为横坐标，以值为纵坐标的标准曲线。扩增完毕后，进行熔解曲线的分析，95°〇11^11，55111^11，以0.5°C/sec的速度逐渐升温到95°C进行熔解曲线的测定，并在此升温过程中进行荧光强度的连续检测。对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析特异性。18S除退火温度为58°C外，其余条件均相同。
[0023]步骤四、云南地方鸡的肌肉生长抑制特性进行判断
[0024]通过检测MSTN基因在鸡肌肉组织的组织表达谱，来对云南地方鸡种的肌肉生长抑制特性进行判断。
[0025]本发明的有益效果:
[0026]1、本发明采用基因芯片技术和生物信息学分析方法，在对武定鸡和微型鸡肌肉组织的基因表达谱研究中发现MSTN基因参与抑制肌肉生成过程，并首次从鸡的肌肉组织中克隆了 MSTN基因。因此，研究鸡MSTN基因的序列与表达模式，从分子水平了解抑制肌肉生成的特点，为进一步研究该基因的功能及为改善武定鸡肌肉品质和育种工作提供理论基础。
[0027]2、本发明还提供了一种利用MSTN基因在鸡肌肉组织的组织表达谱判断云南地方鸡的肉用性状的方法，作为肌肉生长抑制MSTN基因在云南地方鸡作为肌肉生长抑制特性的分子遗传标记的应用，对肌肉生长抑制素MSTN基因设计引物，进行PCR扩增，通过检测MSTN基因在鸡肌肉组织的组织表达谱，来对云南地方鸡种的肌肉生长抑制特性进行判断，探讨微型鸡、武定鸡生长发育的的规律，对于云南本土鸡种的保种、开发利用，尤其是来加快其生产性能提供理论参考。
【附图说明】
[0028]图1是本发明的PCR扩增MSTN基因图示；
[0029]图2是本发明的18S PCR扩增MSTN基因图示；
[0030]图3是本发明的MSTN基因在胸肌的表达；
[0031]图4是本发明的MSTN基因在腿肌的表达。
【具体实施方式】
[0032]下面将结合本发明实施例和附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0033]实施例1
[0034]一种肌肉生长抑制MSTN基因，是从武定鸡肌肉组织中分离、克隆的与肌肉生成相关的肌肉生长抑制素(Myostatin，MSTN)基因，武定鸡的MSTN基因由3个外显子和2个内含子组成，外显子1、2、3分别为373bp、374bp和1567bp，2个内含子分别为2094bp和2269bp。
[0035]对上述特征的肌肉生长抑制素MSTN基因设计引物，进行PCR扩增，检测MSTN基因在鸡肌肉组织的组织表达谱，结果显示MSTN基因在肌肉组织中高量表达，初步表明MSTN基因在肌细胞中调控肌肉生成的功能。
[0036]1、肌肉组织中总RNA的提取
[0037]前处理:提取RNA之前，先消除器皿及溶液中可能存在的RNA酶。所用的塑料器皿的消毒:一次性塑料器皿，在灭菌锅内高压处理15?20min。非一次性塑料器皿，先用清洁剂洗干净，再用0.1M NaOHamM EDTA第一次冲冼，无RNA酶水第二次冲冼;镊子、剪刀及以后要用的玻璃器皿的消毒:将镊子、剪刀及玻璃器皿置于中180°C烘烤5h以上；电泳槽的消毒:先用清洁液洗干净，在0.1 %的DEPC水中浸泡过夜后干燥。
[0038]提取:取60-100mg冷冻保存的脂肪或肌肉组织于研磨器内，加入Iml的Trizol试剂中低温条件下进行匀浆。匀浆后的混合液转移到1.5ml的离心管中，在2?8°C温度条件下12000rpm离心lOmin，使核蛋白质复合体充分分离。然后将上清液移入一个干净的离心管中。加入0.2ml的氯仿后，压紧管盖剧烈振荡15sec，常温静置3?5min后，2?8°CI100rpm再离心15min。可见液体分三层。将上层清液移入1.5ml的离心管，加入0.5ml的异丙醇混勾后，常温静置孵育1min，在2?8°C1 100rpm离心1min，沉淀RNA。倒掉上清液，最后用75 %的酒精7500rpm离心5min以洗涤RNA沉淀，并重复该步骤一次。倒掉上清液后，将离心管于室温凉干15?30min，干燥RNA沉淀，加入30-50μ1无RNase的DEPC处理水，使RNA溶解完全，并立即保存于-80°C超低温冰箱中待用。
