用于高通量测序的dna建库方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及用于高通量测序的DNA建库方法，特别是用于高通量测序的cfDNA建库 方法。
【背景技术】
[0002] 恶性肿瘤是威胁人类健康的主要疾病之一，也是全球发病和死亡的主要原因。根 据世界卫生组织公布的数据表明，2012年约有1400万新发癌症病例和820万例癌症相关死 亡。根据全国肿瘤登记中心发布的2012年数据，中国每年新增病例约350万，约占全球发病 的五分之一；癌症死亡人数约为250万，约占全球癌症死亡人数的四分之一。尽管我国在肿 瘤的手术、化学药物治疗、放射治疗和生物治疗技术上都取得了很大的进展，但人口基数大 使我国成为世界上癌症死亡数最高的国家。
[0003] 肿瘤本质上是基因病。肿瘤的发生、发展、转移、恶化都与基因突变有着密切联系。 肿瘤的发生是各种环境的和遗传的致癌因素引起的基因突变和多种突变长期积累的结果。 突变的发生和积累导致了原癌基因的激活和抑癌基因的失活，引起DNA损伤修复和/或细胞 周期和/或编程性死亡机制的失调，继而引起细胞的转化。转化的细胞在与正常体细胞生存 竞争的过程中，不断进化，最终变成具有无限增殖潜力的癌细胞，从而导致肿瘤的发生。在 癌细胞成克隆性的无限扩增过程中，其中一些克隆会获得新的附加突变，选择性地形成具 有不同特点的亚克隆(异质化），从而获得浸润和转移的能力。近年来，随着医药科学技术的 不断发展，以及"精准医学"概念的提出，癌症的治疗观念正在发生着由非特异性向个体化 的根本性转变。更有益于节省费用、减少对病人的毒副作用和提高疗效。
[0004] 高通量测序技术的兴起以及测序成本的大幅降低为个体化医疗的实现提供了极 大的便利。通过对癌症患者活检样本提取的DNA进行文库的构建，测序及生物信息分析就可 快速得出患者的准确突变信息。根据突变信息对患者进行分组，提供针对性的治疗及疗效 评估。高通量测序技术中文库的构建一般分为DNA的随机打断、末端修复、接头连接、连上接 头的DNA片段的PCR扩增及质控。Ion AmpliSeq技术是目前较为先进的与半导体测序相配套 的建库技术，该技术通过超高多重PCR，可以在短时间内同时扩增几千种PCR片段、分析几百 个基因，使用Ion AmpliSeq Library Kit 2.0可以利用低至10ng的样品成功建库并用于高 通量测序。然而，对血浆cfDNA进行高通量测序时，由于血浆中cfDNA含量很低，可获得的 cfDNA量极少，尤其是在可取血量较少时，所提取的cfDNA常常无法达到10ng，因此，需要开 发一种可利用较少血液来建库的方法。
【发明内容】
[0005] 本发明提供了一种用于高通量测序的DNA建库方法，特别是用于高通量测序的 cfDNA建库方法，该DNA建库方法可以降低初始DNA的用量，利用较少的DNA成功建库，以通过 高通量测序对DNA进行分析。本发明的DNA建库方法可以利用低至lng的DNA样品进行建库以 进行高通量测序。
[0006] 本发明的用于高通量测序的DNA建库方法，是在Ion AmpliSeq Library Kit 2.0 的建库方法基础上，对PCR扩增条件和试剂使用量进行了优化，其具体步骤如下：
[0007] 1)多重PCR
[0008]将分离纯化的DNA进行多重PCR扩增，反应体系为： 5X Ion AmpliSeq HiFi Master Mix 2 μL
[0009] 5X Ion AmpliSeq Primer Pool 2 μL DNA x ul t 无核酸水 （6-χ)μ1
[0010] 总体积 10μ1
[0011] 多重PCR反应条件为:99°C保持2min，然后进行23个循环，每个循环为99°C15s、60 ?€411^11，然后保持在10°(：;
[0012] 2)引物部分裂解
[0013] 将ΙμL FuPa Reagent加入到步骤1)得到的PCR产物中混匀后，在PCR仪中依次按下 述条件运行:50°(：1011^11，55°(：101^11，60 1€201^11，然后保持在10°(：;
[00M] 3)接头的连接和纯化
[0015] 向步骤2)得到的反应产物中加入2μ1的7· 5X Switch Solution、ΙμL的Barcode Adapter、ΙμL DNA Ligase，在PCR仪中依次按下述条件运行：22°C30min，72°C 10min，然后保 持在l〇°C;
[0016] 向上述反应产物中加入22·5μ1 Agencourt AMPure XP混匀后室温孵育5min，置于 磁力架上，溶液澄清后弃尽上清，使用200μ1新鲜的70 %乙醇清洗磁珠两次，分别弃掉上清， 短暂离心后放回磁力架上，吸尽残余液体，室温干燥5分钟后，分别加入25yL的Platinum PCR SuperMix High Fidelity和lyL的Library Amplification Primer，混勾后，重新放回 磁力架，待溶液澄清后，取上清；
