一种用于细胞精细分选、计数和检测的微流控芯片装置的制造方法
【专利摘要】本发明提供一种用于细胞精细分选、计数和检测的微流控芯片装置，包括微流控芯片以及设置在所述微流控芯片一侧的激光计数部件和拉曼激光采谱与检测部件，所述微流控芯片包括上层辅助结构、中层筛选区和下层鞘流计数检测区，所述上层辅助结构覆盖在中层筛选区之上，所述中层筛选区覆盖在下层鞘流计数检测区之上。本发明基于二次流狄恩流惯性效应和柱形筛选结构按大小对细胞进行分选，所集成的激光计数部件和拉曼激光采谱与检测部件可在细胞分选完成后对所分选的细胞进行计数和检测；本发明集成度较高，是一种不损伤细胞、高性价比、多功能、微型化的细胞分选、计数和检测工具。
【专利说明】一种用于细胞精细分选、计数和检测的微流控芯片装置
[0001]
技术领域
[0002]本发明涉及微流控芯片和生物医药研究、生化检测技术领域，具体是一种基于二次流狄恩流惯性效应的用于细胞精细分选、计数和检测的微流控芯片装置。
[0003]
【背景技术】
[0004]各种细胞分离和筛查方法在医疗诊断、临床治疗、细胞生物学等领域中担当着不可缺少的重要角色。目前使用较为广泛的细胞分选方法是膜过滤法和流式细胞分析术，膜过滤法的最大缺点是膜孔易被细胞堵塞，导致分离效率降低、样品损失和污染等。流式细胞分析术(荧光激活细胞分类术)的主要缺点是仪器较大、需要样品剂量大、操作复杂，只能依赖于中心实验室，由专业人员操控，且操作过程影响细胞活性。由传统流式细胞分析术演化而来的磁性激活细胞分选法，具有通量高、特异性强和分选纯度高等优点。但是需要对目标细胞进行独特的抗体修饰，增加了细胞分选过程的复杂度，延长了实验周期，最主要的是破坏了细胞的原始状态，从而制约了该技术的推广使用。此外，上述细胞分离方法不能与其他的分析检测装置集成或结合，无法应用于构建更为复杂的检测与分析系统，目前所存在的细胞分选方法已经无法满足日新月异的细胞检测的需求。
[0005]微流控芯片是一种可以操作微量级样品的微小器件，在微流控芯片上集成有许多细小的微通道，以便流体通过和对其进行操作。
[0006]在微流控芯片上设置弯曲通道，当流体流经弯曲通道时，除了沿弯曲通道向前运动外，在垂直于流动方向的横截面上会形成一对反向涡流，它们在弯曲通道的中部向管壁内侧运动，而在顶部和底部向管壁外侧运动，这种流动称为二次流狄恩流。在狄恩流惯性效应的作用下，流体中的细胞按大小排列在弯曲通道横截面内，沿弯曲通道向前运动形成各自的流通路线，最终在出口处按照水平位置的不同进入不同的分选通道中。
[0007]利用狄恩流惯性效应进行细胞分选的优势在于:利用高流速实现狄恩流惯性效应，在微通道内对一定尺寸的微粒或细胞进行流动排列，大大提高了处理样品的通量;分选时无需施加任何外力如电磁力、机械力等，不会损害细胞活力;芯片装置结构简单，体积小，无需机械或电子部件，易于作为功能模块与现有的一些芯片实验室系统集成结合。凭借相关优点，利用狄恩流惯性效应的细胞分选微流控芯片在生物分析和临床医学等领域得到广泛应用。
[0008]通过查阅国内外相关文献和自主实验发现，目前各种基于狄恩流效应的细胞分选微流控芯片具有较高的分选效率，一般可以达到80%以上;然而只在狄恩流惯性效应的作用下，始终会有少数其他尺寸的细胞混杂在某一单一尺寸的细胞流通路线中，进入指定的分选通道中，降低了最终的分选率，在自主实验中也发现了这一现象。
[0009]
【发明内容】
[0010]本发明的目的在于提供一种用于细胞精细分选、计数和检测的微流控芯片装置，该装置采用基于二次流狄恩流惯性效应和柱形筛选结构的微流控芯片对细胞按大小进行分选，并集成激光计数部件、拉曼激光采谱与检测部件，可在细胞分选完成后对所分选的细胞进行计数和检测。
