基于il-12稳定膜表达的肿瘤治疗剂及其制法和用图
【技术领域】
[0001] 本发明设及医药领域，具体地设及一种基于IL-12稳定膜表达的高效低毒的肿瘤 治疗剂及其制法和用途。
【背景技术】
[0002] 比-12是一种非常重要的免疫刺激因子。化-12是由共价键链接的异质性二聚体细 胞因子，由p35和p40亚基组成，在体内由激活的免疫细胞分泌。化-12是重要的细胞免疫调 控因子，在抗感染免疫及恶性肿瘤的免疫中通过NK细胞W及CTL发挥作用。
[0003] 虽然IL-12具有显著的抑瘤效果，但是由于其系统性全身给药会引起全身性毒副 反应，因而受到极大的限制。在本发明之前，化-12的临床应用由于其所诱导的全身性毒副 作用，W及早期临床试验通过全身系统性给药引起的两例患者的意外死亡，使其临床应用 受到大大的限制。
[0004] 为了避免全身性给药的毒副作用从而实现临床应用的目的，临床科研工作者们通 过肿瘤局部注射、瞬时表达及多点注射等途径应用于肿瘤的临床试验，但是由于IL-12的治 疗效果同回输的IL-12的剂量直接相关，上述局部的临床方案并未有取得显著的抑瘤效果。
[0005] 为了解决运一问题，本发明人曾经试图通过基因修饰抗肿瘤T细胞持续分泌IL-12 来实现抗肿瘤效果的最大化，但是由于未知的原因（一种可能的原因是IL-12的毒副作用） 通过持续分泌IL-12方案基因修饰的T细胞在体外不能有效扩增，并引起大量的T细胞调亡。
[0006] 综上所述，本领域尚缺乏高效且低毒副作用的基于IL-12的抗肿瘤药物。因此，本 领域迫切需要开发高效且低毒副作用的肿瘤治疗药物。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的就是提供了一种高效且毒副作用低的肿瘤治疗药物及其制法和应 用。
[0008] 在本发明的第一方面，提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白包括融合在一起的W 下元件：
[0009] (i)任选的位于N端的信号肤和/或前导肤；
[0010] (ii)第一蛋白元件；
[0011] (iii)第二蛋白元件；W及
[0012] (iv)任选的位于第一蛋白元件和第二蛋白元件之间的连接肤元件；
[0013] 其中，所述信号肤可操作地连于由和(iv)所构成的融合元件；
[0014] 并且第一蛋白元件为IL-12蛋白元件；第二蛋白元件为突变型CD6化的蛋白元件， 所述突变型CD6化的蛋白元件缺失了 ADAM17的切割位点。
[0015] 在另一优选例中，所述的融合蛋白具有选自下组的结构：
[0016] (1)式la所述结构：
[0017] D-A-B (la)，或
[001引（2)式Π a所述结构：
[0019] D-A-C-B (na)，
[0020] 其中，
[0021] A为比-12蛋白元件；
[0022] B为突变型CD6化蛋白元件；
[0023] C为任选的连接肤元件；
[0024] D为任选的信号肤信号肤和/或前导肤序列；
[0025] 各独立地表示连接上述元件的肤键或肤接头。
[0026] 在另一优选例中，所述的突变型CD6化的蛋白元件缺失了化DKSre序列中的部分序 列或全部序列，从而导致无法被ADAM17切割。
[0027] 在另一优选例中，所述的"可操作地连于"指所述信号肤可引导所述融合元件的表 达或跨膜转移(定位）。
[0028] 在另一优选例中，所述的连接肤元件包括序列如SEQ ID NO. :7所示的连接肤。
[0029] 在另一优选例中，所述的IL-12蛋白来源于人或非人哺乳动物。
[0030] 在另一优选例中，所述的IL-12蛋白包括野生型和突变型。
[0031] 在另一优选例中，所述的IL-12蛋白包括全长的、成熟形式的IL-12,或其活性片 段。
