11"聚苯乙締板中，37°(3、200巧111培养过夜，约14}1， 将过夜培养的产物用8通道的移液器W4%的接种量转接至300化的新鲜LB液体培养基中， 37°C、200巧m培养2.5 h，然后加入终浓度为0.1 mmol/L的IPTG，30°C、200 rpm诱导8 h，得 到诱导后的菌液，备用； 步骤二、菌体的碱裂解:将步骤一所得诱导后的菌液置于8000 g离屯、1 min,去上清后， 将菌体重悬于300化的100 mmol/L、pH8.0的憐酸盐缓冲液，加入1化溶度为Img/mL的 Dnase水溶液后縱满振荡，加入50化Imol/L的化0H水溶液裂解细胞，振荡30 S混匀后静置 2 min,然后加入50 μL Imol/L K出P化水溶液进行中和;混匀后置于11000 g离屯、10 min,收 集上清液，收集到的上清液即为CPC乙酷化酶粗液； 步骤Ξ、7-ACA含量标准曲线的制作： 用0.1 mol/L、p册.0的憐酸缓冲液配制终浓度为1.5 mg/mL的7-ACA，用1 mol/L的NaOH 调抑至8.0,分别取0、1、2、4、6、8、12、16、20化的7-4〔4于离屯、管中，再用0.111101/1、抑8.0 的憐酸缓冲液补足到20 yL，向管中加入20 μL 13°C预热3 min的CPC，混匀，13°C水浴10 min后加入5倍体积的终止液，混匀后12000 rpm离屯、3 min,取200化的上清与40化的显色 剂显色，室溫静置10 min后取200化测405皿的吸光值，W0号为空白对照，W7-ACA的含量 为纵坐标、0D405为横坐标制作标准曲线，如图1所示，并求出回归方程。
[0016]步骤四、7-ACA高通量的快速定量:用0.1 mol/L的憐酸缓冲液配制20 g/L的CPC底 物，用1 mol/L的化0H调节pH至8.0,取20化底物与20化稀释适当倍数的粗酶液于96孔板 中混匀，13°C解育10 min,得到混合物B;向混合物B中加入体积为混合物B体积5倍的终止 液进行终止反应，12000 rpm离屯、3 min,取200化的上清与40化的显色剂显色，室溫反应 10 min后取200化利用96孔板在酶标仪上快速测定405 nm的吸光值，进而用EXC化计算出 各个突变体在低溫下的酶活，从突变文库中成功筛选到了两个在13°C下催化活性明显高于 原酶的突变体P-166和P-835,同时也筛选到了一个没有活性的突变体P-254。利用改进的酶 活检测方法对P-166、P-254和P-835的活性重复测定了 6次，结果显示6次测定的结果重复性 较好，每组试验的误差均小于0.5%。
[0017]步骤五、将化 21/pET32a、化 21/pET32a-服 6、P-166、P-254及 P-835 的产物一并进行 SDS-PAGE分析，结果如图2所示。图2显示，重组子化21/pET3^i和未经诱导的化21/pET32a- HG6未出现目的条带；而经过诱导的化21/pET32a-HG6、P-166和P-835的产物均有可溶性表 达，且形成了明显的大小亚基，Quantity One软件估算出大亚基的表观分子量为60 kDa，小 亚基的表观分子量为40 kDa，同时还有部分表观分子量为100 W)a的前体;而P-254的产物 只有表观分子量为100 kDa的前体，运也进一步说明了酶活测定方法的准确性。
[001引所述终止液，由质量百分比浓度为20%的乙酸水溶液与0.05 mol/L的NaOH水溶液 按体积比2:1的比例混匀； 所述显色剂，用甲醇配制的质量百分比浓度为0.5%的二甲氨基苯甲醒。
