长度上总共650至850个(如700-800个)氨基酸残 基。
[0072] 在某些实施方式中，FCA蛋白包含和SEQ ID NO: 1、2或3的氨基酸序列具有至少 80 % (如至少85 %、90 %、95 %或95 % )序列同一性的氨基酸序列。
[0073] 在一些实施方式中，本文所述FCA蛋白中的RRM1结构域选自由SEQ ID N0:7、10和 13构成的组。
[0074] 在一些实施方式中，本文所述FCA蛋白中的RRM2结构域选自由SEQ ID N0:8、ll和 14构成的组。
[0075] 在一些实施方式中，本文所述FCA蛋白中的WW结构域选自由SEQ ID N0:9、12和15 构成的组。
[0076] 在具体的实施方案中，FCA蛋白包含选自由SEQ ID NO: 1、2和3构成的组的氨基酸 序列或者由选自由SEQ ID NO: 1、2和3构成的组的氨基酸序列组成。
[OOW]如本文所用，术语"发芽"是指包括从植物组织由植物进行繁殖。例如，发芽可能发 生在种子、块茎或块根中。它包括苗的产生，形成叶或芽，或启动运些过程而引起叶或芽的 发育启动。如本文所用，在转基因植物中发芽的抑制是指运种发育过程中的抑制、延迟或延 缓，例如与对照或野生型植物相比，更低或更慢的发芽率或更小或更矮的苗。在一些实施方 式中，本发明的转基因植物表现出种子中的发芽率是相同的条件下野生型植物常规发芽率 的约90%、80%、70%、60%、50%或更少。
[0078] 本发明方法可W应用的植物包括单子叶植物。单子叶植物的实例包括但不限于水 稻、大麦、小麦、黑麦、燕麦、玉米、竹子、甘薦、洋葱、韭菜和姜。在本发明一个具体的实施方 式中，转基因植物是转基因谷类植物，优选转基因水稻植物。
[0079] 根据本发明，转化有导致FCA蛋白过度表达的FCA基因的转基因植物令人惊奇地显 示出抑制植物种子发芽，使得可W降低早期发芽所致的经济损失。
[0080] 在一些实施方式中，植物组织是繁殖材料，选自种子。
[0081] 在一些实施方式中，本发明的方法还包括从所述转基因植物中收集植物种子。
[0082] 在一些实施方式中，在从转基因植物中收获植物组织之前发生发芽的抑制。
[0083] 在一些实施方式中，在从转基因植物中收获植物组织之后发生发芽的抑制。
[0084] 在一个具体的实施方式中，相较于对照植物（例如非转基因植物）的种子而言，本 发明的转基因植物产生具有更低或更慢萌发率的种子、或者萌发之后产生更小的苗或更矮 的芽的种子;然后选择运样的转基因植物，并任选进一步回收种子。
[0085] 通过下面的实施例进一步说明本发明，提供实施例用于说明性的目的而非限制的 目的。根据本公开的内容，本领域技术人员应理解，在所公开的【具体实施方式】中可W进行许 多变化并仍然获得相似或类似的结果，而不脱离本发明的精神和范围。
[0086] 实施例
[0087] 我们的研究主要集中在谷物FCA的功能。在此文章中，我们分析了FCA在复杂的ΑΒΑ 信号传导途径上的功能W及对种子萌发和收获前发芽的调节。
[0088] 不同于AtFCA对开花时间调节的原有功能，在转基因水稻中发现改变OsFCA的表达 不影响开花时间控制。OsFCA的过度表达增强，而它的RNAi抑制，ΑΒΑ上调的LEA蛋白合成的。 然而，OsFCA不影响充分表征的GA诱导的α-淀粉酶合成和ΑΒΑ抑制的运一过程。FCA-GFP融合 蛋白最初W点状(punctate)模式定位于细胞质，但随后逐渐易位到核。OsFCA的运种从胞浆 到核的易位被ΑΒΑ处理进一步增强。然而，ΑΒΑ作用的主要抑制因子abil(蛋白憐酸酶2C的一 种显性突变)抑制OsFCA的运种胞浆/核易位。在植物中，双杂交研究表明OsFCA与VP1相互作 用，但不与ABI5直接相互作用。体外pull-down分析还证实，VP1和FCA彼此相互作用。OsFCA 中高度保守的WW结构域的突变抑制核易位，扰乱FCA-VP1相互作用，也抑制ΑΒΑ信号传导。我 们的结果表明，谷物FCA通过将ΑΒΑ信号由胞浆转导至核而在ΑΒΑ信号传导中起着举足轻重 的作用，在核中该蛋白与ΑΒΑ上调基因表达所必需的VP1/ABI5转录因子复合物相互作用。水 稻FCA还在收获前的发芽调节中发挥作用，并且可W应用在其它谷类作物的收获前发芽控 制中。
[0089] 1.材料和方法
[0090] 1.1植物材料
[0091]水稻(OiTza sativa)栽培品种台农(Tainung)67被用于运项研究。水稻的苗在28 °C生长于Kimura B营养液中，1化/8D光周期。在所有的瞬时分析中使用大麦种子化ordeum vulgare L. CV.Himalaya)。按照(Gomez-hdenas等人2001)所描述的制备半个的无胚种子。 [0092] 1.2质粒构建
