一种硫酸胍基丁胺的生物转化方法_2

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胺晶体;其中,乙醇将硫酸胍基丁胺粗晶体清洗干净即可,其用量可根据具体情况进行调整。
[0046]或者纯化步骤如下:
[0047]I)乙腈、四氢呋喃、甲醇按体积比为2.5?3.5:3.5?5:1混合均匀,得到混合溶剂;
[0048]2)将硫酸胍基丁胺粗产物溶于步骤I)中的混合溶剂中,其中,硫酸胍基丁胺粗产物与混合溶剂的质量比为1:8?13,抽滤,得到硫酸胍基丁胺粗晶体;
[0049]3)将步骤2)所得的硫酸胍基丁胺粗晶体用乙醇洗涤,过滤并干燥后,得到纯化的硫酸胍基丁胺晶体。其中,乙醇将硫酸胍基丁胺粗晶体清洗干净即可,其用量可根据具体情况进行调整。
[0050]优选地,将乙腈、四氢呋喃、甲醇按体积比为3: 4: I混合均匀,得到混合溶剂。
[0051 ] 实施例一
[0052]以左旋精氨酸作为底物,以精氨酸脱羧酶作为生物转化催化剂,以磷酸吡哆醛作为辅酶,进行脱羧反应,生成胍基丁胺粗产物,将胍基丁胺粗产物用稀硫酸酸化,得到硫酸胍基丁胺粗产物。精氨酸脱羧酶与左旋精氨酸的质量比为1:40;磷酸吡哆醛与左旋精氨酸的质量比为1: 1000。控制反应体系的温度为35 °C ;控制反应体系的pH值为6.5。
[0053]精氨酸脱羧酶为经过固定化处理后的精氨酸脱羧酶,精氨酸脱羧酶的固定化处理包括如下步骤:
[0054]I)破碎含精氨酸脱羧酶的工程菌细胞,将工程菌细胞离心后,收集精氨酸脱羧酶液;
[0055]2)将步骤I)所收集的精氨酸脱羧酶液、添加剂和固定化载体按质量比为1:0.7:11加入PH值为7的磷酸盐缓冲溶液中,在30°C下恒温搅拌2.5h,离心后收集固体,得到固定酶载体;其中,添加剂包括硫酸铁和硫酸镁,硫酸铁和硫酸镁的质量比为1:2,硫酸铁和硫酸镁的质量比为1:2更能促进精氨酸脱羧酶的活性;固定化载体由藻土、石英砂、氧化铝和明胶组成,藻土、石英砂、氧化铝和明胶的质量比为4:1:1:3,藻土、石英砂、氧化铝和明胶的质量比为4:1: 1:3能够更高的提升精氨酸脱羧酶的活性,更利于精氨酸脱羧酶的多次循环利用;
[0056]3)将步骤2)中得到的固定酶载体用乙醇洗涤3次,干燥,即得到固定化处理后的精氨酸脱羧酶。
[0057]当脱羧反应进行到第2h时,向脱羧反应补加左旋精氨酸,补加的左旋精氨酸的质量为初始所加的左旋精氨酸的质量的一半。
[0058]具体地,采用浓度为0.lmol/L的硫酸对胍基丁胺粗产物进行酸化,使酸化后的胍基丁胺粗产物,即硫酸胍基丁胺粗产物的PH值为4。
[0059]对硫酸胍基丁胺粗产物进行纯化,纯化步骤如下:
[0060]I)将乙腈、四氢呋喃、甲醇按体积比为3:4:1混合均匀,得到混合溶剂;
[0061]2)将硫酸胍基丁胺粗产物溶于步骤I)中的混合溶剂中,其中,硫酸胍基丁胺粗产物与混合溶剂的质量比为1:10,抽滤,得到硫酸胍基丁胺粗晶体;
[0062]3)将步骤2)所得的硫酸胍基丁胺粗晶体用乙醇洗涤,过滤并干燥后,得到纯化的硫酸胍基丁胺晶体。
[0063]将纯化的硫酸胍基丁胺晶体进行液相色谱实验,所得实验结果如图1所示,在该图中,于15.579min处有吸收峰。本实施例提供的底物左旋精氨酸的转化率为97.5%,所制备纯化的硫酸胍基丁胺晶体的纯度达到99.4%。