[0019] 实施例2 一种基于DAB显色的低溫CPC乙酷化酶高通量筛选的方法，包括如下步骤： 步骤一、CPC乙酷化酶的高通量表达:从抱菌素 C乙酷化酶饱和突变的突变文库中挑选 单菌落的突变子接种至装有含有浓度为100 yg/mL氨节青霉素的200化LB培养基的无菌 聚苯乙締板中，置于37°C下、200 rpm培养过夜;将过夜培养的产物用移液器接种到300 μL 的LB液体培养基中，接种量为300化的LB液体培养基体积的4%;然后，置于37°C下、200 rpm 培养2.5 h，最后加入终浓度为0.1 mmol/L的IPTG水溶液，置于30°C下、200巧m培养8 h，得 到诱导后的菌液，备用； 步骤二、菌体的碱裂解:将步骤一所得诱导后的菌液置于8000 g离屯、1 min,去上清后， 将菌体重悬于300化的100 mmol/L、pH8.0的憐酸盐缓冲液，加入1化溶度为Img/mL的 Dnase水溶液后縱满振荡，加入50化Imol/L的化0H水溶液裂解细胞，振荡30 S混匀后静置 2 min,然后加入50 μL Imol/L K出P化水溶液进行中和;混匀后置于11000 g离屯、10 min,收 集上清液，收集到的上清液即为CPC乙酷化酶粗液； 步骤S、7-ACA含量标准曲线的制作：用0.1 mol/L、p册.0的憐酸缓冲液配制终浓度为 1.5 mg/血的7-ACA，用1 mo 1/L的化0H水溶液调抑值至8.0，分别取0、1、2、4、6、8、12、16和20 化的7-ACA于离屯、管中，再用0.1mol/L、p册.0的憐酸缓冲液补足到20化，向离屯、管中加入 20 μL 13°C预热3 min的CPC乙酷化酶，混匀，得到混合物A，将混合物A置于13°C水浴10 min 后，加入体积为混合物A体积5倍的终止液，混匀后12000巧m离屯、3 min,取200 yL的上清与 40化的显色剂显色，室溫静置10 min后取200化测405皿的吸光值，W0号为空白对照，W 7-ACA的含量为纵坐标、405 nm的吸光值为横坐标制作标准曲线，并求出回归方程； 步骤四、7-ACA高通量的快速定量:用0.1 mol/L的憐酸缓冲液配制20 g/L的头抱菌素 C 作为底物，用1 mol/L的NaOH水溶液调节抑至8.0,取20化底物与20化稀释后的CPC乙酷化 酶粗液于96孔板中混匀，13°C解育10 min,得到混合物B;向混合物B中加入体积为混合物B 体积5倍的终止液进行终止反应，12000 rpm离屯、3 min,取200化的上清与40化的显色剂 显色，室溫反应10 min后取200化利用96孔板在酶标仪上测405 nm的吸光值； 步骤五、CPC乙酷化酶活性的计算在测定条件下每分钟产生1 μπιο? 7-ACA所需的酶 量定义为一个酶活单位(IU);进而用EXCEL计算出各个突变体在低溫下的酶活； 所述终止液，由质量百分比浓度为20%的乙酸水溶液与0.05 mol/L的化0H水溶液按体 积比2:1的比例混匀； 所述显色剂，用甲醇配制的质量百分比浓度为0.5%的二甲氨基苯甲醒。
[0020] 所述移液器为16通道的移液器。
[0021] 所述聚苯乙締板为96孔透明聚苯乙締微孔板。
【主权项】
1. 一种基于DAB显色的低温CPC乙酰化酶高通量筛选的方法，其特征在于：基于对二甲 氨基苯甲醛与7-ACA的复合物在405nm有最大吸收峰的原理，采用无菌的96孔板对重组菌进 行低温低浓度诱导剂诱导表达，以稀碱溶液进行菌体裂解后利用磷酸二氢钠中和，然后再 以96孔板进行底物的水解，经二甲氨基苯甲醛显色后利用酶标仪进行产物的快速定量，进 而实现CPC乙酰化酶突变体的高通量筛选。2. 