AGCTT
[0037]化学合成双链该多核苷酸序列，并克隆到高拷贝质粒PMD19-T中，得到含目的基因的克隆载体pMD19-T:ACS-2，将该载体转化宿主菌DH5a种保存。
[0038]按图1所示构建重组表达载体pMD19-T:ACS_2。将重组表达载体pMD19-T:ACS_2转化大肠杆菌E.col iBL21，然后涂布于含有氨苄青霉素的LB平板上，37°C培养，挑取单菌落进行重组质粒鉴定。双酶切、PCR以及基因测序结果均表明成功构建了重组表达载体pMD19-T:ACS-2。将构建的基因工程菌E.coliBL21 (pMD19-T: ACS-2)液体培养至对数期OD值0.8，加入异丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度lmmol/L诱导表达5h，诱导产物SUMO融合蛋白(SUM0-ACS-2)用甲酸酶切后，用RP-HPLC纯化测定单体ACS含量，结果表明2个MMP2酶切序列单体肽串联起来表达，表达量达到I OOmg/L。
[0039]实施例2:8个MMP2酶切序列肽单体串联的ACS-8多肽大肠杆菌表达系统的构建及表达。
[0040]将八个MMP2酶切序列单体Pro-Leu-Gly-Met-Thr-Ser-Glu用甲酸酶酶切位点(Glu-Pro)连接构成8拷贝的串联多肽(56肽)该串联多肽的氨基酸序列如序列表中SEQ IDNO: 5所述，具体如下:
[0041 ] Pro-Leu-Gly-Met-Thr-Ser-Glu-Pro-Leu-Gly-Met-Thr-Ser-Glu-Pro-Leu-Gly-Met-Thr-Ser-Glu-
[0042]171421
[0043]Pro-Leu-Gly-Met-Thr-Ser-Glu-Pro-Leu-Gly-Met-Thr-Ser-Glu-Pro-Leu-Gly-Met-Thr-Ser-Glu
[0044]283542
[0045]Pro-Leu-Gly-Met-Thr-Ser-Glu-Pro-Leu-Gly-Met-Thr-Ser-Glu
[0046]4956
[0047]选择pET28a-hiS-Sumo作为表达载体，根据大肠杆菌偏爱密码子，将56肽的氨基酸序列转化成序列表中SEQ ID NO:6所述的多核苷酸序列，S卩ACS-8:
[0048]
CCGCTTGGTATGACTTCAGATCCGCTTGGTATGACTTCAGATCCGCTTGGTATGACTTCAGATCCGCTTGGTATGAC
TTCAGATCCGCTTGGTATGACTTCAGATCCGCTTGGTATGACTTCAGATCCGCTTGGTATGACTTCAGATCCGCTTG
GTATGACTTCAGAT
[0049]并在该核苷酸序列的5’端加上BamHI酶切位点GGATCC，在3 ’端加上终止密码子TGA和Hind ΙΠ酶切位点AAGCTT，最终设计成如下多核苷酸序列:
[0050]
GGATCCCCGCTTGGTATGACTTCAGATCCGCTTGGTATGACTTCAGATCCGCTTGGTATGACTTCAGATCCGCTTGG
TATGACTTCAGATCCGCTTGGTATGACTTCAGATCCGCTTGGTATGACTTCAGATCCGCTTGGTATGACTTCAGATC
CGCTTGGTATGACTTCAGATAAGCTT
[0051]化学合成双链该多核苷酸序列，并克隆到高拷贝质粒pMD19-T中，得到含目的基因的克隆载体Pmdl9-T:ACS-8，将该载体转化宿主菌DH5a种保存。
[0052]按图1所示构建重组表达载体pMD19-T:ACS-8。将重组表达载体pMD19-T:ACS-8转化大肠杆菌E.col iBL21，然后涂布于含有氨苄青霉素的LB平板上，37°C培养，挑取单菌落进行重组质粒鉴定。双酶切、PCR以及基因测序结果均表明成功构建了重组表达载体pMD19-T:ACS-8。
