一种表达载体及胰岛素样生长因子结合蛋白3的表达方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种表达载体及胰岛素样生长因子结合蛋白 3的表达方法。
【背景技术】
[0002] 身材矮小（short stat ure)是指在相似环境下，儿童身高低于同种族个体正常身 高2个标准差以上，或者低于正常儿童生长曲线第三百分位。在众多因素中，内分泌的生长 激素(GH)对身高的影响起着十分重要的作用。患儿因 GH缺乏所导致的矮小，称为生长激素 缺之症，又称为垂体性株儒症。
[0003] IGF-1是一种具有广泛作用的生长激素依赖性细胞因子，对成骨细胞有促进有丝 分裂的作用，还可刺激成骨细胞的AKP活性促进骨钙素的合成，对成骨细胞其它分化功能亦 有影响。IGF-1在一些患侏儒症、生长激素缺乏症、矮小症等的儿童中，比正常对照组儿童会 明显减少。胰岛素样生长因子结合蛋白3(IGFBP-3)是血液中IGF-1的主要载体，它结合了血 清中大部分游离的IGF-1，当IGFBP-3与IGF-1结合后，可以减少游离IGF-1的浓度，有利于增 强和发挥IGF-1受体的活性，可以延长IGF-1的半衰期，提高血清中的水平。
[0004] 科学研究发现GH缺乏或不足会影响循环中的IGF-1和IGFBP-3含量；反之，血液 IGF-1和IGFBP-3水平也反映了内源性的生长激素的分泌情况，而且数值稳定，几乎没有昼 夜变化，所以，检测GH、IGF-1和IGFBP-3能较好反映机体GH的分泌情况，对临床早期诊断矮 小症和GH分泌减低患儿有较重要意义。
[0005] 开发IGFBP-3检测试剂，特别是以ELISA法检测IGFBP-3含量，最重要的环节是 IGFBP-3抗体的制备，而决定抗体免疫原性的重要因素就是抗原。含量高、纯度好的抗原为 抗体免疫原性的提高提供了保障。因此，开发产物得率高、纯度好的IGFBP-3的表达方法是 十分必要的。
【发明内容】
[0006] 有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种表达载体胰岛素样生长因子结 合蛋白3(IGFBP-3)的表达方法。以本发明提供方法制备IGFBP-3得率高，所得产物纯度良 好。
[0007] 本发明提供了 一种表达载体，包括IGFBP-3基因和TEV基因。
[0008] 作为优选，表达载体的骨架为pUC57-simple。
[0009] TEV Protease是来源于烟草蚀纹病毒(TEV)的蛋白酶经改进后的50kDa的蛋白酶， 经过设计后与天然TEV蛋白酶相比其稳定性更好。本发明将该TEV基因与IGFBP-3基因共同 连接入表达载体，经表达产生融合蛋白后，以TEV为亲和标签进行纯化后再以TEV蛋白酶将 融合蛋白中的TEV部分去除，从而获得纯度更好的IGFBP-3蛋白。
[0010]本发明采用的IGFBP-3基因来自Genbank，登录号为3486,其制备采用人工合成的 方式。TEV基因来自武汉淼灵生物科技有限公司的载体pUC57simple-KF001AG2aFC，采用PCR 的方式扩增获得。
[0011]在本发明提供的表达载体中，TEV基因可位于IGFBP-3基因的3'端，也可位于 IGFBP-3基因的5'端。
[0012 ] 在本发明的实施例中，TEV基因位于IGFBP-3基因的5 '端。
[0013]不同的载体会影响表达产物的得率，本发明以pUC57-Simple为骨架制备表达载 体，表达产物得率较高。
[0014] 作为优选，IGFBP-3基因和TEV基因的插入位点位于Xba I和BamH I之间。
[0015] 本发明提供的表达载体的制备方法，包括：
[0016] 步骤1:以重叠 PCR的方式连接IGFBP-3基因和TEV基因，获得IGFBP3-TEV片段；