权利要求1所述的基于DAB显色的低温CPC乙酰化酶高通量筛选的方法，其特征在于： 包括以下步骤： 步骤一、CPC乙酰化酶的高通量表达:从孢菌素 C乙酰化酶饱和突变的突变文库中挑选 单菌落的突变子接种至装有含有浓度为100 yg/mL氨苄青霉素的200 yL LB培养基的无菌 聚苯乙烯板中，置于37°C下、200 rpm培养过夜;将过夜培养的产物用移液器接种到300 yL 的LB液体培养基中，接种量为300 yL的LB液体培养基体积的4%;然后，置于37°C下、200 rpm 培养2.5 h，最后加入终浓度为0.1 mmol/L的IPTG水溶液，置于30°C下、200 rpm培养8 h，得 到诱导后的菌液，备用； 步骤二、菌体的碱裂解:将步骤一所得诱导后的菌液置于8000 g离心1 min，去上清后， 将菌体重悬于300以1^的100 111111〇1/1、？!18.0的磷酸盐缓冲液，加入1以1^溶度为111^/1^的 Dnase水溶液后漩涡振荡，加入50 yL lmol/L的NaOH水溶液裂解细胞，振荡30 s混匀后静置 2 min，然后加入50 yL lmol/L KH2PO4水溶液进行中和;混勾后置于11000 g离心10 min，收 集上清液，收集到的上清液即为CPC乙酰化酶粗液； 步骤三、7-ACA含量标准曲线的制作：用0.1 mol/L、pH8.0的磷酸缓冲液配制终浓度为 1.5 mg/mL的7-ACA，用 1 mol/L的NaOH调pH值至8.0,分别取0、1、2、4、6、8、12、16和20以1^勺 7-ACA于离心管中，再用0. lmol/L、pH8.0的磷酸缓冲液补足到20 yL，向离心管中加入20 yL 13°C预热3 min的CPC乙酰化酶，混匀，得到混合物A，将混合物A置于13°C水浴10 min后，加 入体积为混合物A体积5倍的终止液，混匀后12000 rpm离心3 min，取200 yL的上清与40 yL 的显色剂显色，室温静置10 min后取200 yU则405 nm的吸光值，以0号为空白对照，以7-ACA 的含量为纵坐标、40 5 nm的吸光值为横坐标制作标准曲线，并求出回归方程； 步骤四、7-ACA高通量的快速定量:用0.1 mol/L的磷酸缓冲液配制20 g/L的头孢菌素 C 作为底物，用1 mol/L的NaOH水溶液调节pH至8.0,取20 yL底物与20 yL稀释后的CPC乙酰化 酶粗液于96孔板中混匀，13°C孵育10 min，得到混合物B;向混合物B中加入体积为混合物B 体积5倍的终止液进行终止反应，12000 rpm离心3 min，取200 yL的上清与40 yL的显色剂 显色，室温反应10 min后取200 yL，利用96孔板在酶标仪上测405 nm的吸光值； 步骤五、CPC乙酰化酶活性的计算：以在测定条件下每分钟产生1 μπιο? 7-ACA所需的酶 量定义为一个酶活单位;进而计算出各个突变体在低温下的酶活； 所述终止液，由质量百分比浓度为20%的乙酸水溶液与0.05 mol/L的NaOH水溶液按体 积比2:1的比例混匀； 所述显色剂，用甲醇配制的质量百分比浓度为0.5%的二甲氨基苯甲醛。3. 如权利要求2所述的基于DAB显色的低温CPC乙酰化酶高通量筛选的方法，其特征在 于:所述聚苯乙稀板为Nunc TM 96 DeepWellTM聚苯乙稀板。4. 如权利要求2所述的基于DAB显色的低温CPC乙酰化酶高通量筛选的方法，其特征在 于:所述移液器为8通道的移液器。
【专利摘要】一种基于DAB显色的低温CPC乙酰化酶高通量筛选的方法，该方法基于对二甲氨基苯甲醛与7-ACA的复合物在405nm有最大吸收峰的原理，采用无菌的96孔板对重组菌进行低温低浓度诱导剂诱导表达，以稀碱溶液进行菌体裂解后利用磷酸二氢钠中和，然后再以96孔板进行底物的水解，经p-DAB显色后利用酶标仪进行产物的快速定量，进而实现CPC乙酰化酶突变体的高通量筛选。该方法具有筛选快速、操作简便、筛选通量大及准确度高等优点，能够加快CPC乙酰化酶改造的速度，有巨大的应用潜力和经济价值。
【IPC分类】C12Q1/32
【公开号】CN105543332
【申请号】CN201610002076
【发明人】唐存多, 史红玲, 阚云超, 姚伦广, 唐青海, 焦铸锦, 史鸿飞, 周军事, 马晨露
【申请人】南阳师范学院
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2016年1月6日