[0053]将构建的基因工程菌E.coliBL21 (pMD19-T: ACS-8)液体培养至对数期OD值0.8，加入异丙基-β_硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度lmmol/L诱导表达5h，诱导产物SUMO融合蛋白(SUM0-ACS-2)用甲酸酶切后，用RP-HPLC纯化测定单体ACS含量，结果表明8个MMP2酶切序列单体肽串联起来表达，表达量达到500mg/L。
[0054]通过正交实验、电泳分析和HPLC方法，对MMP2酶切序列肽的分离纯化进行了优化研究。细胞破碎的最佳方法及条件为:每克湿菌体悬于3mL I XI3BS(含5%甘油)，冰上放置20分钟，在冰水浴用超生法超生破碎，功率设置为40 %功率破碎4秒，停2秒，40ml的菌悬液共破碎15分钟。12000g离心15分钟，，收集上清液。His-sumo-ACS-8亲和层析最佳条件:上柱量 15mg/mL(凝胶体积)，上柱流速2ml/min，上柱I次，20mM，50mM，10mM，300mM，500mM咪唑浓度梯度洗脱，目的蛋白90 %在300mM咪唑浓度下被洗脱下来，且蛋白纯度达到90 %以上。洗脱体积为5倍的柱体积。在包含目的蛋白的300mM咪唑中缓慢滴加甲酸，直到甲酸的浓度为50%，密闭容器，与70摄氏度中恒温30，之后4摄氏度下12000g离心15分钟，得到含有ACS-8的上清液。在利用反向高效色谱纯化MMP2酶切序列肽，最佳的纯化条件:乙腈浓度15%，三氟乙酸浓度I %，洗脱速度1.5mL/min。
[0055]需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
[0056]以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
【主权项】
1.一种基质金属蛋白酶-MMP2酶切序列的串联多肽，其特征在于，该串联多肽是由2-15个匪P2酶切序列单体肽首尾串联而成的氨基酸序列；所述单体肽序列为:Pro-Leu-Gly-Met-Thr-Ser-Glu，单体肽之间由甲酸的酶切割位点连接，所述切割位点为Glu-Pro。2.根据权利要求1所述的匪P2酶切序列的串联多肽，其特征在于，所述串联多肽是由8个MMP2酶切序列单体肽通过甲酸的酶切位点首尾串联而成的串联多肽。3.根据权利要求1所述的MMP2酶切序列的串联多肽，其特征在于，所述单体肽的氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO:1所述的氨基酸序列。4.一种编码权利要求1所述串联多肽的多核苷酸序列。5.根据权利要求4所述编码串联多肽的多核苷酸序列，其特征在于，所述多核苷酸序列为SEQ ID NO:2。6.—种如权利要求5所述的多核苷酸序列在基因工程重组技术表达生产MMP2酶切序列肽中的应用。7.根据权利要求6所述的多核苷酸序列在基因工程重组技术表达生产MMP2酶切序列肽中的应用，其特征在于，所述表达生产MMP2酶切序列肽的微生物为原核微生物。8.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体含有权利要求4所述的任一种多核苷酸序列。
【专利摘要】本发明提供一种基质金属蛋白酶酶切序列肽、表达载体、多核苷酸序列及应用，所述酶切序列肽是酶切序列的串联多肽，该串联多肽是由2-15个基质金属蛋白酶酶切序列单体肽首尾串联而成的氨基酸序列，所述单体肽为Pro-Leu-Gly-Met-Thr-Ser-Glu，单体肽之间由甲酸的切割位点(Glu-Pro)连接起来。本发明的多核苷酸序列为编码本发明的串联多肽的核苷酸序列。本发明成功实现了小分子基质金属蛋白酶酶切序列肽在微生物工程菌中的高效表达，制得的基质金属蛋白酶酶切序列肽为其在科学研究相关产品及药物等产品的市场化提供了技术支持。
【IPC分类】C12N15/70, C07K7/08, C07K14/00, C12N15/11
【公开号】CN105541969
【申请号】CN201511005664
【发明人】余继刚, 宋瑞, 李珂, 汤伟强, 李坤, 陈雷
【申请人】合肥安德生制药有限公司
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2015年12月28日