抑制植物组织发芽的方法
【专利说明】
[0001] 相关申请
[0002] 根据351].5.(：.§119(6)，本申请要求2014年8月18日提交的1].5.临时专利申请 No. 62/038，621的优先权，通过引用将其内容全部并入本文。
技术领域
[0003] 本申请设及一种抑制植物种子发芽(sprouting)的方法。更具体而言，本发明设及 一种通过向植物引入编码FCA蛋白的多核巧酸来抑制发芽种子的方法，尤其是收获前的发 芽。
【背景技术】
[0004] ΑΒΑ介导内部的信号传导途径，不仅能适应非生物性的胁迫，也能调节植物的发 育。已经表明，一些ΑΒΑ不敏感的突变体也显示出早期开花(early flowering)的表型，运表 明了 ΑΒΑ在调节开花中的作用(Takai等人，2001)。
[000引FCA已被鉴定为是一种核RNA结合蛋白，其通过抑制化C(一种开花的负调节因子） 而促进开花化e等人2003;Henderson和06311，2004)。拟南芥。〔4包含色氨酸-色氨酸(醫)结 构域和两个RNA识别基序(RRM) dFCA需要通过它的WW结构域和另一调节因子FY相互作用，用 来调节开花时间（Simpson等人2003)。认为FCA RRM调节单个低拷贝基因的染色质沉默 (Baurle 等人2007)。
[0006] 在拟南芥中，FCA参与ΑΒΑ介导的开花时间和侧根生长的调节。FCA曾经被认为是 ΑΒΑ受体(Razem等人2006,2008)。尽管ΑΒΑ结合活性受到严重的质疑，FCA的确调节一些ΑΒΑ 介导的响应。然而，尚不清楚FCA作为ΑΒΑ调节因子是如何工作的机制。
[0007] 最近，PYR/P化/RCAR家族的蛋白已被鉴定为ΑΒΑ受体(Ma等人，2009)。在拟南芥中， 运些蛋白质的ΑΒΑ传感是通过它们与一些PP2C(包括ABI1)直接的相互作用而进行的。运种 相互作用抑制运些PP2C的憐酸酶活性，并导致亚类III SnRK2的激活（Nishimura等人， 2009)。一些转录因子调节ΑΒΑ信号传导，并且可W被Sn服2激活。ABI5(-种基础结构域/亮 氨酸拉链(b-ZIP)转录因子(TF))识别并结合许多ΑΒΑ诱导的启动子区域的ABRE(也称为 ACGT-盒），从而导致基因激活(化saretto和化，2003)。拟南芥aM5突变体在ΑΒΑ响应方面有 困难，比如在种子萌发期间对ΑΒΑ的敏感性降低，W及许多ΑΒΑ所调节的基因（包括LEA基因） 的表达被改变(Gampala等人，2002)。
[000引运种ABI5的反式激活过程依赖于另一 TF(viviparousl(VPl))的存在。ABI5和VP1 的共表达可W模仿含有ABRC的启动子的ΑΒΑ诱导，但是不影响基因表达的ΑΒΑ抑制 (Casaretto和化，2003) dVPI (-种Β3转录因子家族成员）大量表达于种子中。VP1包含4个发 挥不同功能的保守结构域，命名为A1、B1、B2和B3(Suzuki等人，1997)dN端的A1结构域是VP1 的功能结构域(Me化rty等人，1991)dB1结构域负责与ABI5的蛋白-蛋白相互作用(化kamura 等人，2001KB2调节核定位W及B3展现DNA结合活性（Suzuki等人，1997;Marella和 如atrano,2007)。除了调节种子的发育、成熟和萌发，VP1也介导开花和分生组织活性。
[0009]收获前的发芽(PHS)是种子在收获之前仍然处于穗中（on the sp化e)时的过早萌 发。由于长时间的降雨和高湿度所致之下，而发生运种萌发，如在南亚、北欧和北美西部地 区的天气。PHS降低种子的质量，每年造成大量经济损失。然而，防止谷物PHS的技术非常有 限。
【发明内容】
[0010]在本研究中，出乎意料地发现，调节因子FCA在水稻中的过度表达可显著降低PHS， 因此降低P服所致的经济损失。
[0011] 因此，一方面，本发明提供一种抑制植物组织种子的方法，包括：
[0012] (i)向植物细胞中引入编码FCA蛋白的重组多核巧酸，W获得转化的植物细胞； [001引（ii)从所述转化的植物细胞中产生转化的植物；从及
[0014] (iii)选择运样的转化的植物，相较于未引入编码FCA蛋白的重组多核巧酸的非转 基因植物而言，其产生具有降低的发芽水平的植物种子。
[0015] 另一方面，本发明提供一种转基因植物，其转化有编码FCA蛋白的重组多核巧酸。
[0016] 另一方面，本发明提供植物组织，其来自本文所述的转基因植物。
[0017] 在一些具体的实施方式中，FCA蛋白包含：
[0018] (a)氨基酸序列，所述氨基酸序列从N端至C端具有第一RNA识别基序(RRM1)、第二 RNA识别基序(RRM2)W及色氨酸-色氨酸(WW)结构域，其中
[0019] (i)所述RRM1，其包含SEQ ID N0:4;
[0020] 。1)所述3觀2，其包含沈9 10備:5;^及 [0021 ] (iii)所述WW结构域，其包含沈Q ID N0:6。
