脱羧反应进行到第2h时，向脱羧反应补加左旋精氨酸，补加的左旋精氨酸的质量为初始所加的左旋精氨酸的质量的一半。
[0159]具体地，采用浓度为0.lmol/L的硫酸对胍基丁胺粗产物进行酸化，使酸化后的胍基丁胺粗产物，即硫酸胍基丁胺粗产物的PH值为4。
[0160]对硫酸胍基丁胺粗产物进行纯化，纯化步骤如下:
[0161]I)将乙腈、四氢呋喃、甲醇按体积比为3:4:1混合均匀，得到混合溶剂；
[0162]2)将硫酸胍基丁胺粗产物溶于步骤I)中的混合溶剂中，抽滤，得到硫酸胍基丁胺粗晶体；
[0163]3)将步骤2)所得的硫酸胍基丁胺粗晶体用乙醇洗涤，过滤并干燥后，得到纯化的硫酸胍基丁胺晶体。
[0164]底物左旋精氨酸的转化率为92.1%，所制备纯化的硫酸胍基丁胺晶体的纯度达到98.7%。
[0165]对比例二
[0166]以左旋精氨酸作为底物，以精氨酸脱羧酶作为生物转化催化剂，以磷酸吡哆醛作为辅酶，进行脱羧反应，生成胍基丁胺粗产物，将胍基丁胺粗产物用稀硫酸酸化，得到硫酸胍基丁胺粗产物。精氨酸脱羧酶与左旋精氨酸的质量比为1:40;磷酸吡哆醛与左旋精氨酸的质量比为1: 1000。控制反应体系的温度为35 °C ；控制反应体系的pH值为6.5。
[0167]精氨酸脱羧酶为经过固定化处理后的精氨酸脱羧酶，精氨酸脱羧酶的固定化处理包括如下步骤:
[0168]I)破碎含精氨酸脱羧酶的工程菌细胞，将工程菌细胞离心后，收集精氨酸脱羧酶液；
[0169]2)将步骤I)所收集的精氨酸脱羧酶液用卡拉胶固定，得到固定化处理后的精氨酸脱羧酶。
[0170]当脱羧反应进行到第2h时，向脱羧反应补加左旋精氨酸，补加的左旋精氨酸的质量为初始所加的左旋精氨酸的质量的一半。
[0171]对硫酸胍基丁胺粗产物进行纯化，纯化步骤如下:
[0172]I)将乙腈、四氢呋喃、甲醇按体积比为3:4:1混合均匀，得到混合溶剂；
[0173]2)将硫酸胍基丁胺粗产物溶于步骤I)中的混合溶剂中，抽滤，得到硫酸胍基丁胺粗晶体；
[0174]3)将步骤2)所得的硫酸胍基丁胺粗晶体用乙醇洗涤，过滤并干燥后，得到纯化的硫酸胍基丁胺晶体。
[0175]底物左旋精氨酸的转化率为91.1%，所制备纯化的硫酸胍基丁胺晶体的纯度达到98.2%。
[0176]对比例三
[0177]将本发明实施例一获得的硫酸胍基丁胺粗产物采用如下方法进行纯化，具体纯化方法如下:
[0178]对硫酸胍基丁胺粗产物进行纯化，纯化步骤如下:
[0179]I)将硫酸胍基丁胺粗产物溶于乙腈中，抽滤，得到硫酸胍基丁胺粗晶体；
[0180]2)将步骤I)所得的硫酸胍基丁胺粗晶体用乙醇洗涤，过滤并干燥后，得到纯化的硫酸胍基丁胺晶体。
[0181]底物左旋精氨酸的转化率为97.1%，所制备纯化的硫酸胍基丁胺晶体的纯度达到96.2%。
[0182]对比例四
[0183]将本发明实施例一获得的硫酸胍基丁胺粗产物采用如下方法进行纯化，具体纯化方法如下:
[0184]对硫酸胍基丁胺粗产物进行纯化，纯化步骤如下:
[0185]I)将硫酸胍基丁胺粗产物溶于四氢呋喃中，抽滤，得到硫酸胍基丁胺粗晶体；
[0186]2)将步骤I)所得的硫酸胍基丁胺粗晶体用乙醇洗涤，过滤并干燥后，得到纯化的硫酸胍基丁胺晶体。
[0187]底物左旋精氨酸的转化率为97.3%，所制备纯化的硫酸胍基丁胺晶体的纯度达到95.9%。
[0188]对比例五
[0189]将本发明实施例一获得的硫酸胍基丁胺粗产物采用如下方法进行纯化，具体纯化方法如下:
[0190]对硫酸胍基丁胺粗产物进行纯化，纯化步骤如下:
[0191 ] I)将硫酸胍基丁胺粗产物溶于甲醇中，抽滤，得到硫酸胍基丁胺粗晶体；
[0192]2)将步骤I)所得的硫酸胍基丁胺粗晶体用乙醇洗涤，过滤并干燥后，得到纯化的硫酸胍基丁胺晶体。
[0193]底物左旋精氨酸的转化率为97.0%，所制备纯化的硫酸胍基丁胺晶体的纯度达到95.8%。
[0194]将实施例一与对比例一对比可知，在固定化处理精氨酸脱羧酶的过程中，实施例一添加了添加剂，该添加剂可以提高精氨酸脱羧酶的活性。
[0195]将实施例一与对比例二对比可知，以载体固定精氨酸脱羧酶，精氨酸脱羧酶通过共价键或物理作用力固定在载体的表面，与底物左旋精氨酸无障碍接触，与卡拉胶固定相比，也可以显著提高底物左旋精氨酸的转化率。
[0196]实施例一与对比例三、对比例四和对比例五对比可知，在硫酸胍基丁胺粗产物纯化时，先将硫酸胍基丁胺粗产物溶于乙腈、四氢呋喃、甲醇按体积比为3: 4: I抽滤再洗涤，所得晶体纯度更高。
[0197]本发明实施例提供了一种硫酸胍基丁胺的生物转化方法，首先，该方法利用载体固定精氨酸脱羧酶，固定后，精氨酸脱羧酶重复利用10次后反应仍具有酶活，昂贵的酶可以循环利用，节省生产成本，并添加硫酸铁、硫酸镁等添加剂来提高酶活。
[0198]其二，本发明实施例以乙腈、四氢呋喃、甲醇按体积比为3:4:1的混合溶剂和乙醇纯化，使得本发明实施例所得的硫酸胍基丁胺晶体纯度达到98.5%以上，可见所得产品具有高纯度，同时，通过向脱羧反应补加左旋精氨酸能够有效促进反应进行，提高产物的收率。
