血清中肌酐的紫外分光测定方法
【专利摘要】本发明公开了一种血清中肌酐紫外分光测定方法，属于利用可见光，通过测试反应结果颜色的变化来测试材料的方法。本发明的技术方案是：将试剂分为两部分，其中试剂Ⅱ中仅有肌酐亚氨基水解酶有效组分，试剂Ⅰ中含有谷氨酸脱氢酶、α?酮戊二酸、NADH有效成分；其测定方法为：血清先与试剂Ⅰ于37℃温浴3～5分钟，血清中内源性NH3与试剂Ⅰ在谷氨酸脱氢酶作用下反应生成NAD+，加入试剂Ⅱ于37℃温浴4～7分钟，肌酐经肌酐亚氨基水解酶水解后生成NH3，NH3与试剂Ⅰ在谷氨酸脱氢酶作用下反应生成NAD+，在340nm波长处反应速度与同样处理过的标准品比较，第二步反应NADH变化即为血清中肌酐的含量。
【专利说明】
血清中肌野的紫外分光测定方法
技术领域
[0001] 本发明设及一种测定血清中肌酢含量的方法，属于一种包含酶的测定方法;或是 利用可见光，通过测试反应的结果产生颜色变化来测试材料的方法，特别是设及一种用生 化分析仪快捷、准确检测血清中肌酢的紫外分光测定方法。
【背景技术】
[0002] 肌酢又称甲基脈基乙酸内酷胺，分子式为C边70N3，是一种相对分子质量较小(分子 量113.12)，烙点255°C，具有水溶性(80.1 g/L，16°C)的极性有机含氮化合物，肌酢在肌肉中 从憐酸肌酸通过自发和不可逆转化而形成。正常情况下，人体内肌酢含量基本稳定，一般维 持在3~14mg/L，肾脏机能受损时，肌酢的正常排泄受到阻碍，血清中肌酢含量增加，因此血 清肌酢含量是反映肾脏功能的重要指标。Jaffe在1886年发现肌酢和苦味酸在碱性环境中 反应时，可生成一种红色物质，Green-wald第1个系统地研究了化ffe反应的化学过程，认为 Jaffe反应的红色产物是肌酢与苦味酸之间生成1:1和1;2的络合物。一些肌酢的同系物或 衍生物如脈基乙酸内酷胺，5-甲基脈基乙酸内酷胺W及乙酷乙酸、丙酬酸、胆红素、乙内酷 脈等物质均能和苦味酸发生反应，运些物质称为"假肌酢"，可导致肌酢测定结果偏高，大量 的假肌酢存在于红细胞中，因此，肌酢的测定不宜采用全血法测定，目前肌酢主要是利用肌 酢在肌酢氨基水解酶、肌酸脉基水解酶、肌氨酸氧化酶、过氧化物酶等酶及显色剂和水、氧 的共同作用下生成酿亚胺(红色），在505nm波长下测定其吸光度A，其A值的大小和样品中肌 酢的含量成正比的原理而设计的。肌氨酸氧化酶法灵敏度高，线性范围宽，试剂稳定性好。 其主要干扰物为样品中肌酸，为去除肌酸的干扰，可采用双试剂在试剂中去除肌酸的干扰。 肌酢酶偶联肌氨酸氧化酶法的指示系统是化inder反应，Trinder系统明显受维生素 C的干 扰。毛细管电泳是近10年来才进入实际应用的一种仪器分析方法，分离效率高，分析速度 快，样品用量少，自动化程度高。Seki等采用柱切换技术检测血清中的肌酢，同位素稀释质 谱法（ID/MS)通过向样品溶液中加入一种同位素标记物作为内标物，在溶质与标记物溶液 充分平衡W后，对样品进行预处理，利用GC或LC-MS现憶标记物与溶质的峰强度比来测定肌 酢的浓度。
[0003] 本发明的技术方案是：血清中内源性N出在谷氨酸脱氨酶催化下与a-酬戊二酸、 NADH反应生成NAD+后，加入试剂n肌酢亚氨基水解酶水解肌酢生成N-甲基乙内酷脈和畑3， 生成的N也在谷氨酸脱氨酶催化下与a-酬戊二酸、NADH反应生成NAD% W第一步反应为空白， W第二步反应生成的MD+计算出肌酢的含量，如反应式（1)(2)(3),本发明方法不同于一步 法，一步法易受内源性N也的干扰而使结果偏高，本发明采用两步酶法克服了内源性N也的干 扰，同时也克服了血清试剂本底颜色的干扰，目前，临床实验室常采用肌酢氧化酶法测定肌 酢，但此法所用工具酶多，杂酶干扰大，易受还原性物质干扰，因此，本发明克服了上述缺 点。
[0004] 反应过程为：
[0005] 第一步反应
[0006]
[0007]