[0032] 在另一优选例中，所述的第一蛋白元件包括IL-12蛋白的一个或两个亚基。
[0033] 在另一优选例中，所述的IL-12蛋白的亚基选自下组:P40和P35亚基。
[0034] 在另一优选例中，所述的第一蛋白元件包括连接在一起的IL-12蛋白P40和P35亚 基。
[00；35]在另一优选例中，所述的P40和P35亚基为"头-头"、"头-尾"、"尾-尾"相连。
[0036] 在另一优选例中，所述的P40和P35亚基之间存在或不存在接头（linker)。较佳地， 所述的接头为柔性的4-20个氨基酸的接头，更佳地，所述的接头为GGGGGGS(即GsS) (SEQ ID NO.:8)。
[0037] 在另一优选例中，所述的IL12蛋白元件的序列如SEQ ID NO. :4所示。
[0038] 在另一优选例中，所述的突变型CD6化蛋白元件中缺少了 K283-S284切割位点。
[0039] 在另一优选例中，所述的突变型CD6化蛋白来源于人或非人哺乳动物。
[0040] 在另一优选例中，所述的突变型CD6化蛋白包括全长的、成熟形式的CD62L，或其活 性片段。
[0041 ] 在另一优选例中，所述的突变型CD6化蛋白元件的序列如SEQ ID NO. :6所示。
[0042] 在另一优选例中，所述的肤接头的长度为0-15个氨基酸，较佳地1-10个氨基酸。
[0043] 在另一优选例中，所述融合蛋白还包括信号肤元件D。
[0044] 在另一优选例中，所述的融合蛋白中，在单链IL-12(第一蛋白元件）和突变型 CD62L(第二蛋白元件)之间设有连接肤，优选218肤段(SEQ ID N0.:7)。
[0045] 在另一优选例中，所述的融合蛋白中，第一蛋白元件为单链IL-12,在所述单链IL- 12中，在P40亚基及P35亚基设有连接肤GsS(SEQ ID N0.:8)。
[0046] 在另一优选例中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO. :2所示。
[0047] 在另一优选例中，所述融合蛋白具有W下多种特征：
[0048] a)所述融合蛋白不能被ADAM17蛋白切割，从而不释放IL-12;
[0049] b)所述融合蛋白包含化-12的两条亚基，即P40和P35亚基，并由GGGGGGS(G6S)连 接。
[0050] 在另一优选例中，所述的融合蛋白为单体、或二聚体。
[0051] 在本发明的第二方面，提供了一种分离的多核巧酸，所述的多核巧酸编码本发明 第一方面所述的融合蛋白。
[0052] 在另一优选例中，所述的多核巧酸的序列如SEQ ID NO.: 1所示。
[0053] 在本发明的第Ξ方面，提供了一种载体，它含有本发明第二方面所述的多核巧酸。
[0054] 在另一优选例中，所述的载体包括质粒、病毒载体。
[0055] 在另一优选例中，所述的病毒载体包括:慢病毒载体、腺病毒载体、黄热病毒载体。
[0056] 在另一优选例中，所述的载体包括表达载体。
[0057] 在本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，其特征在于，它含有本发明第Ξ方面 所述的载体或基因组中整合有本发明第二方面所述的多核巧酸。
[0058] 在另一优选例中，所述的宿主细胞包括原核细胞和真核细胞。
[0059] 在另一优选例中，所述的宿主细胞包括哺乳动物细胞。
[0060] 在另一优选例中，所述的宿主细胞包括免疫细胞，较佳地T细胞、
[0061] 在本发明的第五方面，提供了一种产生本发明第一方面所述的蛋白的方法，它包 括步骤：
[0062] (1)在适合表达的条件下，培养本发明第四方面所述的宿主细胞，从而表达出本发 明第一方面所述的融合蛋白；和
[0063] (2)任选地分离所述融合蛋白。
[0064] 在本发明的第六方面，提供了一种免疫细胞，所述的免疫细胞在膜表面上携带本 发明第一方面所述的融合蛋白。
