一种硫酸胍基丁胺的生物转化方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及医药中间体的制备领域，特别涉及一种硫酸胍基丁胺的生物转化方法。
【背景技术】
[0002]胍基丁胺是左旋精氨酸脱羧酶(L-ADC)催化精氨酸脱羧基的产物，是一种神经递质，在哺乳动物体内的大部分器官和组织内均有分布，其特异性地存在于某些细胞内，如肾上腺嗜铬细胞、神经胶质细胞和颈动脉体的球细胞等。研究资料表明，胍基丁胺有降血糖、降血压、利尿、抗炎、抗抑郁、抑制细胞增生等生物活性，特别是对N-甲基-D-天冬氨酸(匪DA)受体的拮抗作用较强而持久，具有对动物吗啡依赖性的戒断作用，是一种极具开发价值的戒毒类药物。且胍基丁胺通过刺激释放下丘脑的荷尔蒙来工作，包括促黄体激素和生长激素。通过两种途径来提高一氧化氮的含量:刺激释放一氧化氮和抑制一氧化氮酶的合成。可提高身体耐受度，加快身体恢复(一般指运动后的恢复)，提高身体性能，表现出惊人和长久的能量供输，提高全身构成。
[0003]目前市面上胍基丁胺多数以硫酸盐形式存在，硫酸胍基丁胺作为胍基丁胺的药用硫酸盐，具有多种药理学活性，硫酸胍基丁胺的市场运用前景广阔。在现有技术中，硫酸胍基丁胺的化学合成方法是用I，4_丁二胺为原料，先对它进行单胺基保护，再使用1-硝基胍基-3，5-二甲基吡唑对另一个胺基进行硝胍基化，后经还原、脱保护、成盐，最终制得硫酸胍基丁胺。该路线步骤多、收率低、成本高、不适合大规模的工业化生产。另一种以己二酸二乙酯为原料合成硫酸胍基丁胺，首先将乙二酸二乙酯与水合肼反应制得己二酸二酰肼，在与亚硝酸钠反应得重氮盐，加热脱氮，生成I，4_二异氰酸酯丁烷，水解得到关键中间体I，4_丁二胺，然后再与S-甲基异硫脲硫酸盐反应制得硫酸胍基丁胺。此路线步骤较多，生产过程大量放氮，易爆炸，并且使用S-甲基异硫脲硫酸盐作为胍基化试剂不可避免产生气味难闻的烷基硫醇，对环境造成较大污染。而用I，4_丁二胺为原料，使用S-甲基异硫脲硫酸盐作为胍基化试剂，同样也存在环境污染问题。例如中国公开专利CN1834085A和CN101121677均报道了用I，4_丁二胺和3-甲基异硫脲反应，得到硫酸胍基丁胺。但该方法的不足之处是:(I)反应收率低(仅为40%左右)；(2)反应易产生三废，特别是产生的烷基硫醇气味难闻，易对环境造成污染，不利于劳动保护，更不符合节能减排的产业政策。
[0004]因此，研发一种高效的硫酸胍基丁胺的生物转化方法显得十分必要。
【发明内容】
[0005]为了解决现有技术中没有高效的硫酸胍基丁胺的生物转化方法的问题，本发明实施例提供了一种硫酸胍基丁胺的生物转化方法。所述技术方案如下:
[0006]本发明实施例提供了一种硫酸胍基丁胺的生物转化方法，所述方法包括:以左旋精氨酸作为底物，以精氨酸脱羧酶作为生物转化催化剂，进行脱羧反应，生成胍基丁胺粗产物，将所述胍基丁胺粗产物用稀硫酸酸化，得到硫酸胍基丁胺粗产物。
[0007]具体地，所述方法还包括:以磷酸吡哆醛作为辅酶，进行脱羧反应。
[0008]进一步地，所述精氨酸脱羧酶与所述左旋精氨酸的质量比不超过0.05 ;所述磷酸吡哆醛与所述左旋精氨酸的质量比不超过0.002。