[000引
[0009]
[0010] 解决的问题是：我们所用的仅W肌酢亚氨基水解酶为第二试剂的两步酶测定方 法，由于第一步反应体系中有谷氨酸脱氨酶、a-酬戊二酸、NADH有效成分，血清中内源性N出 与试剂I在谷氨酸脱氨酶作用下反应生成NAD%加入试剂n于37°C溫浴4~7分钟，肌酢经肌 酢亚氨基水解酶水解后生成N曲，N曲在谷氨酸脱氨酶作用下反应生成NAD%在34化m波长处 反应速度与同样处理过的标准品比较，第二步反应NADH变化即为血清中肌酢的含量。
【发明内容】
：
[0011] 为了能简单及准确地测定肌酢，本发明提供一种经济方便易行，准确性高、不受内 源性N出影响的血清两步酶测定方法。
[0012] 本发明采用的技术方案是:将试剂分为两部分，其中试剂n中仅有肌酢亚氨基水 解酶有效组分，试剂I中含有谷氨酸脱氨酶、Q-酬戊二酸、NADH有效成分;其测定方法为:血 清先与试剂I于37°C溫浴3~5分钟，血清中内源性N出在谷氨酸脱氨酶作用下反应生成NA护， 加入试剂n于37°C溫浴4~7分钟，肌酢经肌酢亚氨基水解酶水解后生成NH3，N出在谷氨酸脱 氨酶作用下反应生成NA护，在340皿波长处反应速度与同样处理过的标准品比较，第二步反 应NADH变化即为血清中肌酢的含量。
[OOU]肌酢浓度=FXAODcrMt
[0014] A ODcr/ A t是单位时间内肌酢产生的速率，F是校正因数。
[0015] 本发明与现有技术相比有如下优点：
[0016] 1.本发明的方法检测时不受内源性N出影响。由于内源性N出在加入试剂I就完成反 应，不会参与第二步反应，因此排除了内源性N出的影响，使N出的生成肌酢成等比关系，检测 数据能真实反映肌酢的状况。
[0017] 2.本发明使用方法和范围与原有两步酶法相同，不增加实验人员的负担，不增加 试剂成本，本方法能用于血清和尿液肌酢检测，如采用单一试剂肌酢的紫外分光测定方法 易受内源性N出的干扰而使测定结果偏低。
[0018] 如上所述，本发明是一种经济方便易行，准确性更高的肌酢检测方法。今后可广泛 应用于临床检测。
【附图说明】
[0019] 图1是本发明测定健康人体血清中肌酢紫外分光测定方法的反应曲线图。
【具体实施方式】：
[0020] 下面通过实施例对本发明做进一步详细说明。
[0021] 实施例1
[0022] 试剂的组成：
[0023] a.试剂 I:
[0024] Tris-盐酸缓冲液 lOOmmol/L，谷氨酸脱氨酶 2500U/L，a-酬戊二酸 100mmol/L，NADH 1.3mmol/L，P;roclin-300 20化1。
[0025] b.试剂 n:
[00%] 试剂n内含化is-盐酸缓冲液lOOmmol/L，肌酢亚氨基水解酶1000U/L，Proclin- 300 20化1。
[0027] C.标准液:265皿ol/L肌酢标准血清(市售）。
[002引其中Proclin-300为液体高效防腐剂。
[0029] 实施例2
[0030] 测定程序
[0031 ]双试剂法:在日本OLYMPUS AU2700全自动化生化分析仪上，仪器自动将化1样品加 入到22扣1试剂I中混匀，37 °C解育3分钟，加入75iil试剂n混匀，37 °C解育5.1分钟，全自动 分析仪在340nm波长处检测，仪器自动计算出肌酢结果，反应参数见表1。
[0032]表1.本发明自动化生化分析仪测试条件 [00331
