高效液相色谱法检测发酵液中β-胡萝卜素单位可达3.55g/L，i3-胡萝卜素在干菌体中的百分比为5.97%。
[0033]实施例2:—种利用三孢布拉霉菌制备β-胡萝卜素的发酵方法，其包括如下步骤:
(I)菌种活化;(2) —级种子培养;(3)二级种子培养;(4)发酵培养;其中，
[0034](I)菌种活化:在无菌条件下，将三孢布拉霉正、负菌株分别接种到斜面TOA培养基(马铃薯葡萄糖琼脂培养基，适于真菌生长)上，置于培养箱内，30°C培养5d，待三孢布拉霉正、负菌株分别长出孢子后，在无菌条件下，用无菌生理盐水将斜面培养基中孢子刮洗下来，配制成均匀的孢子悬液，使正、负菌孢子悬液的浓度分别为:正菌14个孢子/mL，负菌15个孢子/mL;其中，三孢布拉霉(Blakeslea trispora)正、负菌株购自ATCC，编号分别为ATCC14271(+)，ATCC14272(_);
[00；35] (2)—级种子培养:将正、负菌株以孢子悬液的方式分别接入种子罐，正菌株的培养温度为28°C，转速为600r/min，通气量为0.6vvm，罐压为0.06MPa，培养时间为20h ；负菌株的培养温度为28°C，转速为700r/min，通气量为0.8vvm，罐压为0.06MPa，培养时间为20h，得到三孢布拉霉正、负菌株一级种子液;每升一级种子培养基中包括如下重量份组分:葡萄糖26g，大豆蛋白粉30g，硫酸镁1.0g，磷酸二氢钾5g，氯化|丐0.1g,硫酸铜0.lg,Ve0.05g，司班-402g;
[0036](3) 二级种子培养:将步骤(2)培养得到的三孢布拉霉正、负菌株一级种子液混合接种到二级种子罐中，三孢布拉霉正菌株一级种子液与三孢布拉霉负菌株一级种子液的接种体积比为1:5，接种量为15%，培养时间为1011，培养条件为:28°(3，转速为90(^/1^11，通气量为0.8vvm，罐压为0.06MPa，得到二级种子液;每升二级种子培养基中包括如下重量份组分:葡萄糖26g，大豆蛋白粉30g，硫酸镁1.(^，磷酸二氢钾58，氯化|丐0.1g，硫酸铜0.1g，Ve0.05g,司班_402g。
[0037](4)发酵培养:采用压差法将所述二级种子液接入发酵罐中，接种量为15%，在pH7.0的条件下培养120h，培养条件为:28°C，转速和通气量随菌体的生长情况进行控制，转速和通气量的调节策略为:发酵前期，转速为150r/min，通气量为0.8vvm，罐压为0.06MPa ；随着发酵进行，待镜检观察大量菌丝体粗壮且菌丝体内颜色已大量累积黄色时，即发酵时间达到60h时，将转速调节为250r/min，通气量调节为1.2vvm，罐压调节为0.06MPa，然后补入稀料，稀料包括紫罗兰酮和苹果酸，一次补入紫罗兰酮的量为发酵液体积总量的
0.4%, 一次补入苹果酸的量为发酵液体积总量的0.3 %。在发酵30h时一次补入大豆油，每升发酵液中补入Ig大豆油;在发酵过程中每隔4h取样测残糖，取样检测残糖含量低于5.0g/L时，分一次或多次补入淀粉水解液，控制发酵液中残糖含量为6?I Og/L。
[0038]每升发酵培养基中具体包括如下组分:淀粉水解液0.4L、大豆蛋白粉18g、鱼粉32g、大豆油40g、硫酸铜0.08g、硫酸镁1.0g、磷酸二氢钾5g、VE 0.05g、司班_402g;并用氢氧化钾调节发酵培养基pH为7.0。
[0039]其中，淀粉水解液由如下方法制得:将番薯淀粉与水配制成淀粉乳，淀粉乳的质量百分比浓度为15 %，然后加入盐酸，盐酸添加量为淀粉乳体积总量的0.4 %，盐酸为市售浓盐酸，淀粉乳与盐酸搅拌均匀后反应，反应温度控制在40°C，反应时间为3h。反应结束后，用氢氧化钾中和制得pH为7.5的淀粉水解液。
