4，666,435与114,666，436之间或者在不同小鼠品系的小 鼠染色体12的等价位置或者在另一非人类脊椎动物如大鼠基因组中等价位置插入人类重 链可变区DNA，所述小鼠染色体12参照与小鼠品系巧7BL/6 J相关的小鼠基因组NCBIM3 7。在 与小鼠品系C57BL/6J相关的坐标114,666，435与114,666，436之间的插入与参照geneBank 登记号肿114985.2的129/5乂1基因组序列的染色体2上坐标1207826与1207827之间的插入 等价。可W在另一基因组如另一小鼠基因组中等价位置插入。在运个实施方案的实例中，本 发明的细胞或哺乳动物包含人类IgH VDJ区，其包含或由参照GRCH37/hgl9序列数据库的人 类染色体 14的 106，328，851-107，268，544位核巧酸如 106，328，901-107，268，494位核巧酸 如 106，328,941-107，268,454位核巧酸、如 106，328,951-107，268,444位核巧酸组成，或者 插入来自不同人类序列或数据库的染色体14的等价核巧酸。所述人类插入可W在上述区域 之间进行。
[0112] 在一个实施方案中，本发明的细胞或哺乳动物包含人类KVJ区的插入，其在种系构 型中适当地包含或由来自人类的所有V和J区及插入序列组成，人类DNA的插入在小鼠染色 体6的坐标70,673,918-70,675,517之间如在坐标70,674,418与70,675,017之间、如在坐标 70，674，655-70，674，856之间、如在坐标70，674，705-70，674，906之间、如在坐标70，674， 745-70,674,766之间、如在坐标70,674,755与70,674,756之间，编号参照与小鼠品系 巧7BL/6J相关的小鼠基因组NCBIM37,或者包含在另一基因组如另一小鼠基因组的等价位 置的插入。在运个实施方案的一个实例中，本发明的细胞或哺乳动物包含插入参照GRC册7/ hgl9序列数据库的人类染色体 2 的 89，159，079-89，630，437 和/或 89，941，714-90，266，976 位核巧酸(或者来自不同的人类序列或数据库的染色体2的等价核巧酸），如插入没有插入 序列的运两个分离的片段，或者插入完整的89，159，079-90，266，976区域。
[0113] 所述插入物可包含或由如下核巧酸组成：
[0114] (i)任选地除了下述片段Qi)之外，核巧酸89,158,979-89，630,537,如89,159， 029-89，630，487，如89，159，069-89，630，447，如89，159，079-89，630，437，
[0115] (i i)任选地除 了片段（i)之外，核巧酸89，941，614-90，267，076，如89,941，664-90，267，026，如 89，941，704-90，266，986，如 89，941，714-90，266，976，
[0116] (i i i)核巧酸 89，158，979-90，267，076，如核巧酸 89，159，079-90，266，976。
[0117] 人类插入物可W在上述区域之间。
[0118] 在一个实施方案中，本发明的细胞或哺乳动物包含插入人类A区，其包含至少一个 人类矜区（例如种系区）和至少一个人类a区（例如种系区），任选地Ca6和/或Ca7。例如，所述 细胞或哺乳动物包含多个人类於区，任选地Ja1、Ja2、Ja6和Ja7中的两或更多个，任选地所有 JaI、Ja2、Ja6和Ja7。在一个实例中，所述细胞或哺乳动物包含至少一个人类Ja-Ca簇，任选地 至少 Ja7-Ca7。
[0119] -方面，所述人类JC簇插入在最后的内源JA区的3'或者插入在最后的内源Jk区的 3'，适当地紧邻运些序列的3'，或者基本上紧邻运些序列的3'。
[0120] -方面，插入小鼠 A基因座中是在内源Cl基因节段的下游，例如在存在3'JlCl簇的 情况中，适当地紧邻Cl节段的3'，或者基本上紧邻该节段的3'。