[0017] 4)扩增以及扩增后纯化
[0018]将步骤3)中获得的上清按照以下反应条件进行扩增:在98°C保持2min，然后进行7 个循环，每个循环为98°C 15s、60°C lmin，然后保持在在10°C ;
[0019] 在扩增产物中加入30μ1 Agencourt AMPure XP，混匀，室温放置5min后，置于磁力 架上，直到溶液澄清后，弃掉上清，使用200μ1新鲜的70 %乙醇清洗磁珠两次，分别弃掉上 清，短暂离心后放回磁力架上，吸尽残余液体，室温干燥5分钟。
[0020]在进一步的实施方案中，将在上述步骤4)中获得干燥产物中加入20μ1的无核酸水 进行洗脱，混匀后放到磁力架上，溶液澄清后，取上清，进一步进行文库浓度的测定以及质 控。
[0021 ]在优选的实施方案中，所述DNA是cfDNA。在更优选的实施方案中，所述cfDNA是血 浆cfDNA。
[0022]本发明方法中所使用的试剂可以商购获得，例如，一些来自于可以商购获得的Ion AmpliSeq Library Kit 2.0(Life Technology)，例如5X Ion AmpliSeq HiFi Master Mix、FuPa Reagent、7.5X Switch Solution、Barcode Adapter、DNA Ligase、Platinum PCR SuperMix High Fidelity、Library Amplification Primer由Ion AmpliSeq Library Kit 2.0(Life Technology)提供;一些可以通过其它途径商购获得。
[0023] 本发明中，所使用的5X Ion AmpliSeq Primer Pool可以通过商购获得(例如来自 Life Technology)，是用于多重PCR的引物集合。
[0024] 本发明中，所使用的Agencourt AMPure XP可以通过商购获得（例如来自 Beckman)，是用于分离DNA片段的磁珠试剂。
[0025] 本发明中，所述DNA可以是任何DNA，特别可以是cfDNA。所述cfDNA是指细胞游离 DNA，即游离于细胞外的DNA，特别是指外周血中的细胞游离DNA。外周血中的细胞游离DNA可 能含有宿主基因组DNA、循环肿瘤DNA(ctDNA)(如果存在的话）、和/或胎儿DNA(如果存在的 话)。
[0026] 本发明的DNA建库方法在Ion AmpliSeq Library Kit 2.0的建库方法基础上优化 了试剂使用量和PCR扩增条件，节约反应消耗，使扩增的特异性更高且起始DNA量更低，甚至 低至lng。
【附图说明】
[0027]图1是实施例的建库质控结果。
[0028]图2是对照例的建库质控结果。 实施例
[0029] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面结合具体实施例并参照 附图，对本发明进一步详细说明。应该理解，这些描述只是示例性的，而并非要限制本发明 的范围。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本发 明的概念。
[0030] 下述实施例和对照例中，所使用的部分试剂，如5X Ion AmpliSeq HiFi Master Mix、FuPa Reagent、7·5Χ Switch Solution、Barcode Adapter、DNA Ligase、Platinum PCR SuperMix High Fidelity、Library Amplification Primer来自于Ion AmpliSeq Library Kit 2.0(Life Technology)，部分试剂通过其它途径商购获得，其中5X Ion AmpliSeq Primer Pool 来自于 Ion Cancer Panel (Life Technology),Agencourt AMPure XP 来自 Beckman(以下对照例中与此相同）。
[0031 ] 实施例
[0032] 使用lng cfDNA用本发明方法进行建库，其是在Ion AmpliSeq Library Kit 2.0 (Life Technology)的建库方法基础上，将每一步的所用的试剂和反应体系的组分量及纯 化磁珠使用量减半，且对PCR扩增循环数进行了优化，其具体步骤如下：
[0033] 1)多重 PCR
[0034]将分离纯化的lng cfDNA进行多重PCR扩增。反应体系和条件如表1和表2所示。
[0035] 表1多重PCR反应体系
[0036]
[0037] 表2多重PCR反应条件
[0038]
[0039]
[0040] 2)引物部分裂解
[0041 ] 将ΙμL FuPa Reagent加入到PCR产