[0039]2、cDNA 第一链的合成(RT-PCR)
[0040]采用北京天根生物工程技术服务有限公司提供的试剂盒进行反转录合成cDNA。其步骤为:在已灭菌无核酸酶的的PCR管中加入1.5yg的总RNA，加入浓度为0.5ygAU Oligo(dT)182yl随机引物和2μ1 dNTP，补无菌水(RNase-free ddH20)至14μ1。轻轻混匀离心3?5sec后，将反应混合物于70°C加热5min后迅速在冰上冷却2min后，简短离心5_8sec收集反应液加入4μ1 5 XFirst-Strand Buffer、Ιμ? 0.1M DTT。最后加入Ιμ?(200U)TIANScriptM-MLV，使混合液的终体积为20μ1，混匀；将总反应体系置于PCR仪中，42°C孵育50min，90°C加热5min终止反应，结束后或置冰上进行后续实验或冷冻保存。
[0041 ] 3、PCR引物设计及PCR反应条件
[0042]参照GenBank(http://www.ncbi.nIm.nih.gov)公开发表的MSTN基因全长序列和禽18s核苷酸序列运用Pr imer5.0软件进行引物设计，并由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。MSTN基因和18S的产物长度分别为176bp和148bp，引物序列如下:
[0043]MSTN基因引物序列:
[0044]上游:5，GCTTTT GAT GAG ACT GGA CGA G_3，
[0045]下游:5’AGCGGG TAG CGA CAA CAT C_3’
[0046]18S基因的引物序列:
[0047]上游:5，-CGCGTG CAT TTA TCA GAC CA-3’
[0048]下游:5，-ACCCGT GGT CAC CAT GGT A_3’
[0049]MSTN基因克隆的PCR反应条件为:在PCR管内依次加入cDNA模板1.Ομ?，10 X反应缓冲液(buffer)2.0yl，Mg2+0.5yl dNTPs( 10mM)0.5μ1，正、反引物混合(1mM ) I.Ομ?，Taq酶
0.5μ1，补去离子水至25μ1的反应总体积，置于PCR仪上，95°C预变性1min，94°C变性45sec，Tm(54°C-64°C, Grad = 10)退火 45sec，7 2°C 延伸 lmin，共 35 个循环，最后 72°C 再延伸 8min，反应结束后，用琼脂凝胶电泳来分析扩增结果，用DNA marker来判断扩增片段的大小，用以确定MSTN基因的退火温度即最佳反应条件。
[0050]经最佳反应条件扩增的PCR产物，用1%琼脂糖凝胶进行电泳，如产物在凝胶成像系统中目的带明亮清晰，则可用于胶回收及后续实验。
[0051 ]荧光定量PCR的反应条件为:在80°C检测荧光，测定吸光值，得到以循环数为横坐标、吸光值为纵坐标的荧光定量PCR扩增动力学曲线和以标准品拷贝数的对数值为横坐标，以值为纵坐标的标准曲线。扩增完毕后，进行熔解曲线的分析，95°〇11^11，55111^11，以0.5°C/sec的速度逐渐升温到95°C进行熔解曲线的测定，并在此升温过程中进行荧光强度的连续检测。对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析特异性。18S除退火温度为58°C外，其余条件均相同。
[0052]步骤四、云南地方鸡的肌肉生长抑制特性进行判断
[0053 ] 通过检测MSTN基因在鸡肌肉组织的组织表达谱，来对云南地方鸡种的肌肉生长抑制特性进行判断。
[0054]实施例2
[0055]在实施例1的基础上，肌肉生长抑制MSTN基因在云南地方鸡作为武定鸡肌肉生长抑制特性的分子遗传标记的应用，提取待测样本的鸡基因组DNA，经特