[009引由国立农业科学研究所(NIAS)的水稻基因组资源中屯、(RGRC)提供水稻FCA cDNA 克隆(GenBank登录号AK073225和AK058419)。通过PCR从FCA cDNA克隆扩增水稻FCA的编码 区。通过RT-PCR从大麦种子的总RNA中扩增大麦FCA的编码区域。对于FCA的低表达，扩增水 稻FCA 0RF的核巧酸编号307-822和大麦FCA 0RF的核巧酸编号1532-1945。所有的PCR产物 被T/A克隆到pCRS/GW/TOPO载体中（Invitrogen)。通过测序证实序列W及在载体中的插入 方向。在运项研究中，针对所有瞬时实验和植物的转化，将GatewayS-compa1 ibic载体 (Invitrogen，卡尔斯鲁厄，德国）用于产生质粒构建物。通过LR重组，使用LR克隆酶 (Invitrogen)按照制造商的说明将PCR8/GW/T0P0载体中的插入DNA片段进一步亚克隆到目 的载体中。对于植物转化，目的载体是pANDA(Miki和Shimamoto,2004)和pBI-化i-GW，对于 瞬时表达分析是pANDA-mini(Miki和aiimamoto,2004)和pUC-Ubi-GW。对于瞬时分析，报告 构建体ABRC3-GUS和Amy32b-GUSW及效应构建体35S-ZmVPl和加 i-HvABI5已有描述 (McCarty等人 1991 ;Lan址an等人 1992; Armstrong等人 1995; hsaretto和Ho ,2003)。组成型 构建体PAHC18化bi 1-LUC)(化en等人1993)用作内部对照。
[0094] 1.3植物转化
[0095] 质粒 pBI-师 i-〇sFCA 和pBI-Ubi-OsFCA-RNAi 被引入根瘤农杆菌（Agrobacterium t皿ef ac i ens)株LBA4404，按照(化en等人2002)所述进行水稻转化。
[0096] 1.4萌发测试
[0097] 水稻种子去壳并通过25 %市售漂白剂加0.1 %吐溫-20灭菌30分钟，随后用无菌水 洗涂6次。在有或没有ΑΒΑ的情况下，将灭菌的种子置于含有8-lOml水的9cm平皿中。于28°C 在黑暗中解育平皿。随着种子萌发对带有2-3mm下胚轴的种子每天进行评分，对于过度表达 的品系至长达7天，而对于RNAi品系则长达10天。在每个实验中，每平皿采用30个种子并且 每个品系Ξ个平皿。种子萌发重复Ξ次。
[009引1.5收获前的发芽(P服)评价
[0099] 按照(Groos等人2002)的描述评价转基因水稻的收获前发芽(PHS)。抽穗后40至42 天，切除野生型和转基因水稻的完整穗，通过25%市售漂白剂表面灭菌30分钟，并通过大量 的无菌水洗涂6次，然后在试管中在去离子水中浸泡4小时。除去额外的水，并在管的底部保 留约1cm的水W保持湿润。在28°C解育7至11天后，针对每个穗记录发芽的和未发芽谷粒的 数目。
[0100] 2.结果
[0101 ] 2.1在转基因水稻糊粉细胞和大麦糊粉细胞中FCA-过度表达增强而FCA-RNAi抑制 ΑΒΑ诱导的基因表达
[0102]为了测试FCA对于诱导ΑΒΑ响应基因是否重要，我们使用来自FCA过度表达品系和 FCA-RNAi品系的种子作为材料用于表达分析。在野生型中，ABRCl-GUS报告基因在水稻糊粉 细胞中通过ΑΒΑ处理得W高度诱导。在FCA过度表达的转基因品系中，ΑΒΑ响应性报告基因表 达的ΑΒΑ诱导水平比野生型中的水平高约30% (图1Α)。与此相反，在FCA-RNAi的转基因品系 中诱导水平被抑制（图1B)。运些转基因植物的研究表明，FCA在ΑΒΑ信号传导中是重要的。为 进一步研究FCA功能，在大麦糊粉细胞中进行瞬时表达分析。效应化i-FCA或化i-FCA-RNAi 与报告构建体共同轰击到大麦的糊粉细胞中。和水稻糊粉细胞类似，ABRCl-GUS报告基因在 大麦糊粉细胞中通过ΑΒΑ处理得W高度诱导。FCA的过度表达将ΑΒΑ响应性诱导增强了约 25% (图2Β)，而FCA的RNAi抑制降低了诱导（图2D)。然而，另两个信号途径，即α-淀粉酶基因 表达的GA诱导和ΑΒΑ抑制，则根本不会受到FCA过度表达或RNAi的影响（图2C和图2Ε)。运些 表明FCA只能在ΑΒΑ信号传导中作为增强子发挥作用。
[0103] 2.2在大麦糊粉细胞中FCA-过度表达增强而FCA-RNAi抑制VPl/ABI5诱导的基因表 达
[0104] 在植物种子中，bZIP转录因子ΑΒΙ5和VP1对于ΑΒΑ响应性基因表达发挥重要的作 用。ΑΒΙ5和VP1在大麦糊粉细胞中的共表达足W诱导ΑΒΑ响应性LEA基因的表达。为了研究 FCA是否也增强ABI5/VP1的诱导能力，我们在大麦糊粉细胞中共表达运些基因，并观察它们 的效果。无需ΑΒΑ处理，ABI5和VP1的共表达诱导ΑΒΑ响应报告基因的表达（图3) dFCA的过度 表达将ABI5/VP1诱导能力增强了约30% (图3B)，而FCA的RNAi抑制降低了运种诱导（图3C)。 运表明在基因转录过程中FCA可W直接对AB15/VP1发挥作用。
[010引 2.3在水稻种子萌发当中FCA的过度表达导致ΑΒΑ过度敏感，而FCA-RNAi导致ΑΒΑ敏 感性过低
[0106] 为了阐明OsFCA在水稻中的生物功能，产生了带有OsFCA-过度表达和FCA-RNAi构 建体的转基因水稻。纯合种子进行种