[0065] 在另一优选例中，所述的免疫细胞为至少103个(较佳地103-109个，更佳地较佳地 104-108个)所述免疫细胞的细胞群。
[0066] 在另一优选例中，所述的免疫细胞或免疫细胞群中的全部或大多数（含80%，较佳 地>90%)的细胞是活的。
[0067] 在另一优选例中，至少一部分或全部所述的融合蛋白位于所述免疫细胞的细胞膜 上，并且所述的第一蛋白元件即IL-12蛋白元件位于胞外。
[0068] 在另一优选例中，所述的免疫细胞包括T细胞。
[0069] 在另一优选例中，所述的T细胞表面携带MART-1TCR。
[0070] 在本发明的第屯方面，提供了一种药物组合物，所述的组合物包含：
[0071] 本发明第六方面所述的的免疫细胞，W及
[0072] 药学上可接受的载体。
[0073] 在另一优选例中，所述的药物组合物为液态。
[0074] 在另一优选例中，所述的药物组合物含有1 X 103-1 X 107个所述的免疫细胞/ml。
[0075] 在本发明的第八方面，提供了一种如本发明第一方面所述的融合蛋白和/或本发 明第六方面所述的的免疫细胞的用途，它们被用于制备治疗肿瘤的药物。
[0076] 在另一优选例中，所述肿瘤包括:脑肿瘤、大肠癌肿瘤、肺癌肿瘤、肝癌肿瘤、乳腺 癌肿瘤、胃癌肿瘤、膜腺癌肿瘤。
[0077] 在本发明第九方面，提供了一种治疗肿瘤的方法，包括步骤:给需要的对象施用本 发明第一方面所述的融合蛋白和/或本发明第六方面所述的的免疫细胞。
[0078] 在另一优选例中，所述的融合蛋白W单体和/或二聚体形式施用。
[0079] 在另一优选例中，所述的对象是人。
[0080] 在本发明的第十方面，提供了一种非治疗性或治疗性的体外杀灭肿瘤细胞的方 法，包括步骤:将本发明第六方面所述的的免疫细胞与肿瘤细胞进行接触，从而杀灭所述肿 瘤细胞。
[0081] 应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例）中具 体描述的各技术特征之间都可W互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附图说明】
[0082] 图1显示了CD62L跨膜区的氨基酸组成及ADAM17的切割位点。图1A和1B表示 服SCD6化突变体(缺失了化DKSFS)在T细胞活化后，不能发生基于切割酶(如Adaml7等）的切 割及释放，导致dKSCD6化还留在T细胞膜表面。图1C中，WT代表野生型的序列，dKS代表敲除 了 ADAM17序列的CD6化突变体。
[0083] 图2显示了化SCD6化慢病毒基因修饰的抗肿瘤T细胞导致化SCD6化稳定表达。
[0084] 其中，如上图所示，抗肿瘤T细胞系JKF6(由黑色素瘤组织中分离培养的抗肿瘤T细 胞系，可W直接识别肿瘤)通过慢病毒基因修饰后，可W检测到WTCD6化及化SCD6化的表达。 [00化]如下图所示，T(野生型）CD6化经过肿瘤抗原526活化后，CD6化可W发生肿瘤抗原 特异性的切割及释放;但是，dKSCD6化的膜表达后，却丧失肿瘤抗原活化的切割及释放，表 现为稳定的膜表面化SCD6化的表达的表型。
[0086] JKF6T细胞与表达MART-1抗原的肿瘤细胞938和526共同培养。其中，共培养的T细 胞通过流式细胞仪检测膜表面的分子CD45R0和CD62L，通过Flow化软件的分析处理，每组的 T细胞被整理成CD8细胞亚群。流式细胞检测所用到的抗体为CD62L FITC，CD45R0 APC, MART-1 阳和CD8 PerCP。
[0087] 图3显示了化SCD6化慢病毒基因修饰抗肿瘤JFK6细胞不影响Τ细胞的抗肿瘤活性。 [008引其中，图3Α中，慢病毒基因修饰JKF6细胞后，通过PMA^onomycin(PMA/I