[0064]将精氨酸脱羧酶液重复利用10次并得到其比活力数据图,如图2所示,固定后,精氨酸脱羧酶重复利用10次后反应仍具有酶活,并且在第10次使用时,其酶的比活力大于30U/mg。这使得昂贵的精氨酸脱羧酶可以循环利用,极大地节省生产成本。
[0065]实施例二
[0066]以左旋精氨酸作为底物,以精氨酸脱羧酶作为生物转化催化剂,以磷酸吡哆醛作为辅酶,进行脱羧反应,生成胍基丁胺粗产物,将胍基丁胺粗产物用稀硫酸酸化,得到硫酸胍基丁胺粗产物。精氨酸脱羧酶与左旋精氨酸的质量比为1: 20;磷酸吡哆醛与左旋精氨酸的质量比为1:800。控制反应体系的温度为30°C ;控制反应体系的pH值为6。
[0067]精氨酸脱羧酶为经过固定化处理后的精氨酸脱羧酶,精氨酸脱羧酶的固定化处理包括如下步骤:
[0068]I)破碎含精氨酸脱羧酶的工程菌细胞,将工程菌细胞离心后,收集精氨酸脱羧酶液;
[0069]2)将步骤I)所收集的精氨酸脱羧酶液、添加剂和固定化载体按质量比为1:0.6:13加入PH值为6的磷酸盐缓冲溶液中,在25°C下恒温搅拌2h,离心后收集固体,得到固定酶载体;其中,添加剂包括硫酸铁和硫酸镁,硫酸铁和硫酸镁的质量比为1:1;固定化载体由藻土、石英砂、氧化铝和明胶组成,藻土、石英砂、氧化铝和明胶的质量比为2:1:2:4;
[0070]3)将步骤2)中得到的固定酶载体用乙醇洗涤I次,干燥,即得到固定化处理后的精氨酸脱羧酶。
[0071]当脱羧反应进行到第Ih时,向脱羧反应补加左旋精氨酸,补加的左旋精氨酸的质量为初始所加的左旋精氨酸的质量的3/4。
[0072]具体地,采用浓度为0.lmol/L的硫酸对胍基丁胺粗产物进行酸化,使所得硫酸胍基丁胺粗产物的PH值为4。
[0073]对硫酸胍基丁胺粗产物进行纯化,纯化步骤如下:
[0074]I)向硫酸胍基丁胺粗产物中加入活性炭,在40°C下放置2h,再用孔径为0.45um的过滤膜抽滤,将抽滤后所得的溶液在旋转蒸发仪中旋转蒸发去除杂质,得到硫酸胍基丁胺粗晶体;其中,过滤膜可以为硅藻土0.45um膜。其中,活性炭的加入量可使黄色的硫酸胍基丁胺粗产物吸附至无色即可。同时可利用液相色谱-质谱联用技术和高效液相色谱法进行监控,直至底物完全利用。
[0075]2)将步骤I)所得的硫酸胍基丁胺粗晶体用乙醇洗涤,过滤并干燥后,得到纯化的硫酸胍基丁胺晶体。
[0076]本实施例提供的底物左旋精氨酸的转化率为96.8%,所制备纯化的硫酸胍基丁胺晶体的纯度达到99.1%。
[0077]实施例三
[0078]以左旋精氨酸作为底物,以精氨酸脱羧酶作为生物转化催化剂,以磷酸吡哆醛作为辅酶,进行脱羧反应,生成胍基丁胺粗产物,将胍基丁胺粗产物用稀硫酸酸化,得到硫酸胍基丁胺粗产物。精氨酸脱羧酶与左旋精氨酸的质量比为1: 30;磷酸吡哆醛与左旋精氨酸的质量比为1:500。控制反应体系的温度为42°C ;控制反应体系的pH值为7。
[0079]精氨酸脱羧酶为经过固定化处理后的精氨酸脱羧酶,精氨酸脱羧酶的固定化处理包括如下步骤:
[0080]I)破碎含精氨酸脱羧酶的工程菌细胞,将工程菌细胞离心后,收集精氨酸脱羧酶液;