[0017] 步骤2:分别以Xba I和BamH I酶切IGFBP3-TEV片段和pUC57-simple载体后，将酶 切后的IGFBP3-TEV片段和pUC57-S imp 1 e载体连接获得表达载体。
[0018] 在本发明中，IGFBP-3基因的制备方法为根据Genbank登录号为3486的序列人工合 成后，将所述IGFBP-3基因克隆到大肠杆菌质粒载体pUC57-simple中，获得pUC57simple-IGFBP3载体，以pUC57simple-IGFBP3载体为模板，PCR扩增IGFBP3基因。
[0019] 作为优选，PCR扩增IGFBP3基因的引物对的核酸序列如SEQ ID N0:1~2所示。
[0020] PCR扩增IGFBP3基因的反应体系为： 模板(pUC57simple-lGFBP3) ( 0. 5~1 ) μL; 2 mmol /L dNTPs 2μ1; 10 χ PCR Buffer 2 μL;
[0021] SEQ [-D NO: 1 所示引物 0. 5μ1; SEQ ID NQ:2 所示引物 0. 5μ1; Taq 酶 0·2μΙ;
[0022] ddH20 补充至 20μ1。
[0023] PCR扩增IGFBP3基因的反应条件为：
[0025] 所得PCR产物经琼脂凝胶电泳，胶回收目的基因片段，并置于_20°C保存。
[0026] 作为优选，以质粒pUC57simple-KF001AG2aFc为模板PCR扩增TEV基因的引物对的 核酸序列如SEQ ID N0:3~4所示。
[0027] PCR扩增TEV基因的反应体系为： 模板(pUC57simple-KF001 AG2aFc) ( 0. 5~1 ) μΙ; 2 mmol /L dNTPs 2μ1; j〇x PCR Buffer 2 μL;
[0028] SEQ ID N0:3 所示引物 Ο, 5μ1; SEQ ID Ν0:4 所示引物 5μ1; T'aq 酶 0. 2μ1; ddH20补充至
[0029] PCR扩增TEV基因的反应条件为：
[0031]所得PCR产物经琼脂凝胶电泳，胶回收目的基因片段，并置于_20°C保存。
[0032] 以胶回收的IGFBP3和TEV-mIgG2aFc基因作为模板，以重叠 PCR的方式连接IGFBP-3 基因和TEV基因，获得IGFBP3-TEV片段。作为优选，重叠 PCR的引物对的核酸序列如SEQ ID NO: 5~6所示。 模板(IGFBP3 基因) (0. 5~1 ) μL; 模板(TEV 基因） （0:，5~1)μ1; 2 mmol /L dNTPs 2μ1,
[0033] 10 x PCR Buffer 2 μL; SEQ ID NO:5 所示引物 0· 5μΙ; SEQ ID ΝΟ:6 所示引物 （)· 5μ1: Taq 酶 0. 2μ1;
[0034] ddH20 补充至 20μ1。
[0035] 重叠 PCR的反应条件为：
[0037]所得PCR产物经琼脂凝胶电泳，胶回收目的基因片段，并置于_20°C保存。
[0038] Xba I和BamH頂每切IGFBP3-TEV片段的酶切温度为37°C，酶切的时间为lh。
[0039] Xba I和BamH頂每切pUC57-simple载体的酶切温度为37°C，酶切的时间为lh。
[0040] 用T4DNA连接酶连接IGFBP3-TEV片段和pUC57-simple载体，反应体系在水浴锅中 16°C过夜连接。
[0041 ]经过连接的质粒转化入大肠杆菌DH5a中，以氨苄青霉素筛选阳性克隆。以菌落PCR 法进行验证。
[0042] 本发明实验结果表明，采用pUC57-Simple载体对IGFBP3融合蛋白进行表达可获得 较大的表达量。
[0043]本发明还提供了一种宿主细胞，其被本发明提供的表达载体转染。
[0044]作为优选，宿主细胞为293f细胞。