[0199]其三，本发明实施例提供的方法工艺流程简单，对设备无特殊要求，适用于工业化生产。
[0200]其四，本发明实施例提供的方法与单纯的化学法相比，反应条件温和，操作简便，成本较低，污染少，且能完成在化学反应中难以进行的酶催化反应。
[0201]其五，本发明实施例在生物转化过程中利用液相色谱-质谱联用技术和高效液相色谱法进行监控，直至底物完全利用。
[0202]以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种硫酸胍基丁胺的生物转化方法，其特征在于，所述方法包括:以左旋精氨酸作为底物，以精氨酸脱羧酶作为生物转化催化剂，进行脱羧反应，生成胍基丁胺粗产物，将所述胍基丁胺粗产物用稀硫酸酸化，得到硫酸胍基丁胺粗产物。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括:以磷酸吡哆醛作为辅酶，进行脱羧反应。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述精氨酸脱羧酶与所述左旋精氨酸的质量比不超过0.05 ；所述磷酸啦哆醛与所述左旋精氨酸的质量比不超过0.002。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述精氨酸脱羧酶与所述左旋精氨酸的质量比为1:40;所述磷酸吡哆醛与所述左旋精氨酸的质量比为I: 1000。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述脱羧反应的反应温度为19-46°C;所述脱羧反应的反应体系的pH值为6-10。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述精氨酸脱羧酶为经过固定化处理后的精氨酸脱羧酶，所述精氨酸脱羧酶的固定化处理包括如下步骤: 1)破碎含所述精氨酸脱羧酶的工程菌细胞，将所述工程菌细胞离心后，收集精氨酸脱羧酶液； 2)将步骤I)所收集的所述精氨酸脱羧酶液、添加剂和固定化载体按质量比为1:0.6-0.8: 10-13加入pH值为6-8的缓冲溶液中，在25_35°C下恒温搅拌2_3h，离心后收集固体，得到固定酶载体;其中，所述添加剂包括硫酸铁和硫酸镁中的至少一种;所述固定化载体包括藻土、石英砂、含黏合剂型硅胶、活性氧化钙、脂粉、明胶、氧化铝和高岭土中的至少一种； 3)将步骤2)中得到的所述固定酶载体用乙醇洗涤1-3次，干燥，即得到所述固定化处理后的精氨酸脱羧酶。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述添加剂包括硫酸铁和硫酸镁，所述硫酸铁和所述硫酸镁的质量比为1:2;所述固定化载体为由藻土、石英砂、氧化铝和明胶组成，藻土、石英砂、氧化铝和明胶的质量比为4:1:1: 3。8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，当脱羧反应进行到Ih以后，向所述脱羧反应补加左旋精氨酸。9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，当脱羧反应进行到第2h时，向所述脱羧反应补加左旋精氨酸，补加的左旋精氨酸的质量为初始所加的左旋精氨酸的质量的一半。10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括对所述硫酸胍基丁胺粗产物进行纯化，所述纯化步骤如下: 1)向所述硫酸胍基丁胺粗产物中加入活性炭，在40°c?60°C下放置Ih?2h，再用孔径为0.45um的过滤膜抽滤，将抽滤后所得的溶液蒸发去除杂质，得到硫酸胍基丁胺粗晶体； 2)将步骤I)所得的所述硫酸胍基丁胺粗晶体用乙醇洗涤，过滤并干燥后，得到纯化的硫酸胍基丁胺晶体； 或者所述纯化步骤如下: 1)将乙腈、四氢呋喃、甲醇按体积比为2.5?3.5:3.5?5:1混合均匀，得到混合溶剂； 2)将所述硫酸胍基丁胺粗产物溶于步骤I)中的所述混合溶剂中，其中，所述硫酸胍基丁胺粗产物与所述混合溶剂的质量比为1:8?13，抽滤，得到硫酸胍基丁胺粗晶体； 3)将步骤2)所得的所述硫酸胍基丁胺粗晶体用乙醇洗涤，过滤并干燥后，得到纯化的硫酸胍基丁胺晶体。
【专利摘要】本发明公开了一种硫酸胍基丁胺的生物转化方法，属于医药中间体领域。所述方法包括：以左旋精氨酸作为底物，以精氨酸脱羧酶作为生物转化催化剂，进行脱羧反应，生成胍基丁胺粗产物，将所述胍基丁胺粗产物用稀硫酸酸化，得到硫酸胍基丁胺粗产物。所述方法工艺流程简单，对设备无特殊要求，适用于工业化生产，该方法与单纯的化学法相比，反应条件温和，操作简便，成本较低，污染少，且能完成在化学反应中难以进行的酶催化反应。
【IPC分类】C12N11/14, C12P13/00, C07C279/12, C07C277/08
【公开号】CN105713938
【申请号】CN201610181488
【发明人】陈建华
【申请人】江汉大学
【公开日】2016年6月29日
【申请日】2016年3月28日