[0081]2)将步骤I)所收集的精氨酸脱羧酶液、添加剂和固定化载体按质量比为1:0.8:10加入PH值为6.5的磷酸盐缓冲溶液中,在35°C下恒温搅拌3h,离心后收集固体,得到固定酶载体;其中,添加剂包括硫酸铁和硫酸镁,硫酸铁和硫酸镁的质量比为1: 1.5;固定化载体由藻土、氧化铝和明胶组成,藻土、氧化铝和明胶的质量比为2:1:1;
[0082]3)将步骤2)中得到的固定酶载体用乙醇洗涤2次,干燥,即得到固定化处理后的精氨酸脱羧酶。
[0083]当脱羧反应进行到第1.5h时,向脱羧反应补加左旋精氨酸,补加的左旋精氨酸的质量为初始所加的左旋精氨酸的质量的2/3。
[0084]具体地,采用浓度为0.lmol/L的硫酸对胍基丁胺粗产物进行酸化,使酸化后的胍基丁胺粗产物,即硫酸胍基丁胺粗产物的PH值为5。
[0085]对硫酸胍基丁胺粗产物进行纯化,纯化步骤如下:
[0086]I)将乙腈、四氢呋喃、甲醇按体积比为2.5:3.5:1混合均匀,得到混合溶剂;
[0087]2)将硫酸胍基丁胺粗产物溶于步骤I)中的混合溶剂中,其中,硫酸胍基丁胺粗产物与混合溶剂的质量比为I: 8,抽滤,得到硫酸胍基丁胺粗晶体;
[0088]3)将步骤2)所得的硫酸胍基丁胺粗晶体用乙醇洗涤,过滤并干燥后,得到纯化的硫酸胍基丁胺晶体。
[0089]底物左旋精氨酸的转化率为97.1%,所制备纯化的硫酸胍基丁胺晶体的纯度达到99.2%。
[0090]实施例四
[0091]以左旋精氨酸作为底物,以精氨酸脱羧酶作为生物转化催化剂,以磷酸吡哆醛作为辅酶,进行脱羧反应,生成胍基丁胺粗产物,将胍基丁胺粗产物用稀硫酸酸化,得到硫酸胍基丁胺粗产物。精氨酸脱羧酶与左旋精氨酸的质量比为1: 50;磷酸吡哆醛与左旋精氨酸的质量比为1:600。控制反应体系的温度为25°C;控制反应体系的pH值为7.5。
[0092]精氨酸脱羧酶为经过固定化处理后的精氨酸脱羧酶,精氨酸脱羧酶的固定化处理包括如下步骤:
[0093]I)破碎含精氨酸脱羧酶的工程菌细胞,将工程菌细胞离心后,收集精氨酸脱羧酶液;
[0094]2)将步骤I)所收集的精氨酸脱羧酶液、添加剂和固定化载体按质量比为1:0.7:12加入PH值为7.5的磷酸盐缓冲溶液中,在28°C下恒温搅拌2.Sh,离心后收集固体,得到固定酶载体;其中,添加剂为硫酸铁;固定化载体为氧化铝;
[0095]3)将步骤2)中得到的固定酶载体用乙醇洗涤3次,干燥,即得到固定化处理后的精氨酸脱羧酶。
[0096]当脱羧反应进行到第2.5h时,向脱羧反应补加左旋精氨酸,补加的左旋精氨酸的质量为初始所加的左旋精氨酸的质量的I /4。
[0097]具体地,采用浓度为0.lmol/L的硫酸对胍基丁胺粗产物进行酸化,使酸化后的胍基丁胺粗产物,即硫酸胍基丁胺粗产物的PH值为4。
[0098]对硫酸胍基丁胺粗产物进行纯化,纯化步骤如下:
[0099]I)将乙腈、四氢呋喃、甲醇按体积比为3.5:5:1混合均匀,得到混合溶剂;
[0100]2)将硫酸胍基丁胺粗产物溶于步骤I)中的混合溶剂中,其中,硫酸胍基丁胺粗产物与混合溶剂的质量比为1:13,抽滤,得到硫酸胍基丁胺粗晶体;
[0101]3)将步骤2)所得的硫酸胍基丁胺粗晶体用乙醇洗涤,过滤并干燥后,得到纯化的硫酸胍基丁胺晶体。
[0102]本
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