异性引物扩增得到MSTN基因目的片段，对肌肉生长抑制素MSTN基因设计引物，进行PCR扩增，通过检测MSTN基因在鸡肌肉组织的组织表达谱，根据图谱中条带的数量和大小对待测样本体重增长的快慢进行判断。
[0056]实施例3
[0057]作为MSTN基因设计的应用，由于MSTN基因是控制肌肉器官的大小的调控因子，为了满足人类的需求，获取更高的胴体率，根据双肌形成机理，利用基因敲除技术控制MSTN基因的表达;利用基因重组技术获得MSTN基因缺失的鸡;使用能与MSTN结合的物质，拮抗该基因的功能；筛选或选择MSTN的抗体或抑制剂，与其结合，灭其功能。都可以达到获取更高生产性能的鸡。
[0058]本发明提供一种肌肉生长抑制MSTN基因及其在云南土鸡选育中的应用，采用基因芯片技术和生物信息学分析方法，在对武定鸡和微型鸡肌肉组织的基因表达谱研究中发现MSTN基因参与抑制肌肉生成过程，通过对云南本土的微型鸡、武定鸡的MSTN基因进行测序，首次从鸡的肌肉组织中克隆了MSTN基因，使用分子生物学手段研究MSTN基因的表达量与生长性能、屠宰性能的调控规律，探讨微型鸡、武定鸡生长发育的的规律，对于云南本土鸡种的保种、开发利用，尤其是来加快其生产性能提供理论参考。
[0059]最终，以上实施例和附图仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
【主权项】
1.一种肌肉生长抑制MSTN基因，其特征在于:是从武定鸡肌肉组织中分离、克隆的与肌肉生成相关的肌肉生长抑制素(Myostatin，MSTN)基因，武定鸡的MSTN基因由3个外显子和2个内含子组成，外显子1、2、3分别为373bp、374bp和1567bp，2个内含子分别为2094bp和2269bp02.肌肉生长抑制MSTN基因在云南地方鸡作为武定鸡肌肉生长抑制特性的分子遗传标记的应用。3.—种利用MSTN基因在鸡肌肉组织的组织表达谱判断云南地方鸡的肉用性状的方法，其特征在于，具体包括以下步骤: 步骤一、肌肉组织中总RNA的提取 1)前处理:提取RNA之前，先消除器皿及溶液中可能存在的RNA酶，对所用的塑料器皿的消毒:一次性塑料器皿，在灭菌锅内高压处理15?20min;非一次性塑料器皿，先用清洁剂洗干净，再用0.1M NaOHamM EDTA第一次冲冼，无RNA酶水第二次冲冼;镊子、剪刀及以后要用的玻璃器皿的消毒:将镊子、剪刀及玻璃器皿置于中180°C烘烤5h以上；电泳槽的消毒:先用清洁液洗干净，在0.1 %的DEPC水中浸泡过夜后干燥； 2)提取: a.取60-100mg冷冻保存的脂肪或肌肉组织于研磨器内，加入Iml的Trizol试剂中低温条件下进行匀浆，匀浆后的混合液转移到1.5ml的离心管中，在2?8°C温度条件下12000rpm离心I Omin，使核蛋白质复合体充分分离； b.将上清液移入一个干净的离心管中，加入0.2ml的氯仿后，压紧管盖剧烈振荡15sec，常温静置3?5min后，2?8°C1 100rpm再离心15min，可见液体分三层；将上层清液移入1.5ml的离心管，加入0.5ml的异丙醇混勾后，常温静置孵育1min，在2?8°CI 100rpm离心1min，沉淀RNA，倒掉上清液，最后用75 %的酒精7500rpm离心5min以洗涤RNA沉淀，并重复该步骤一次； c.倒掉上清液后，将离心管于室温凉干15?30min，干燥RNA沉淀，加入30-50μ1无RNase的DEPC处理水，使RNA溶解完全，并立即保存于-80°C超低温冰箱中待用； 步骤二、cDNA第一链的合成 a.采用北京天根生物工程技术服务有限公司提供的试剂盒进行反转录合成cDNA，其步骤为:在已灭菌无核酸酶的的PCR管中加入1.5yg的总RNA，加入浓度为0.5yg/y I OI i go、18 2μ?随机引物和2μ1 dNTP，补无菌水至14μ1; b.轻轻混勾离心3?5sec后，将反应混合物于70°C加热5min后迅速在冰上冷却2min后，简短离心5_8sec收集反应液加入4μ1 5 XFirst-Strand Buffer、1μ1 0.1M DTT;最后加入Iμ? TIANScript M-MLV，使混合液的终体积为20μ1，混匀； c.