[0011]本发明的技术方案为:
一种用于细胞精细分选、计数和检测的微流控芯片装置，包括微流控芯片以及设置在所述微流控芯片一侧的激光计数部件和拉曼激光采谱与检测部件，所述微流控芯片包括上层辅助结构、中层筛选区和下层鞘流计数检测区，所述上层辅助结构覆盖在中层筛选区之上，所述中层筛选区覆盖在下层鞘流计数检测区之上；
所述上层辅助结构上设有待分选样品液上层入口、夹持流上层入口、剩余样品液上层出口和鞘流液上层出口，所述中层筛选区上设有待分选样品液中层入口、单螺旋状弯曲微通道、已分选样品液中层出口、剩余样品液中层出口、夹持流中层过渡口和鞘流液中层过渡口，所述下层鞘流计数检测区上设有已分选样品液下层入口、夹持流下层入口、微通道和鞘流液下层出口；
所述待分选样品液上层入口与待分选样品液中层入口连通，所述已分选样品液中层出口与已分选样品液下层入口连通，所述剩余样品液中层出口与剩余样品液上层出口连通，所述夹持流上层入口通过夹持流中层过渡口与夹持流下层入口连通，所述鞘流液下层出口通过鞘流液中层过渡口与鞘流液上层出口连通；
所述单螺旋状弯曲微通道具有若干个螺旋圈，每个螺旋圈中均设有柱形筛选结构，所述柱形筛选结构由若干行均匀排列的圆柱构成，由内而外的各个螺旋圈中的柱形筛选结构，其圆柱之间的距离依次减小;所述单螺旋状弯曲微通道的内侧或外侧设有旁侧通道，所述旁侧通道的一端与单螺旋状弯曲微通道连通，另一端与已分选样品液中层出口连通；所述下层鞘流计数检测区划分为聚焦区域、计数区域和采谱检测区域，所述已分选样品液和夹持流在聚焦区域汇聚成鞘流，所述鞘流用于对已分选的同尺寸细胞进行聚焦，使同尺寸细胞排列成行逐个通过计数区域和采谱检测区域。
[0012]所述的用于细胞精细分选、计数和检测的微流控芯片装置，所述激光计数部件包括激光器、信号接收器和数据处理系统，所述激光器输出的激光束垂直于计数区域入射，所述信号接收器的输出端与数据处理系统的输入端连接。
[0013]所述的用于细胞精细分选、计数和检测的微流控芯片装置，所述拉曼激光采谱与检测部件包括拉曼激光光源、检测器和拉曼信号处理系统，所述拉曼激光光源输出的激光束垂直于采谱检测区域入射，所述检测器的输出端与拉曼信号处理系统的输入端连接。
[0014]所述的用于细胞精细分选、计数和检测的微流控芯片装置，所述聚焦区域的微通道为类十字形，由主通道和设置在主通道两侧且夹角小于90度的两个侧通道构成;所述主通道的一端与已分选样品液下层入口连通，另一端分别与两个侧通道的一端连通，所述两个侧通道的另一端分别与夹持流入口连通。
[0015]所述的用于细胞精细分选、计数和检测的微流控芯片装置，所述计数区域和采谱检测区域的微通道均为直线形。
[0016]所述的用于细胞精细分选、计数和检测的微流控芯片装置，所述上层辅助结构、中层筛选区和下层鞘流计数检测区均为长方形，其中，所述中层筛选区和下层鞘流计数检测区均由一块整体的PDMS板构成。
[0017]本发明的有益效果为:
由上述技术方案可知，本发明提供了一种集成度较高、不损伤细胞、高性价比、多功能、微型化的细胞分选检测工具，本发明中的微流控芯片无需施加任何外力如电磁力、机械力等，只利用自身的单螺旋状弯曲微通道特性形成的狄恩流惯性效应即可对细胞按大小进行分选，并通过在单螺旋状弯曲微通道各个螺旋圈中增加柱形筛选结构和旁侧通道，进一步提高了基于狄恩流惯性效应进行细胞分选的效率，从而提高了微流控芯片分选细胞的精确性和可靠性。