[0040]收集发酵液获得菌体，测得干重达到65.2g/L，高效液相色谱法检测发酵液中β-胡萝卜素单位可达4.68g/L，i3-胡萝卜素在干菌体中的百分比为7.18%。
[0041]实施例3:—种利用三孢布拉霉菌制备β-胡萝卜素的发酵方法，其包括如下步骤:
(I)菌种活化;(2) —级种子培养;(3)二级种子培养;(4)发酵培养;其中，
[0042](I)菌种活化:在无菌条件下，将三孢布拉霉正、负菌株分别接种到斜面TOA培养基(马铃薯葡萄糖琼脂培养基，适于真菌生长)上，置于培养箱内，28°C培养4d，待三孢布拉霉正、负菌株分别长出孢子后，在无菌条件下，用无菌生理盐水将斜面培养基中孢子刮洗下来，配制成均匀的孢子悬液，使正、负菌孢子悬液的浓度分别为:正菌14个孢子/mL，负菌15个孢子/mL;其中，三孢布拉霉(Blakeslea trispora)正、负菌株购自ATCC，编号分别为ATCC14271(+)，ATCC14272(_);
[0043](2)—级种子培养:将正、负菌株以孢子悬液的方式分别接入种子罐，正菌株的培养温度为28°C，转速为500r/min，通气量为0.7vvm，罐压为0.04MPa，培养时间为28h ；负菌株的培养温度为28°C，转速为600r/min，通气量为0.7vvm，罐压为5MPa，培养时间为28h，得到三孢布拉霉正、负菌株一级种子液;每升一级种子培养基中包括如下重量份组分:葡萄糖24g，大豆蛋白粉28g，硫酸镁0.9g，磷酸二氢钾4g，氯化钙0.08g，硫酸铜0.08g，Ve 0.035g，司班-401.5g；
[0044](3) 二级种子培养:将步骤(2)培养得到的三孢布拉霉正、负菌株一级种子液混合接种到二级种子罐中，三孢布拉霉正菌株一级种子液与三孢布拉霉负菌株一级种子液的接种体积比为1:8，接种量为12%，培养时间为1511，培养条件为:28°(3，转速为75(^/1^11，通气量为0.7vvm，罐压为0.05MPa，得到二级种子液;每升二级种子培养基中包括如下重量份组分:葡萄糖24g，大豆蛋白粉28g，硫酸镁0.9g，磷酸二氢钾4g，氯化钙0.08g，硫酸铜0.08g，Ve
0.035g，司班-401.5g0
[0045](4)发酵培养:采用压差法将所述二级种子液接入发酵罐中，接种量为12%，在pH6的条件下培养105h，培养条件为:28°C，转速和通气量随菌体的生长情况进行控制，转速和通气量的调节策略为:发酵前期，转速为130r/min，通气量为0.7vvm，罐压为0.04MPa;随着发酵进行，待镜检观察大量菌丝体粗壮且菌丝体内颜色已大量累积黄色时，即发酵时间达至Ij55h时，将转速调节为210r/min，通气量调节为1.0vvm，罐压调节为0.04MPa，然后补入稀料，稀料包括紫罗兰酮和苹果酸，一次补入紫罗兰酮的量为发酵液体积总量的0.2%，一次补入苹果酸的量为发酵液体积总量的0.2%。在发酵35h时一次补入葵花籽油，每升发酵液中补入2g葵花籽油;在发酵过程中每隔4h取样测残糖，取样检测残糖含量低于5.0g/L时，分一次或多次补入淀粉水解液，控制发酵液中残糖含量为6?I Og/L。
[0046]每升发酵培养基中具体包括如下组分:淀粉水解液0.3L、大豆蛋白粉15g、鱼粉298、葵花籽油3(^、硫酸铜0.078、硫酸镁0.98、磷酸二氢钾48、￥￡ 0.035g、司班_401g;并用氢氧化钠调节发酵培养基PH为6。
[0047]其中，淀粉水解液由如下方法制得:将马铃薯淀粉