[0121] -方面(如细胞或非人类哺乳动物），人类JC簇插入在K基因座中，任何所得细胞或 动物在该基因座是杂合的，由此所述细胞具有其中在K基因座插入人类ADNA的一条染色体， 及在内源K基因座具有人类KDNA的另一条染色体。
[0122] 在一个实施方案中，本发明的细胞或哺乳动物包含人类EA增强子。
[0123] 本发明的细胞或哺乳动物包含插入的人类AVJ区，适当地在种系构型中包含或由 来自人类的所有V和J区W及插入序列组成，插入的区域包含或由来自参照GRCH37/hgl9序 列数据库的人类染色体22的核巧酸22，375，509-23，327，984如核巧酸22，375，559-23，327， 934、如核巧酸 22，375，599-23，327，894、如核巧酸 22，375，609-23，327，884 组成，或者来自 另一人类序列或数据库的等价DNA。在小鼠基因组中的插入可W在小鼠染色体16的坐标19， 027,763与 19,061,845之间，如在坐标 19,037,763与 19,051,845之间，如在坐标 19,047,451 与19,047,652之间，如在坐标19,047,491与19,047,602之间，如在坐标19,047,541与19， 047，562之间，如在坐标19，047，551与19，047，552之间（参照与小鼠品系C57BL/6J相关的小 鼠基因组NCBIM37，等价于序列文件NT_039630.4中129SvJ基因组序列的坐标1，293，646-1， 293,647)，或者可W插入在其它基因组如另一小鼠基因组中的等价位置。人类A核酸插入在 小鼠基因组中或者可W在小鼠染色体6的坐标70,673,918与70,675,517之间，如在坐标70， 674,418与70,675,017之间，如在坐标70,674,655与70,674,856之间，如在坐标70,674,705 与70,674,806之间，如在坐标70,674,745与70,674,766之间，如在坐标70,674,755与70， 674,756之间（参照与小鼠品系巧7BL/6J相关的小鼠基因组NCBIM37)或者另一基因组的等 价位置。人类插入物可W在上述区域之间。
[0124] 上述所有人类特异性片段的长度可W变化，可例如比上述更长或更短，如500碱 基，化B，2K，3K，4K，5邸，10邸，20邸，30邸，40邸或50邸或更多，适当地包含全部或部分人类V (D)J区域，同时适当地优选保持最后插入的需求W包含编码完整重链区和轻链区的人类遗 传材料。
[0125] -方面，上述人类插入物的5 '末端的长度增加。在所述插入物是W逐步方式产生 的情况中，所述长度增加通常是关于上游(5'）克隆。
[0126] -方面，最后插入的人类基因、通常是要插入的最后的人类J基因的3'末端距人 类-小鼠连接区少于沈b，优选少于化B。
[0127] -方面，所述非人类哺乳动物包含本文所述一些或全部人类轻链KVJ区，但是无人 类轻链Ma区。
[0128] -方面，所述细胞或非人类哺乳动物包含完全的人类A基因座（来自人类的AVJC 区），嵌合的K基因座（与宿主K恒定区可操纵地连接的人类KVJ区）及嵌合的重链基因座，其 具有与宿主重链恒定区可操纵地连接的人类VDJ区。
[0129] 另一方面，所述基因组包含在重链基因座和一个轻链基因座或者在重链基因座和 两个轻链基因座插入本文所述的V、D(只是重链)和J基因。优选所述基因组在一个、两个或 所有=个基因座是纯合的。
[0130] 另一方面，所述基因座在一或多个基因座可W是杂合的，如对于编码嵌合抗体链 和天然(宿主细胞)抗体链的DNA是杂合的。一方面，所述基因组对于能编码本发明两个不同 抗体链例如包含2个不同的嵌合重链或2个不同的嵌合轻链的DNA可W是杂合的。
[0131] -方面，本发明设及本文所述的非人类哺乳动物或细胞，W及产生所述哺乳动物 或细胞的方法，其中插入的人类DNA如人类IgH VDJ区和/或轻链V、J区仅在所述哺乳动物或 细胞的一个等位基因而不是两个等位基因上发现。在此方面，哺乳动物或细胞具有表达内 源宿主抗体重链或轻链及嵌合重链或轻链的潜力。
