c为其余的微性效应，a为随 机加性效应向量，e为残差，X、Y、Z是对固定效应和随机效益的关联矩阵。SNP与猪肌内脂肪 性状关联程度的显著性阈值通过Bonferrini法计算，染色体水平显著阈值为1除以有效SNP 位点数量。GWAS分析结果如图1所示。从图1可知，在纯种杜洛克及其合成系中，8号染色体中 存在一点与肌内脂肪显著相关的SNP位点为ASGA0038200。
[0028] 3.不同基因型与肌内脂肪表型的关联性分析
[0029] 从表1可知，SNP位点的ASGA0038200的基因型与杜洛克猪的肌内脂肪含量呈极显 著关系，说明该SNP标记与杜洛克猪的肌内脂肪性状呈极显著相关。肌内脂肪的含量与猪肉 的风味、嫩度和多汁性直接相关，三种基因型中AA型的肌内脂肪含量最高，而GG型的肌内脂 肪含量最低，根据国际猪基因组10.2版本参考序列猪8号染色体上第23147683个位点，种猪 继代选育AA型个体，淘汰该点的GG型个体和AG型个体，利用分子标记及相关检测技术使得 肌内脂肪性状在遗传育种改良上取得进展。
[0030] 表1SNP ASGA0038200与肌内脂肪之间的相关性
[0031]
[0032] 注:p值是基因型与肌内脂肪含量间的相关系数。
[0033] 4.猪基因组DNA的提取
[0034]本发明的试验猪种选自广东温氏食品集团股份有限公司种猪分公司的纯种杜洛 克及其合成系群体。猪基因组DNA的提取采用广州飞扬生物工程有限公司生产的Tissue DNA Kit试剂盒(按该试剂盒说明书进行操作)提取，具体步骤如下所述：
[0035] (1)剪下猪的耳组织30mg，放入1.5ml的离心管中，加入200ylTL Buffer，用枪头吹 打均匀。
[0036] (2)加入25μ10Β Protease Solution，剧烈颠倒充分混勾，55°C水浴锅中消化过 夜。
[0037] (3)12000rpm离心5分钟，移出上清液至新的1.5ml离心管中，然后加入200ylBL Buffer,祸旋混勾。
[0038] (4)7(TC水浴锅孵育10分钟。
[0039] (5)加入200μ1无水乙醇，，涡旋混匀。
[0040] (6)放置把8丨11(10~4 1^111〇)11111111到21111收集管上，转移上述溶液(包括任何形式 的沉淀物)到HiBind DNA Mini Column中。
[0041 ] (7) 12000rpm离心1分钟，倒掉滤液。
[0042] (8)往HiBind DNA Mini Column中加入500ylHBC Buffer，12000rpm离心30秒，弃 去滤液和收集管。
[0043] (9)HiBind DNA Mini Column放置到一个新的2ml收集管上，加入700ylDNA Wash Buff er，12000rpm离心30秒，弃去滤液和收集管。
[0044] (10)重复第9步，之后12000rpm空离2分钟。
[0045] (11)取出HiBind DNA Mini Column，放入一个干净的1.5ml离心管中，向吸附膜的 中间部位加1〇〇μ1洗脱缓冲液EB，室温放置3min，12000rpm离心lmin，将溶液收集到离心管 中。
[0046] (12)对收集到的溶液进行DNA的浓度及质量进检测后置于_20°C下保存备用。
[0047] 5.目的DNA序列引物设计和PCR扩增
[0048] 在Ensembl网站(http://asia.ensembl .org/index.html)下载猪的8号染色体上 SEQ ID NO: 1的DNA序列。并利用引物设计软件primer premier 6.0设计序列表SEQ ID N0: 2的引物，引物由上海生工生物工程有限公司设计完成。
[0049] ⑴引物设计
[0050] 设计的引物的DNA序列如下所示：
[0051 ]正向引物：5'TTCCTCTGGCTCAATATCTC3'，
[0052] 反向引物：5'1'(^6厶(：11'0^6厶(：7^(：11'3'。
[0053] (2)PCR 扩增
[0054]利用上述引物在纯种杜洛克及其合成系群体猪基因组DNA中进行PCR扩增，10yL的 聚合酶链式反应（PCR)反应体系中，包括lyL猪基因猪DNA、双蒸水3.4yL，2XTag PCR StanMix with Loading Dye5yL、设计的正反向引物各0.3μΙ^ΡΟ?的运行程序如下:预变性 94°C反应5min;然后94°C变性30s，退火为61.6°C30s，之后72°C延伸35s，33个循环；最后72 °C继续延伸1 Omin，PCR产物用2 %琼脂糖凝胶电泳跑胶。
[0055] (3)DNA序列测序PCR扩增产物委托苏州金唯智生物科技有限公司直接测序，测序 结果利用公用的DNAStar的SeqMan软件进行分析。通过对SEQ ID NO: 1序列中的第401个位 碱基突变进行检测，该突变等位基因频率在杜洛克猪种中存在显著的差异。本发明还公开 了制备猪肌内脂肪分子标记的方法，为猪的标记辅助选择提供了一个新的标记。
[0056]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种影响猪肌内脂肪性状的分子标记，其特征在于:所述分子标记的核苷酸序列如 SEQ ID N0:1所示，其中序列中的R显示碱基突变位置，其中R是G或A，导致猪肌内脂肪性状 的不同。2. -种用于鉴定权利要求1所述分子标记的引物对，其特征在于:所述引物对的核酸序 列如下所示： 正向引物如SEQ ID NO:2所示； 反向引物如SEQ ID NO:3所示。3. 权利要求1所述的影响猪肌内脂肪性状的分子标记在中国地方种猪肌内脂肪性状遗 传育种上的应用。4. 一种筛选优良肌内脂肪性状的猪品种的方法，其特征在于：确定种猪核心群中种猪 的权利要求1所述的分子标记，并根据所述分子标记做出相应的选择:种猪的继代选育国际 猪基因组10.2版本参考序列猪8号染色体上第23147683个位点的GG型个体，淘汰该点的AA 型个体和AG型个体。5. 根据权利要求4所述的筛选优良肌内脂肪性状的猪品种的方法，其特征在于:所述种 猪包括纯种杜洛克及其合成系群体。6. 权利要求2所述的引物对在鉴定影响猪肌内脂肪性状中的应用。7. 权利要求2所述的引物对在猪分子标记辅助育种中的应用。8. 权利要求2所述的引物对在调节猪肌内脂肪中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种影响猪肌内脂肪性状的分子标记及应用，属于分子生物技术和遗传育种领域。本发明所述的影响猪肌内脂肪性状的分子标记位于猪8号染色体的核苷酸序列第23147683个位点上，其核酸序列如SEQ？IDNO:1猪基因组序列第400个核苷酸处有一个G>A等位基因突变。本发明为猪的遗传改良提供了一个新的标记，有利于优良品系猪的遗传育种工作。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN105624310
【申请号】CN201610113646
【发明人】吴珍芳, 杨杰, 杨林雪, 蔡更元, 刘德武, 李紫聪, 郑恩琴, 顾婷
【申请人】华南农业大学
【公开日】2016年6月1日
【申请日】2016年2月29日