1234567891011 肌酢浓度=F X A ODcr/ A t 2 其中A ODcr/At是单位时间内肌酢产生的速率，F是校正因数，测定方法为带标准 的速率法，其实时反应曲线如附图1所示。 3 下面通过采用本方法与肌酢氧化酶法测定肌酢比较来说明本研究方法的准确性。 4 1.检测对象：待检者102例，其中男58人，平均年龄43.5岁；女性44人，平均年龄 42.5岁，至腹静脉义血2 mL。 5 2.采用方法及试剂 6 2.1 试剂： 7 (1)本发明方法采用实施例1中的试剂I、试剂n。 8 (2)肌酢氧化酶方法采用北京利德曼生化股份有限公司生产的肌酢试剂盒。 9 2.2.仪器：（1)日本Olympus AU2700型全自动生化分析仪。 10 2.3.方法 11 2.3.1肌酢氧化酶法样品：试剂=1:60:20，37°C，样品与试剂I溫浴3分钟，加入试 剂n后，反应5.1分钟，600nm波长处终点法测定。
[0045] 2.3.2本发明方法样品：试剂I:试剂n=l:75: 25。37 °C，样品与试剂I溫浴3分钟， 加入试剂n后，反应5.1分钟，340nm波长处速率法测定。
[0046] 2.3.3本发明方法与肌酢氧化酶法测定结果统计学比较:两种方法测定结果比较 无显著性差异(t = 3.3689，P〉0.05，n = 102);
[0047] Y才趙肋法=0.9869栅WWW猫-0.1128，r2 = 0.9866，两种方法呈良好相关性，本发明 方法技术指标为:线性范围达1.1~4500皿01/L，平均回收率为99.2 %，高、中、低批内变异 系数和批间变异系数分别为0.46%~2.30%和097%~2.45%，健康人群的血清肌酢参考 范围为55~10祉mol/L(男性）、46~89WH01(女性）。本专利具有选择性好、灵敏度高、测定简 便、抗干扰能力强等优点，可用于血、尿肌酢检测，可满足不同层次的临床实验室需要，适合 临床推广应用。
[0048] 经过W上比较可看出，本发明采用肌酢亚氨基水解酶偶联谷氨酸脱氨酶法虽与现 有试剂配方组成基本相同，但因谷氨酸脱氨酶、Q-酬戊二酸、NADH有效成分同在试剂I中，试 剂II仅有肌酢亚氨基水解酶，所W血清加入试剂后发生的反应与单一试剂方法的反应所包 含的待测物N出的含量不同，测定结果不同，实际效果也完全不一样。因此，本发明通过改变 试剂I、n的组分能够保证血清中肌酢检测的准确性，本方法所用工具酶少，干扰少，结果更 加可靠。
【主权项】
1. 一种血清中肌酐的紫外分光测定方法，其特征在于将试剂分为两部分，其中试剂π 中仅有肌酐亚氨基水解酶有效组分，试剂I中含有谷氨酸脱氢酶、α-酮戊二酸、NADH有效成 分;其测定方法为:血清先与试剂I于37°C温浴3~5分钟，血清中内源性ΝΗ 3与试剂I在谷氨 酸脱氢酶作用下反应生成NAD+，加入试剂Π 于37°C温浴4~7分钟，肌酐经肌酐亚氨基水解 酶水解后生成NH3，NH3在谷氨酸脱氢酶作用下反应生成NAD+，在340nm波长处反应速度与同 样处理过的标准品比较，第二步反应NADH变化即为血清中肌酐的含量。2. -种血清中肌酐的紫外分光测定方法，其特征在于试剂I内含Tris-盐酸缓冲液80~ 120mmol/L，谷氨酸脱氢酶2000~3000U/L，a-酮戊二酸80~120mmol/L，NADH 1 · 2~ 1.4mmol/L，Proclin-300150~250μ1;试剂Π 内含Tris-盐酸缓冲液80~120mmol/L，肌酐亚 氨基水解酶800 ~1200U/L，Proclin-300 150 ~250μ1。3. -种血清中肌酐的紫外分光测定方法，其特征在于试剂I及试剂Π 中防腐剂选自 Proclin-300〇4. 一种血清中肌酐的紫外分光测定方法，其特征在于试剂I和试剂Π 中Tris-盐酸缓冲 液的pH值为7.8 ±8.2。5. -种血清中肌酐的紫外分光测定方法，其特征在于测定所用各物品的体积比为:样 品：试剂I:试剂II = 1:70~80:20~30。
【文档编号】C12Q1/32GK105861631SQ201610398750
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年6月6日
【发明人】李立和, 孙长青, 王辉, 刘冰, 杨朕
【申请人】天津市宝坻区人民医院