[0132] 另一方面，所述人类VDJ区或轻链VJ区不作为整体使用，而是可W使用来自其它物 种的等价人类VDJ或VJ区的部分如外显子，如来自其它物种的一或多个V、D或J外显子或者 来自其它物种的调节序列。一方面，代替人类序列使用的序列不是人类或小鼠序列。一方 面，使用的序列可W来自晒齿类动物或者灵长类动物如黑猩猩。例如，来自除了人类之外的 灵长类动物的1、2、3、4或更多个或全部J区可用于置换本发明细胞和动物的VDJ/VJ区中的 1、2、3、4或更多个或全部人类J外显子。
[0133] 另一方面，插入的人类DNA如人类IgH VDJ区和/或轻链VJ区可W如此插入，由此其 在基因组中与来自非人类非小鼠物种如晒齿类动物或灵长类动物序列如大鼠序列的mu恒 定区可操纵地连接。
[0134] 在本发明中从中可W使用的DNA元件的其它非人类非小鼠物种包括兔、lamas、单 峰骆驼、羊驼、骆驼和整鱼。
[0135] -方面，插入的人类DNA如人类VDJ或VJ区与内源宿主mu序列不是可操纵地连接， 而是与非宿主mu序列可操纵地连接。
[0136] 可操纵地连接适当地允许产生包含所述人类可变区的抗体重链或轻链。
[0137] -方面，插入的人类DNA如人类IgH VDJ区（和/或轻链VJ区）可W与mu恒定区核酸 一起插入宿主染色体中，所述mu恒定区核酸不是宿主mu恒定区核酸，优选是来自非小鼠非 人类物种的的mu恒定区。适当地，插入的人类DNA如人类VDJ区（和/或轻链VJ区）与非人类非 小鼠mu序列可操纵地连接，且能形成嵌合抗体重链或轻链。在另一方面，非小鼠非人类mu可 W插入宿主染色体中与人类可变区分开的遗传元件上，或者在基因组中不同的位置，适当 地与可变区可操纵地连接，由此可W形成嵌合抗体重链或轻链。
[0138] 另一方面，本发明设及非人类哺乳动物或细胞，其基因组包含多个人类IgH V区、 一或多个人类D区和一或多个人类J区，位于宿主非人类哺乳动物轻链恒定区上游，排列成 所述细胞或哺乳动物能表达嵌合抗体链。本发明还设及非人类哺乳动物或细胞，其基因组 另外或或者包含多个人类Ig轻链V区和一或多个人类J区，位于宿主非人类哺乳动物重链恒 定区上游，由此所述细胞或哺乳动物能表达嵌合抗体链。所述细胞或哺乳动物可W能表达 具有重链和轻链包括如上述至少一个嵌合抗体链的抗体。
[0139] 插入的人类重链可变区可W是本文所述任一个，可W插入在上述位置W插入A和K 恒定区的5'。同样，插入的人类轻链可变区可W是上述那些，可W插入在上述位置W插入重 链恒定区的5'。
[0140] 例如，本发明的基因组或细胞或非人类哺乳动物可编码抗体，所述抗体包含具有 位于小鼠轻链恒定区上游的人类重链可变区的抗体链，或者包含具有位于小鼠重链恒定区 上游的人类轻链可变区的抗体链，组合如下一个链：
[0141] 完全的人类抗体轻链；
[0142] 完全的人类抗体重链；
[0143] 非人类脊椎动物(例如小鼠或大鼠）抗体轻链；
[0144] 非人类脊椎动物(例如小鼠或大鼠）抗体重链；
[0145] 嵌合的非人类脊椎动物(例如小鼠或大鼠）-人类抗体链；
[0146] 具有位于非人类脊椎动物(例如小鼠或大鼠）轻链恒定区上游的人类重链可变区 的抗体链；
[0147] 具有位于非人类脊椎动物(例如小鼠或大鼠）重链恒定区上游的人类轻链可变区 的抗体链。
[0148] 本发明还设及转基因，其编码位于宿主非人类哺乳动物轻链恒定区上游的多个人 类IgH V区、一或多个人类D区和一或多个人类J区，任选地包含于载体内。
[0149] 本发明还设及转基因，其编码位于宿主非人类哺乳动物重链恒定区上游的多个人 类Ig轻链V区和一或多个人类轻链J区，任选地包含于载体内。
[0150] -方面，本发明设及细胞或非人类哺乳动物，其基因组包含:位于全部或部分人类 K恒定区上游的一或多个人类Ig轻链KV区和一或多个人类Ig轻链Kj区。