[0009]进一步地，所述精氨酸脱羧酶与所述左旋精氨酸的质量比为1:40;所述磷酸吡哆醛与所述左旋精氨酸的质量比为1:1000。
[0010]具体地，所述脱羧反应的反应温度为19-46°C;所述脱羧反应的反应体系的pH值为
6-10o
[0011]具体地，所述精氨酸脱羧酶为经过固定化处理后的精氨酸脱羧酶，所述精氨酸脱羧酶的固定化处理包括如下步骤:
[0012]I)破碎含所述精氨酸脱羧酶的工程菌细胞，将所述工程菌细胞离心后，收集精氨酸脱羧酶液；
[0013]2)将步骤I)所收集的所述精氨酸脱羧酶液、添加剂和固定化载体按质量比为1:0.6-0.8: 10-13加入pH值为6-8的缓冲溶液中，在25_35°C下恒温搅拌2_3h，离心后收集固体，得到固定酶载体;其中，所述添加剂包括硫酸铁和硫酸镁中的至少一种;所述固定化载体包括藻土、石英砂、含黏合剂型硅胶、活性氧化钙、脂粉、明胶、氧化铝和高岭土中的至少一种；
[0014]3)将步骤2)中得到的所述固定酶载体用乙醇洗涤1-3次，干燥，即得到所述固定化处理后的精氨酸脱羧酶。
[0015]进一步地，所述添加剂包括硫酸铁和硫酸镁，所述硫酸铁和所述硫酸镁的质量比为1:2;所述固定化载体为由藻土、石英砂、氧化铝和明胶组成，藻土、石英砂、氧化铝和明胶的质量比为4:1:1:3。
[0016]具体地，当脱羧反应进行到Ih以后，向所述脱羧反应补加左旋精氨酸。
[0017]具体地，当脱羧反应进行到第2h时，向所述脱羧反应补加左旋精氨酸，补加的左旋精氨酸的质量为初始所加的左旋精氨酸的质量的一半。
[0018]具体地，所述方法还包括对所述硫酸胍基丁胺粗产物进行纯化，所述纯化步骤如下:
[0019]I)向所述硫酸胍基丁胺粗产物中加入活性炭，在40°C?60°C下放置Ih?2h，再用孔径为0.45um的过滤膜抽滤，将抽滤后所得的溶液在旋转蒸发仪中旋转蒸发去除杂质，得到硫酸胍基丁胺粗晶体；
[0020]2)将步骤I)所得的所述硫酸胍基丁胺粗晶体用乙醇洗涤，过滤并干燥后，得到纯化的硫酸胍基丁胺晶体；
[0021 ]或者所述纯化步骤如下:
[0022]I)将乙腈、四氢呋喃、甲醇按体积比为2.5?3.5:3.5?5:1混合均匀，得到混合溶剂；
[0023]2)将所述硫酸胍基丁胺粗产物溶于步骤I)中的所述混合溶剂中，其中，所述硫酸胍基丁胺粗产物与所述混合溶剂的质量比为1:8?13，抽滤，得到硫酸胍基丁胺粗晶体；
[0024]3)将步骤2)所得的所述硫酸胍基丁胺粗晶体用乙醇洗涤，过滤并干燥后，得到纯化的硫酸胍基丁胺晶体。
[0025]本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是:本发明实施例提供了一种硫酸胍基丁胺的生物转化方法，工艺流程简单，对设备无特殊要求，适用于工业化生产，该方法与单纯的化学法相比，反应条件温和，操作简便，成本较低，污染少，且能完成在化学反应中难以进行的酶催化反应。
【附图说明】
[0026]为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0027]图1是本发明实施例一提供的纯化后的硫酸胍基丁胺的液相图，其中，横坐标为时间，纵坐标mAU为电信号；