将总反应体系置于PCR仪中，42°C孵育50min，90°C加热5min终止反应，结束后或置冰上或冷冻保存； 步骤三、PCR引物设计及PCR反应条件 进行引物设计，其MSTN基因和18S的产物长度分别为176bp和148bp，引物序列如下: MSTN基因引物序列: 上游:5’GCT TTT GAT GAG ACT GGA CGA G_3’ 下游:5’AGC GGG TAG CGA CAA CAT C_3’ 18S基因的引物序列: 上游:5，-CGC GTG CAT TTA TCA GAC CA-3， 下游:5’-ACC CGT GGT CAC CAT GGT A_3’ MSTN基因克隆的PCR反应条件为:在PCR管内依次加入cDNA模板1.Ομ?，10 X反应缓冲液2.Ομ? ,Mg2+0.5μ1，dNTPs 0.5μ1，正、反引物混合I.Ομ?，Taq酶0.5μ1，补去离子水至25μ1 的反应总体积，置于 PCR 仪上，95°C 预变性 1min，94°C 变性 45sec，Tm( 54°C_64°C，Grad = 10)退火45sec，72°C延伸lmin，共35个循环，最后72°C再延伸8min; 荧光定量PCR的反应条件为:在80°C检测荧光，测定吸光值，得到以循环数为横坐标、吸光值为纵坐标的荧光定量PCR扩增动力学曲线和以标准品拷贝数的对数值为横坐标，Ct值为纵坐标的标准曲线，扩增完毕后，进行熔解曲线的分析，95°Clmin，55°Clmin，以0.5°C/sec的速度逐渐升温到95°C进行熔解曲线的测定，并在此升温过程中进行荧光强度的连续检测，对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析特异性；18S除退火温度为58°C外，其余条件均相同； 步骤四、云南地方鸡的肌肉生长抑制特性进行判断 通过检测MSTN基因在鸡肌肉组织的组织表达谱，根据表达图谱来对云南地方鸡种的肌肉生长抑制特性进行判断。4.根据权利要求3所述的一种利用MSTN基因在鸡肌肉组织的组织表达谱判断云南地方鸡的肉用性状的方法，其特征在于:在步骤三PCR引物设计及PCR反应条件时，MSTN基因克隆的PCR反应结束后，用琼脂凝胶电泳来分析扩增结果，用DNA marker来判断扩增片段的大小，确定MSTN基因的退火温度即最佳反应条件，并将经最佳反应条件扩增的PCR产物，用I %琼脂糖凝胶进行电泳，胶回收在凝胶成像系统中明亮清晰的目的带。5.根据权利要求1所述的肌肉生长抑制MSTN基因的应用，其特征在于:利用基因敲除技术控制MSTN基因的表达或利用基因重组技术获得MSTN基因缺失的鸡，获取更高生产性能的鸡的方法。
【专利摘要】本发明涉及动物分子育种的基因工程技术，特别是一种与鸡肉生成相关的肌肉生长抑制素（Myostatin,MSTN）基因及其在云南土鸡选育中的应用。本发明提供一种肌肉生长抑制MSTN基因及其在云南土鸡选育中的应用，采用基因芯片技术和生物信息学分析方法，在对武定鸡和微型鸡肌肉组织的基因表达谱研究中发现MSTN基因参与抑制肌肉生成过程，通过对云南本土的微型鸡、武定鸡的MSTN基因进行测序，首次从鸡的肌肉组织中克隆了MSTN基因，使用分子生物学手段研究MSTN基因的表达量与生长性能、屠宰性能的调控规律，探讨微型鸡、武定鸡生长发育的规律，对于云南本土鸡种的保种、开发利用，尤其是来加快其生产性能提供理论参考。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/12
【公开号】CN105543233
【申请号】CN201511018837
【发明人】李琦华, 赵筱, 谷大海, 李正田, 徐志强, 曹振辉, 荣华, 黄英, 张彦华, 刘丽仙, 豆腾飞, 程志斌, 佟荟全, 胡文元, 贾俊静, 葛长荣
【申请人】云南农业大学
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2015年12月29日