[0151] 另一方面，本发明设及细胞或非人类哺乳动物，其基因组包含:位于全部或部分人 类入恒定区上游的一或多个人类Ig轻链AV区和一或多个人类Ig轻链AJ区。
[0152] 适当地，所述轻链VJ和C区能形成在体内可与抗原特异性反应的抗体链。
[0153] -方面，本发明设及在插入的轻链区中没有非人类编码序列。
[0154] 在此方面，如本文所述，人类K和/或A区插入基因组中，组合插入重链VDJ区或其一 部分，位于宿主重链恒定区上游。
[01W]本发明的细胞或非人类哺乳动物可包含：
[0156] (a)位于宿主非人类哺乳动物恒定区上游的多个人类IgH V区、一或多个人类D区 和一或多个人类J区;及
[0157] (b)位于全部或部分非人类K恒定区上游的一或多个人类Ig轻链KV区和一或多个 人类Ig轻链K J区，
[0158] 其中所述非人类哺乳动物能产生具有包含非人类哺乳动物恒定区和人类可变区 的抗体链的抗体的所有组成成分。
[0159] 本发明的细胞或非人类哺乳动物可包含：
[0160] (a)位于宿主非人类哺乳动物恒定区上游的多个人类IgH V区、一或多个人类D区 和一或多个人类J区;及
[0161] 位于宿主非人类哺乳动物M直定区上游的一或多个人类Ig轻链W区和一或多个人 类Ig轻链W区；
[0162] 其中所述非人类哺乳动物能产生具有包含非人类哺乳动物恒定区和人类可变区 的抗体链的抗体的所有组成成分。
[0163] 适当地，如上述插入人类VJC轻链DNA或其一部分是在等价的小鼠基因座进行的。 一方面，所述人类轻链KVJC DNA或其一部分插入在小鼠KVJC区的紧邻上游或下游。一方面， 所述人类轻链WJC区或其一部分插入在小鼠AVJC区的紧邻上游或下游。一方面，仅插入人 类KVJC基因座而不是人类AVJC基因座。一方面，仅插入人类AVJC基因座而不是人类KVJC基 因座。可W使用本文所述的技术进行插入，及适当地不从基因组中除去宿主序列。一方面， 所述非人类哺乳动物宿主VJC序列可W是一些方式失活的，通过突变或倒位、或者通过插入 人类可变区DNA或者通过任何其它方式。一方面，本发明的细胞或非人类哺乳动物可包含插 入完整的VJC人类区域。
[0164] 所述人类K可变区DNA可插入在基因组中，与M直定区功能性排列，例如插入在入恒 定区上游。或者，人类A区可变DM可与K恒定区功能性排列插入，例如插入在K恒定区上游。
[0165] 一方面，一或多个非人类哺乳动物控制序列如增强子序列保持在非人类哺乳动物 Mu恒定区上游，适当地就其与所述恒定区的距离而言是在其天然位置。
[0166] 一方面，一或多个非人类哺乳动物控制序列如增强子序列保持在非人类哺乳动物 Mu恒定区下游，适当地就其与所述恒定区的距离而言是在其天然位置。
[0167] -方面，非人类哺乳动物转换序列、适当地为内源转换序列保持在非人类哺乳动 物Mu恒定区上游，适当地就其与所述恒定区的距离而言是在其天然位置。
[0168] 在运种位置中，所述宿主增强子或转换序列在体内与宿主恒定区序列是可操纵 的。
[0169] -方面，转换序列既不是人类序列，也不是非人类哺乳动物中天然的，例如一方 面，非人类哺乳动物转换序列不是小鼠或人类转换序列。所述转换序列可W是例如晒齿类 动物或灵长类动物序列，或者是合成的序列。特别地，所述转换序列可W是大鼠序列，其中 所述非人类哺乳动物是小鼠。例如，小鼠或人类恒定区mu序列可W置于来自大鼠或黑猩猩 的转换序列或者其它转换序列的控制下，适当地能允许在体内发生同种型转换。
[0170] 一方面，本发明的转换序列是运样的转换序列，其包含重复序列GGGCT的3、4、5、6 或更多次连续重复，如大鼠转换序列。"大鼠转换序列"在本文是指所述转换序列是相应于 来自大鼠基因组的转换序列的野生型转换序列或者衍生自运种转换序列的序列。
[0171] -方面，本发明的转换序列是包含如下重复的大鼠转换序列:GAGCT(296次重复）， GGGGT(50次重复)和GGGCT(83次重复）。