[0028]图2是本发明实施例一提供的精氨酸脱羧酶液重复利用10次的比活力数据图，其中，横坐标为次数，纵坐标为每毫克酶活力。
【具体实施方式】
[0029]为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。
[0030]本发明实施例提供了一种硫酸胍基丁胺的生物转化方法，该方法包括:以左旋精氨酸作为底物，以精氨酸脱羧酶作为生物转化催化剂，进行脱羧反应，生成胍基丁胺粗产物，将胍基丁胺粗产物用稀硫酸酸化，得到硫酸胍基丁胺粗产物。
[0031]具体地，该方法还包括:以磷酸吡哆醛作为辅酶，进行脱羧反应。
[0032]进一步地，精氨酸脱羧酶与左旋精氨酸的质量比不超过0.05;磷酸吡哆醛与左旋精氨酸的质量比不超过0.002。
[0033]进一步地，精氨酸脱羧酶与左旋精氨酸的质量比为1:40;磷酸吡哆醛与左旋精氨酸的质量比为1:1000。
[0034]具体地，脱羧反应的反应温度为19_46°C;脱羧反应的反应体系的pH值为6-10。
[0035]具体地，精氨酸脱羧酶为经过固定化处理后的精氨酸脱羧酶，精氨酸脱羧酶的固定化处理包括如下步骤:
[0036]I)破碎含精氨酸脱羧酶的工程菌细胞，将工程菌细胞离心后，收集精氨酸脱羧酶液；
[0037]2)将步骤I)所收集的精氨酸脱羧酶液、添加剂和固定化载体按质量比为1:0.6-0.8: 10-13加入pH值为6-8的缓冲溶液中，在25_35°C下恒温搅拌2_3h，离心后收集固体，得到固定酶载体;其中，缓冲溶液可以为磷酸盐缓冲溶液;添加剂可以包括硫酸铁和硫酸镁中的至少一种；固定化载体可以包括藻土、石英砂、含黏合剂型硅胶(硅胶G)、活性氧化钙、月旨粉、明胶、氧化铝和高岭土中的至少一种；
[0038]3)将步骤2)中得到的固定酶载体用乙醇洗涤1-3次，干燥，即得到固定化处理后的精氨酸脱羧酶。
[0039]进一步地，添加剂包括硫酸铁和硫酸镁，硫酸铁和硫酸镁的质量比为1:2;固定化载体为由藻土、石英砂、氧化铝和明胶组成，藻土、石英砂、氧化铝和明胶的质量比为4:1:1: 3。
[0040 ]具体地，当脱羧反应进行到I h以后，向脱羧反应补加左旋精氨酸。
[0041 ]具体地，当脱羧反应进行到第2h时，向脱羧反应补加左旋精氨酸，补加的左旋精氨酸的质量为初始所加的左旋精氨酸的质量的一半。
[0042]具体地，采用浓度为0.lmol/L的硫酸对胍基丁胺粗产物进行酸化，使酸化后的胍基丁胺粗产物，即硫酸胍基丁胺粗产物的PH值为4?5。
[0043]具体地，该方法还包括对硫酸胍基丁胺粗产物进行纯化，纯化步骤如下:
[0044]I)向硫酸胍基丁胺粗产物中加入活性炭，在40 0C?60 0C下放置Ih?2h，再用孔径为0.45um的过滤膜抽滤，将抽滤后所得的溶液在旋转蒸发仪中旋转蒸发去除杂质，得到硫酸胍基丁胺粗晶体;其中，活性炭的加入量可使黄色的硫酸胍基丁胺粗产物吸附至无色即可。同时，可利用液相色谱-质谱联用技术(HPLC-MS)和高效液相色谱法(High PerformanceLiquid Chromatography，HPLC)进行监控，直至底物完全利用；
[0045]2)将步骤I)所得的硫酸胍基丁胺粗晶体用乙醇洗涤，过滤并干燥后，得到纯化的硫酸胍基丁