0066](5)发酵培养结果:如图1，展示了以去除氨氮后的污泥产酸发酵上清液为发酵培养基时，序批式培养中不同培养周期所获得的油脂酵母的生物量和油脂含量，序批式培养第五周期，生物量达到4.53g/L，油脂含量达到39.6%。
[0067]对比例
[0068](I)厌氧发酵:将剩余污泥在4°C下静置沉淀12?24h至下层浓缩污泥的浓度在15?20g/L之间，移除上清液，取300mL浓缩污泥至IL体积的厌氧发酵罐中，按照0.lg/gTSS的浓度加入茶皂素，厌氧条件下进行污泥的厌氧发酵，发酵PH为9，温度30±0.5°C，搅拌速度120rpm，厌氧发酵时间为7天。对发酵液进行固液分离所采用的方式为离心，离心分离的离心力为10000 X g，离心时间为20min，获得产酸上清液。
[0069](2)上清液氨氮去除:将污泥厌氧发酵获得的产酸清液收集，取适量污泥发酵上清液，根据N:P:Mg(mol:mol) = l:2.2:2.2加入规定量十二水合磷酸氢二钠固体，200rpm搅拌下使固体完全溶解;然后以6M氢氧化钾调节pH至9.5，再加入定量氯化镁母液，开启化学沉淀过程;反应过程中以6M氢氧化钾调节使pH保持在9左右;反应过程中进行磁力搅拌或机械搅拌，首先200rpm搅拌5min，然后10rpm搅拌1min。反应结束后，进行离心分离，离心力4000 X g，时间5min，获得去除氨氮的发酵上清液。
[0070](3)酵母菌的培养:
[0071 ]①种子培养
[0072]种子培养基:YPD种子培养基，包含20g//L葡萄糖，10g/L鱼粉蛋白胨，10g/L酵母提取物，初始pH为6.0。
[0073]种子培养方式:挑取I?2接种环酵母菌菌落，接种至50mLYPD液体培养基内，于250mL锥形瓶中培养36h，培养温度为30°C，转速200rpm。
[0074]②发酵培养
[0075]发酵培养基:分别以未去除氨氮的污泥产酸发酵上清液(鸟粪石沉淀前)和去除氨氮的污泥产酸发酵上清液(鸟粪石沉淀后)，初始PH调节至6.0。
[0076]发酵培养方式:常规培养。将发酵36h的YH)种子培养液离心收集菌体，去除YPD培养基中营养成分对发酵培养基的影响，然后将酵母菌体重悬浮至等体积发酵培养基中，取5mL接种至45mL发酵培养基中进行发酵培养。培养时间为24h。培养温度为30 ± 0.5°C，转速为200rpm。
[0077](4)酵母菌的收集和油脂的提取:离心收集酵母菌细胞(离心力4000 X g，时间5min)，并采用机械研磨破碎结合有机溶剂提取的方法获得微生物油脂。加0.5mm直径的玻璃珠3500rpm高速研磨5?10s，提取试剂为氯仿甲醇溶液(v:v = l:1)，提取两次，离心后抽取并合并两次提取的下层溶液，再以0.15%氯化钠溶液离心清洗一次，抽取下层溶液，50°C条件下采用氮吹法挥发有机溶剂获得微生物油脂。离心力4000 X g，时间5min。
[0078](5)发酵培养结果:如图2所示，分别展示了以不去除氨氮(鸟粪石沉淀前)和去除氨氮的(鸟粪石沉淀后)污泥发酵上清液为发酵培养基时，常规培养之下所获得的油脂酵母生物量和油脂含量。鸟粪石沉淀前的产酸清液培养基内获得生物量1.61g/L，油脂含量10.2%；鸟粪石沉淀后的产酸清液培养基内获得生物量1.56g/L，油脂含量16.8%。
[0079]通过与对比实施例的对比分析可知，采用“鸟粪石沉淀去除氨氮结合序批式培养”的方式，能够获得良好的培养效果。五个周期的序批式培养之下生物量和油脂含量分别为常规培养之下的2.9倍和2.4倍。