[0172] 在一个实例中，所述大鼠转换序列包含或者由SEQ ID No: 1所示序列组成。
[0173] 在运些实施方案中，及其中所述非人类哺乳动物是小鼠或者所述细胞是小鼠细胞 的情况中，转换序列任选地是如本文所述大鼠转换序列。
[0174] 或者，本发明细胞或哺乳动物中存在的转换序列是小鼠转换序列，例如来自小鼠 如小鼠 129品系或小鼠巧7品系，或者来自衍生于其的品系，任选地包含或由SEQ ID No: 4或 5所示序列组成。"小鼠转换序列"在本文是指所述转换序列是相应于来自小鼠基因组的转 换序列的野生型转换序列或衍生自运种转换序列的序列。在运个实施方案中，及其中所述 非人类哺乳动物是小鼠或者所述细胞是小鼠细胞的情况中，所述小鼠转换序列任选地是内 源转换序列或者是来自另一小鼠品系的小鼠转换序列。
[0175] 本发明的细胞或哺乳动物可因此包含人类或非人类哺乳动物转换序列及一或多 个人类或非人类哺乳动物增强子区域。其可W在人类或非人类哺乳动物恒定区上游。优选 地，所述控制序列能指导包含与其相关的恒定区的抗体表达或者另外控制抗体的产生。一 种可W想见的组合是在小鼠细胞中大鼠转换序列与小鼠增强子序列及小鼠恒定区。
[0176] -方面，本发明设及细胞优选非人类细胞或非人类哺乳动物，其包含具有来自3或 更多个物种的DNA的免疫球蛋白重链或轻链基因座。例如，所述细胞或动物可包含宿主细胞 恒定区DNA，一或多个人类V、D或J编码序列及一或多个非人类非宿主DNA区，其能控制免疫 球蛋白基因座区域，如能控制Ig DNA的体内表达或同种型转换的转换序列、启动子或增强 子。一方面，所述细胞或动物是小鼠，及另外包含来自人类Ig基因座的人类DNAW及另外包 含非小鼠DNA序列，如能调节小鼠或人类DNA的大鼠DNA序列。
[0177] 另一方面，本发明设及细胞优选非人类细胞或非人类哺乳动物，其包含具有来自2 或更多个不同人类基因组的DM的免疫球蛋白重链或轻链基因座。例如，其在重链或轻链内 可W包含来自一个W上人类基因组的重链V(D)J序列，或者来自一个基因组的重链VDJ DNA 及来自不同基因组的轻链VJ序列。
[0178] -方面，本发明设及DNA片段或细胞或非人类哺乳动物，其包含免疫球蛋白重链或 轻链基因座或者其一部分，具有来自2或更多个物种的DNA，其中一个物种提供非编码区如 调节区，其它物种提供编码区如V、D、J或恒定区。
[0179] -方面，与不同的人类V、D或J区相关的人类启动子和/或其它控制元件在将人类 VD J插入小鼠基因组中之后保留。
[0180] 另一方面，优化人类区域如人类V区的一或多个启动子元件或者其它控制元件W 与非人类哺乳动物的转录机制相互作用。
[0181] 适当地，人类编码序列可W置于合适的非人类哺乳动物启动子的控制下，其使得 人类DNA在合适的非人动物细胞中有效转录。一方面，所述人类区域是人类V区编码序列，人 类V区置于非人类哺乳动物启动子控制下。
[0182] 人类启动子或其它控制区由非人类哺乳动物启动子或控制区的功能性置换可W 通过使用重组工程或者其它重组DNA技术进行，W将一部分人类Ig区（如人类V区)插入含有 非人类Ig区的载体(如BAC)中。所述重组工程/重组技术适当地用人类Ig区置换一部分非人 类(如小鼠）DNA，因此将人类Ig区置于非人类哺乳动物启动子或其它控制区的控制下。适当 地，人类V区的人类编码区置换小鼠V区编码序列。适当地，人类D区的人类编码区置换小鼠D 区编码序列。适当地，人类J区的人类编码区置换小鼠J区编码序列。W此方式，人类V、D或J 区可W置于非人类哺乳动物启动子如小鼠启动子的控制下。
[0183] -方面，插入非人类哺乳动物细胞或动物中的唯一人类DNA是V、D或J编码区，运些 区域被置于宿主调节序列或其它(非人类非宿主)序列控制下，一方面，提及人类编码区包 括人类内含子和外显子，或者在另一方面仅是外显子而无内含子，其可W是CDNA形式。
[0184] 也可W使用重组工程或者其它重组DNA技术，将非人类哺乳动物（如小鼠）启动子 或其