(4)每升所述发酵培养基中具体包括如下组分:所述淀粉水解液
0.2?0.4L、所述大豆蛋白粉12?18g、所述鱼粉26?32g、所述植物油20?40g、所述硫酸铜0.06?0.08g、所述硫酸镁0.8?1.0g、所述磷酸二氢钾3?5g、所述Ve 0.025?0.05g、所述乳化剂0.5?2g;并用氢氧化钠或氢氧化钾调节所述发酵培养基pH为5.5?7.0。
[0014]具体的，所述淀粉水解液由如下方法制得:将淀粉与水配制成淀粉乳，然后加入盐酸搅拌均匀后反应，反应结束后，用所述氢氧化钠或所述氢氧化钾中和制得pH为6.5-7.5的所述淀粉水解液。
[0015]进一步的，所述淀粉乳的质量百分比浓度为15?20%，所述盐酸添加量为所述淀粉乳体积总量的0.4?0.6%，所述盐酸为市售浓盐酸，所述淀粉乳与所述盐酸的反应温度控制在40?60°C，反应时间为I?3h。
[0016]具体的，所述淀粉为玉米淀粉、番薯淀粉或马铃薯淀粉中的任意一种。
[0017]具体的，所述步骤(4)发酵过程中转速和通气量的调节策略为:发酵前期，转速为120?150r/min，通气量为0.6?0.8vvm，罐压为0.03?0.06MPa ；随着发酵进行，待镜检观察大量菌丝体粗壮且菌丝体内颜色已大量累积黄色时，即发酵时间达到50?60h时，将转速调节为170?250r/min，通气量调节为0.8?1.2vvm，罐压调节为0.03?0.06MPa，然后补入所述稀料，所述稀料包括紫罗兰酮和苹果酸，一次补入所述紫罗兰酮的量为发酵液体积总量的0.1?0.4%，一次补入所述苹果酸的量为所述发酵液体积总量的0.1?0.3%。
[0018]具体的，所述步骤(4)中，在发酵30?40h时一次补入所述植物油，每升所述发酵液中补入I?3g所述植物油;在发酵过程中，取样检测残糖含量低于5.0g/L时，分一次或多次补入所述淀粉水解液，控制所述发酵液中残糖含量为6?10g/L。
[0019]具体的，所述植物油为玉米油、大豆油、葵花籽油或棕榈油中的任意一种或几种；所述乳化剂为司班系列产品或吐温系列产品。
[0020]与现有技术相比，本发明利用三孢布拉霉菌制备β-胡萝卜素的发酵方法具有如下优点和显著的进步性:
[0021]首先，本发明在发酵培养基配制前将淀粉酸化水解处理，促使淀粉分子在酸解反应过程中糖苷键断裂，从而导致淀粉分子的聚合度急剧降低，淀粉粘度值急剧下降，可以有效地改善发酵液的物理性质，从而提高了溶解氧的浓度，能够满足菌丝体在发酵初期快速积累时对氧气的消耗；同时，淀粉水解液的主要成分是葡萄糖，其次是少量麦芽糖及其它一些二糖、低聚糖等复合糖类，这些物质能够在发酵前期满足菌体快速生长，而部分未完全水解的淀粉，则在菌体积累一定的生物量后成为慢速利用碳源，有利于产物合成。因此，淀粉前处理操作兼顾了生产菌的营养特性和产物合成，从而大大提高了胡萝卜素的产量。
[0022]其次，本发明在培养基粘度降低的基础上，根据菌体的生长情况分阶段进行通气量的改变，既有利于菌体生长和产物合成又降低了能耗，节约了能源;而且补料直接用淀粉水解物除了能够对胡萝卜素的发酵单位有所提高外，与补料用葡萄糖相比，补料量有所降低，从而也降低了原料成本。
[0023]第三，本发明对设备要求不高、成本投入较小，且原料来源广泛，成本低，β_胡萝卜素的产量较改进前工艺明显提高，因此，可实现规模化生产。
【具体实施方式】
[0024]下面结合具体实施例对本发明进行详细说明，但以下实施例并不构成对本发明的限制。