[0022] 在某些实施方式中，FCA蛋白包含长度上总共650至850个(如700-800个)氨基酸残 基。
[0023] 在某些实施方式中，FCA蛋白包含和SEQ ID NO: 1、2或3的氨基酸序列具有至少 80 % (如至少85 %、90 %、95 %或95 % )序列同一性的氨基酸序列。
[0024] 在某些实施方式中，RRM1选自由SEQ ID N0:7、10和13构成的组;RRM2选自由SEQ ID N0:8、ll和14构成的组;或WW结构域选自由SEQ ID N0:9、12和15构成的组。
[0025] 在一些实施方式中，FCA蛋白包含选自由SEQ ID NO: 1、2和3构成的组的氨基酸序 列或者由选自由SEQ ID NO: 1、2和3构成的组的氨基酸序列组成。
[0026] 在一些实施例中，转基因植物是单子叶植物，尤其选自水稻、大麦、小麦、黑麦、燕 麦、玉米、竹子、甘薦、洋葱、韭菜和姜。尤其是，转基因植物是水稻、大麦或小麦。
[0027] 在一些实施方式中，植物组织是繁殖材料，尤其是种子。
[0028] 在一些实施方式中，本发明的方法在植物种子中有效地抑制了发生在从转基因植 物中进行收获之前或收获之后的发芽。
[0029] 在一些实施方式中，相较于未引入编码FCA蛋白的重组多核巧酸的非转基因植物 而言，本发明的转基因植物产生具有更慢萌发率的种子、或者萌发之后产生更小的苗 (seedling)或更矮的芽(shoot)的种子。
[0030] 一个或更多的本发明实施方式的细节在如下描述中所示。根据如下若干实施方式 的详细描述W及所附的权利要求，本发明的其它特征或优势将变得明显。
【附图说明】
[0031] 当结合附图进行阅读时，将会更好地理解前述的总结、W及本发明的如下详细描 述。出于阐述本发明的目的，显示在目前优选的附图实施方式中。然而，应当理解本发明不 限于所显示的具体安排和手段。
[0032] 在附图中：
[0033] 图1的A-C:在水稻糊粉(aleurone)细胞中，FCA-过度表达增强而FCA-RNAi抑制ΑΒΑ 诱导的基因表达。将报告构建体（图1A)ABRC1-GUS轰击到（图1B)FCA-过度表达W及（图1C) FCA-RNAi转基因水稻的半个无胚种子(embryoless half-seed)中。柱(bar)表示轰击的种 子在含有或不含20μΜ ΑΒΑ的发芽(shooting)缓冲液中解育2地后的GUS活性±SE。
[0034] 图2的A-E:在大麦糊粉细胞中，FCA改变ΑΒΑ但是不改变GA途径。（图2A)瞬时表达分 析中所用的报告和效应构建体的图。在大麦糊粉细胞中，（图2B)FCA-过度表达增强而（图 2D)FCA-RNAi抑制ΑΒΑ诱导的基因表达。（图2C)(图2E)GA诱导的基因表达不受影响。在有(+ ) 或者没有(-)效应构建体Ubi-HvFCA-RNAi或Ubi-HvFCA的情况下，将报告构建体ABRC1-GUS 或Amy3化-GUS轰击至大麦的半个无胚种子中。柱表示轰击的半个无胚种子在含有或不含20 μΜ ΑΒΑ或ΙμΜ GA的发芽缓冲液中解育24h后的GUS活性±SE。
[0035] 图3的A-C:在大麦糊粉细胞中，FCA-RNAi抑制而FCA-过度表达增强VP1/ABI5诱导 的基因表达。（图3A)瞬时表达分析中所用的报告和效应构建体的图。在有(+ )或者没有(-) 效应构建体 Ubi-VPl、Ubi-ABI5W及（图 3B)Ubi-HvFCA 或(C)Ubi-HvFCA-RNAi 的情况下，将报 告构建体ABRC1-GUS轰击至大麦的半个无胚种子中。柱表示轰击的半个无胚种子在发芽缓 冲液中解育2地后的GUS活性± SE。
[0036] 图4的A-D.种子萌发时，FCA的过度表达导致ΑΒΑ过度敏感，而FCA-RNAi导致ΑΒΑ敏 感性过低化7口〇36113^1乂^7)。。〔4-过度表达（图44)和（图4(：处〔4-1?酷1转基因水稻的种子 萌发时程。在含或不含ΑΒΑ的情况下，在28°C黑暗中将灭菌的水稻种子解育在含8-lOml水的 9-cm平皿中。显示的数据是Ξ次重复的平均值±56。在每个重复中测量每个转基因品系的 至少30个种子。在实验结束时，拍摄生长在含有ΑΒΑ的垂直琼脂介质上的FCA-过度表达（图 4Β)和FCA-RNA i (D)的苗的照片。
[0037] 图5的A-C.FCA的过度表达抑制收获前的发芽，但是不改变抽穗日期。（图5A)抽穗 之后40至42天切除的穗（于25°C解育在潮湿容器（chamber)中。在第11天拍摄照片。（图5B) 在第7、9和11天，对潮湿的穗上发芽谷粒的数目进行计数。抽穗日期记录为（图5C)记录从萌 发到出现长度约1cm的第一圆锥花序。呈现了获自两个生长季节的结果。
[0038] 图6的A-B.FCA的过度表达抑制收获前的发芽。（图6A)抽穗之后37至38天切除的穗 于25°C解育在潮湿容器中。在第11天拍摄照片。（图6B)在第11天，对潮湿的穗上发芽谷粒的 数目进行计数。
[0039] 图7. FCA的过度表达抑制收获前的发芽。切除的成熟穗于25°C解育在