[0080]上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种利用剩余污泥发酵产酸并合成微生物油脂的方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)以剩余污泥为原料，加入茶皂素进行厌氧发酵获得上清液； (2)采用鸟粪石沉淀法去除步骤(I)所得上清液中的氨氮，得到富含挥发性脂肪酸的溶液； (3)以步骤(2)所得的溶液为培养基，采用序批式培养方式培养产油酵母； (4)以步骤(3)培养结束得到的酵母菌细胞为原料，提取得到微生物油脂。2.根据权利要求1所述的一种利用剩余污泥发酵产酸并合成微生物油脂的方法，其特征在于，步骤(I)所述的剩余污泥来源于采用生物法处理城市生活污水的污水处理厂。3.根据权利要求1所述的一种利用剩余污泥发酵产酸并合成微生物油脂的方法，其特征在于，步骤(I)所述的厌氧发酵过程中，污泥浓度为15?20g/L，投加茶皂素0.lg/gTSS，搅拌速度为100?150rpm，发酵温度25?30°C，发酵pH为7?9，发酵时间为6?7天。4.根据权利要求1所述的一种利用剩余污泥发酵产酸并合成微生物油脂的方法，其特征在于，步骤(2)所述的鸟粪石沉淀法具体为:向步骤(I)所得上清液中投加磷酸氢二钠固体和氯化镁高浓度母液，使溶液中N: P:Mg摩尔比为1: 2.2:2.2，沉淀过程控制pH为9.0?9.5，离心分离获取上清液。5.根据权利要求1所述的一种利用剩余污泥发酵产酸并合成微生物油脂的方法，其特征在于，步骤(3)所述的采用序批式培养方式培养产油酵母具体操作方式为，将酵母菌种子培养液以5%?10% (v/v)接入到步骤(2)得到的富含挥发性脂肪酸的溶液中进行培养，定期监测培养过程中酵母菌的生物量，当酵母菌不再生长时排出发酵液保留酵母菌菌体，然后以步骤(2)得到的溶液作为新鲜培养基补充进去进入下一个周期的培养，共进行3?5个周期。6.根据权利要求5所述的一种利用剩余污泥发酵产酸并合成微生物油脂的方法，其特征在于，发酵培养过程中，初始pH为6.0，转速150?200rpm，培养温度为29.5-30.5°C。7.根据权利要求1所述的一种利用剩余污泥发酵产酸并合成微生物油脂的方法，其特征在于，步骤(4)中酵母菌细胞收集采用离心法，生理盐水离心清洗一次。8.根据权利要求1所述的一种利用剩余污泥发酵产酸并合成微生物油脂的方法，其特征在于，步骤(4)中油脂提取采用物理研磨破碎+有机溶剂提取的方法，具体为:加玻璃珠3500rpm高速研磨5?10s，用甲醇氯仿体积比为1:1的有机溶剂提取两次，离心后抽取并合并两次提取的下层溶液，再以质量分数为0.15%的NaCl溶液离心清洗一次，抽取下层溶液，45-55°C条件下采用氮吹法挥发有机溶剂获得微生物油脂。9.根据权利要求1所述的一种利用剩余污泥发酵产酸并合成微生物油脂的方法，其特征在于，所述的酵母菌包括Cryptococcus curvatus MUCL 29819nCryptococcus curvatusATCC 20509、Rhodosporidium toruloides AS 2.1389nCryptococcus albidus ATCC10672或Yarrowia lipolytica MUCL 2884等产油酵母。
【专利摘要】本发明涉及一种利用剩余污泥发酵产酸并合成微生物油脂的方法，属于污泥资源化处理领域，包括以下步骤：(1)以剩余污泥为原料，加入茶皂素进行厌氧发酵获得上清液；(2)采用鸟粪石沉淀法去除步骤(1)所得上清液中的氨氮，得到富含挥发性脂肪酸的溶液；(3)以步骤(2)所得的溶液为培养基，采用序批式培养方式培养产油酵母；(4)以步骤(3)培养结束得到的酵母菌细胞为原料，提取得到微生物油脂。与现有技术相比，本发明可以利用剩余污泥产生的低浓度挥发性脂肪酸为培养基合成高含量微生物油脂，提高剩余污泥产酸应用的环境效益和经济效益。
【IPC分类】C12R1/645, C12P7/64
【公开号】CN105524952
【申请号】CN201610080562
【发明人】刘佳, 黄翔峰, 刘佳楠, 苑明, 陈锐, 陆丽君, 彭开铭
【申请人】同济大学
【公开日】2016年4月27日
【申请日】2016年2月4日