[0045] 作为优选，转染的条件具体为:采用无血清DMEM培养基，室温静置15~30min。优选 的，室温为l〇°C~30°C。
[0046] 本发明还提供了一种融合蛋白的表达方法，以本发明提供的表达载体转染宿主细 胞后培养。
[0047]作为优选，宿主细胞为293f细胞。
[0048] 293f细胞为是转染腺病毒E1A基因的人肾上皮细胞系，多用于瞬时表达系统，其可 高表达转染的蛋白。
[0049] 通常认为，以哺乳动物细胞表达能够知道蛋白质的正确折叠，表达产物在分子结 构、理化特性和生物学功能方面更接近天然蛋白质。但是，哺乳动物细胞表达系统的表达量 却通常较低，本发明通过对宿主细胞、表达载体、表达条件的优化，使得融合蛋白的表达量 大大提高，从而使制备得到的IGFBP3蛋白收率较高，纯度较大。另外，本发明表达融合蛋白 的类型为mFc类型，免疫球蛋白融合蛋白是指在基因水平将目的基因同Ig部分片段基因相 连，并在真核或原核细胞中表达出的具有上述两部分结构域的重组蛋白。据目的蛋白与Ig 不同片断相连，可将其分为二大类:一类为Fab(Fv)融合蛋白；另一类为Fc融合蛋白。
[0050] 作为优选，培养的培养基为含有体积分数为10 %的FBS的DMEM培养基。
[0051 ]作为优选，培养的条件为37°C，C02体积分数为5%。
[0052]作为优选，培养过程中静置培养。
[0053]作为优选，培养的时间为24小时。
[0054]本发明还提供了一种胰岛素样生长因子结合蛋白3的制备方法，以本发明提供的 表达载体转染宿主细胞后培养，培养所得融合蛋白经TEV蛋白酶处理，获得胰岛素样生长因 子结合蛋白3。
[0055] 作为优选，TEV蛋白酶处理具体为使所述融合蛋白经过protein A预装柱后，以含 有TEV蛋白酶的溶液洗脱。
[0056]经过转染的293f细胞经培养后，融合蛋白存在于上清液中。融合蛋白经TEV蛋白酶 处理具体为：利用GE公司的protein A预装柱(HiTrap protein A HP)纯化，样品经protein A预装柱后，加入含有5 % (质量分数)TEV蛋白酶的0.1M，pH3.0的甘氨酸-盐酸洗脱，得到目 的蛋白IGFBP3。
[0057]本发明提供了用于IGFBP3蛋白表达的载体、宿主和表达方法及制备方法，以本发 明提供方法制备的融合蛋白为mFc类型，经检测，经过24h的培养，仍有70 %~80 %的细胞内 存在表达载体。每100万个细胞能够产生20~30yg的IGFBP3蛋白，所得蛋白的纯度大于 90% 〇
【附图说明】
[0058] 图1示琼脂糖凝胶电泳鉴定pUC57-IGFBP3重组子克隆；其中，Ml示5kb DNA marker，条带由上至下依次为5kb，3kb，2kb，lkb，750bp，500bp，250bp，100bp ;M2;^;2kb DNA 111已461'条带由上至下依次为21<:13，11<:13,75(^。，50(^。，25(^。，10(^。；泳道1~47]^1]057-IGFBP3表达载体；
[0059] 图2示细胞培养上清液的SDS-PAGE凝胶电泳；泳道M为蛋白标准品，泳道1为悬浮 293f细胞转染前的培养上清，泳道2为悬浮293f细胞转染后的培养上清；
[0060] 图3示经纯化的IGFBP3蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳;Μ为蛋白标准品。
【具体实施方式】
[0061] 本发明提供了一种表达载体胰岛素样生长因子结合蛋白3的表达方法。，本领域技 术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和 改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及