[0025]实施例1:一种利用三孢布拉霉菌制备β-胡萝卜素的发酵方法，其包括如下步骤:(I)菌种活化;(2) —级种子培养;(3)二级种子培养;(4)发酵培养;其中，
[0026](I)菌种活化:在无菌条件下，将三孢布拉霉正、负菌株分别接种到斜面TOA培养基(马铃薯葡萄糖琼脂培养基，适于真菌生长)上，置于培养箱内，26°C培养4d，待三孢布拉霉正、负菌株分别长出孢子后，在无菌条件下，用无菌生理盐水将斜面培养基中孢子刮洗下来，配制成均匀的孢子悬液，使正、负菌孢子悬液的浓度分别为:正菌14个孢子/mL，负菌15个孢子/mL;其中，三孢布拉霉(Blakeslea trispora)正、负菌株购自ATCC，编号分别为ATCC14271(+)，ATCC14272(_);
[0027](2)—级种子培养:将正、负菌株以孢子悬液的方式分别接入种子罐，正菌株的培养温度为28°C，转速为400r/min，通气量为0.6vvm，罐压为0.03MPa，培养时间为36h ；负菌株的培养温度为28°C，转速为500r/min，通气量为0.8vvm，罐压为0.0?0.06MPa，培养时间为20h，得到三孢布拉霉正、负菌株一级种子液;每升一级种子培养基中包括如下重量份组分:葡萄糖22g，大豆蛋白粉26g，硫酸镁0.8g，磷酸二氢钾3g，氯化|丐0.06g，硫酸铜0.06g，Ve
0.0258，吐温-600.58;
[0028](3) 二级种子培养:将步骤(2)培养得到的三孢布拉霉正、负菌株一级种子液混合接种到二级种子罐中，三孢布拉霉正菌株一级种子液与三孢布拉霉负菌株一级种子液的接种体积比为1:10，接种量为10 %，培养时间为20h，培养条件为:28°C，转速为900r/min，通气量为0.8vvm，罐压为0.03MPa，得到二级种子液;每升二级种子培养基中包括如下重量份组分:葡萄糖22g，大豆蛋白粉26g，硫酸镁0.8g，磷酸二氢钾3g，氯化|丐0.06g，硫酸铜0.06g，Ve
0.025g，吐温-600.5g0
[0029](4)发酵培养:采用压差法将所述二级种子液接入发酵罐中，接种量为10%，在pH5.5的条件下培养96h，培养条件为:28°C，转速和通气量随菌体的生长情况进行控制，转速和通气量的调节策略为:发酵前期，转速为120r/min，通气量为0.6vvm，罐压为0.03MPa ；随着发酵进行，待镜检观察大量菌丝体粗壮且菌丝体内颜色已大量累积黄色时，即发酵时间达到56h时，将转速调节为170r/min，通气量调节为0.8vvm，罐压调节为0.06MPa，然后补入稀料，稀料包括紫罗兰酮和苹果酸，一次补入紫罗兰酮的量为发酵液体积总量的
0.1%，一次补入苹果酸的量为发酵液体积总量的0.1 %。在发酵30h时一次补入玉米油，每升发酵液中补入Ig植物油;在发酵过程中每隔4h取样测残糖，取样检测残糖含量低于5.0g/L时，分一次或多次补入淀粉水解液，控制发酵液中残糖含量为6?I Og/L。
[0030]每升发酵培养基中具体包括如下组分:淀粉水解液0.2L、大豆蛋白粉12g、鱼粉26g、玉米油20g、硫酸铜0.06g、硫酸镁0.8g、磷酸二氢钾3g、VE 0.025g、吐温-600.5g;并用氢氧化钠调节发酵培养基pH为5.5。[0031 ]其中，淀粉水解液由如下方法制得:将玉米淀粉与水配制成淀粉乳，淀粉乳的质量百分比浓度为20%，然后加入盐酸，盐酸添加量为淀粉乳体积总量的0.6%，盐酸为市售浓盐酸，淀粉乳与盐酸搅拌均匀后反应，反应温度控制在40°C，反应时间为lh。反应结束后，用氢氧化钠中和制得pH为6.5的淀粉水解液。
[0032]收集发酵液获得菌体，测得干重达到59.5g/L，