产物的产量。
[0005]因此，在以三孢布拉霉为菌株生产β_胡萝卜素的发酵过程中，科研工作者多通过诱变筛选优良菌株或改变发酵的搅拌形式、溶氧供给方式，在发酵过程中添加氧载体或添加能够增加菌体细胞通透性的表面活性剂来提高发酵液中氧浓度及氧的利用率，这些研究对发酵过程的改善有一定的效果，但也存在着这样或那样的不足，或者是最终的产量低，或者是由于设备复杂导致成本高，也有的是仅仅针对一个方面而没有对发酵过程进行综合的考虑。我国专利CN1331343A中公开了一种对搅拌桨叶的形式进行改变的工艺，采用上中层为宽叶推进式、下层为涡轮式的组合式搅拌桨叶，提高了发酵液的传质性能，不过改变搅拌形式后只能适合该菌株的生产特性，不利于发酵罐的全面利用；专利CN102787158A中通过对接种前的培养基进行胶体磨高速剪切乳化来提高发酵液夹带的氧浓度，该技术对设备要求比较高、成本投入较大而且对发酵的工艺并未进行过多的探索，主要对后续的提取工艺进行了深入的研究；专利CN1193048A利用气升式发酵罐进行三孢布拉霉发酵制备β-胡萝卜素，该方法能够较好的避免剪切力，有利于菌丝的生长从而获得较大的生物量，但最终的产量较低，也不容易进行规模化的大生产。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种利用三孢布拉霉菌制备β-胡萝卜素的发酵方法，即通过调整培养基的配方和制备工艺，将淀粉进行预处理获得粘度适中的发酵培养基，并结合菌体本身的生长变化规律进行补料，从而提高溶解氧浓度并使其得到合理、高效的利用，该方法对提高胡萝卜素的产量效果显著。
[0007]本发明的目的可通过以下技术方案来实现:一种利用三孢布拉霉菌制备β-胡萝卜素的发酵方法，其包括如下步骤:(I)菌种活化；(2)—级种子培养；(3)二级种子培养；(4)发酵培养;其中，
[0008](I)菌种活化:在无菌条件下，将三孢布拉霉正、负菌株分别接种到斜面TOA培养基上，置于培养箱内，26?30°C培养4?5d，待三孢布拉霉正、负菌株分别长出孢子后，在无菌条件下，用无菌生理盐水将斜面培养基中孢子刮洗下来，配制成均匀的孢子悬液，使正、负菌孢子悬液的浓度分别为:正菌14个孢子/mL，负菌15个孢子/mL;其中，三孢布拉霉(Blakeslea trispora)正、负菌株购自ATCC，编号分别为ATCC 14271 ⑴，ATCC 14272(-);
[0009](2)—级种子培养:将正、负菌株以孢子悬液的方式分别接入种子罐，正菌株的培养温度为28°C，转速为400?600r/min，通气量为0.6?0.8vvm，罐压为0.03?0.06MPa，培养时间为20?36h;负菌株的培养温度为28°C，转速为500?700r/min，通气量为0.6?0.8vvm，罐压为0.03?0.06MPa，培养时间为20?36h，得到三孢布拉霉正、负菌株一级种子液；
[0010](3) 二级种子培养:将所述步骤(2)培养得到的所述三孢布拉霉正、负菌株一级种子液混合接种到二级种子罐中，所述三孢布拉霉正菌株一级种子液与所述三孢布拉霉负菌株一级种子液的接种体积比为1:5?1:10，接种量为10?15%，培养时间为10?20h，培养条件为:28°C，转速为600?900r/min，通气量为0.6?0.8vvm，罐压为0.03?0.06MPa，得到二级种子液；
[0011](4)发酵培养:采用压差法将所述二级种子液接入发酵罐中，接种量为10?15%，在pH 5.5?7.0的条件下培养96?120h，培养条件为:28°C，转速和通气量随菌体的生长情况进行控制;发酵过程需要补入植物油，根据取样检测结果补入淀粉水解液，根据菌体的生长情况进行补稀料;其中，发酵培养基组成为:所述淀粉水解液、大豆蛋白粉、鱼粉、植物油、硫酸铜、硫酸镁、磷酸二氢钾、Ve、乳化剂。
[0012]具体的，所述步骤(2)每升一级种子培养基中包括如下重量份组分:葡萄糖22?26g，所述大豆蛋白粉26?30g，所述硫酸镁0.8?1.0g，所述磷酸二氢钾3?5g，氯化钙0.06?0.Ig，所述硫酸铜0.06?0.Ig，所述Ve 0.025?0.05g，所述乳化剂0.5?2g;所述步骤(3)每升二级种子培养基中包括如下重量份组分:所述葡萄糖22?26g，所述大豆蛋白粉26?30g，所述硫酸镁0.8?1.0g，所述磷酸二氢钾3?5g，所述氯化钙0.06?0.1g，所述硫酸铜
0.06?0.Ig，所述Ve 0.025?0.05g，所述乳化剂0.5?2g。
[0013]具体的，所述步骤