[0018]本发明将多种分析检测手段相结合，利用鞘流对细胞进行聚焦，利用激光对分选、聚焦后的细胞进行计数，利用拉曼光谱对细胞进行采样，是一种较为复杂的多功能、高集成化的微流控芯片检测与分析系统，具有快速、高通量、高效率、多功能、集成化和微型化等特点，有望在生物分析和临床医学等领域得到广泛应用。
[0019]
【附图说明】
[0020]图1是本发明的微流控芯片的整体结构示意图；
图2是本发明的微流控芯片的单螺旋状弯曲微通道的结构示意图；
图3是本发明的微流控芯片的柱形筛选结构和旁侧通道的分布示意图；
图4是本发明的微流控芯片利用弯曲微通道形成狄恩流惯性效应的原理示意图；
图5是本发明的微流控芯片利用柱形筛选结构去除单一尺寸细胞流通路线中少数其他尺寸细胞的示意图；
图6是本发明的微流控芯片利用鞘流对细胞聚焦排列成行的原理示意图；
图7是本发明的激光计数部件结构示意图；
图8是本发明的拉曼激光采谱与检测部件结构示意图。
[0021]
【具体实施方式】
[0022]下面结合附图和具体实施例进一步说明本发明。
[0023]如图1、图2所示，一种用于细胞精细分选、计数和检测的微流控芯片装置，包括由上层辅助结构1、中层筛选区2和下层鞘流计数检测区3构成的微流控芯片以及设置在微流控芯片一侧的激光计数部件4、拉曼激光采谱与检测部件5。上层辅助结构I覆盖在中层筛选区2上，中层筛选区2覆盖在下层鞘流计数检测区3上。
[0024]上层辅助结构I是一块长方形的玻璃盖板，其上有很多微孔，便于接通微管。上层辅助结构I起到支撑、密封中层筛选区2和下层鞘流计数检测区3的作用，同时上层辅助结构I上开设有待分选样品液上层入口 11、夹持流上层入口 12、剩余样品液上层出口 13和鞘流液上层出口 14。其中，待分选样品液上层入口 11为包含待分选细胞的样品液从外界流入的接口，夹持流上层入口 12为夹持流从外界流入的接口；剩余样品液上层出口 13为经过分选的剩余样品液流出的接口 ；鞘流液上层出口 14为鞘流液流出的接口。
[0025]中层筛选区2呈长方形，由一块整体的PDMS板构成，其上有很多微通道结构，主要负责实现微通道中待分选样品液流通、对待分选样品液中的细胞进行分选的功能。中层筛选区2包括若干待分选样品液中层入口 21、单螺旋状弯曲微通道22、若干已分选样品液中层出口 23、剩余样品液中层出口 24、夹持流中层过渡口 25和鞘流液中层过渡口 26。其中，待分选样品液中层入口 21与待分选样品液上层入口 11连通，为待分选样品液流入中层筛选区2的接口；单螺旋状弯曲微通道22有一定的旋转圈数，具体圈数根据需要进行分选的细胞的种类数进行设置，利用单螺旋状弯曲微通道22可以形成二次流狄恩流惯性效应对细胞按大小进行分选;已分选样品液中层出口23为包含已分选单一尺寸细胞的样品液流出中层筛选区2的接口；剩余样品液中层出口 24与剩余样品液上层出口 13连通，为经过分选的剩余样品液流出中层筛选区2的接口 ；夹持流中层过渡口 25与夹持流上层入口 12连通，为夹持流从上层辅助结构I流入下层鞘流计数检测区3的过渡接口；鞘流液中层过渡口 26与鞘流液上层出口 14连通，为鞘流液从下层鞘流计数检测区3流入上层辅助结构I的过渡接口。
[0026]下层鞘流计数检测区3呈长方形，同样由一块整体的PDMS板构成，其上有一些微通道结构，主要负责实现已分选样品液在微通道中流通、对已分选样品液中的细胞进行聚焦、计数和检测的功能。下层鞘流计数检测区3上开设有若干已分选样品液下层入口 31和若干鞘流液下层出口32。其中，已分选样品液下层入口31与已分选样品液中层出口23连通，为包含已分选单一尺寸细胞的样品液从中层筛选区2流入下层鞘流计数检测区的接口；鞘流液下层出口 32与鞘流液中层过渡口 26连通，为鞘流液从下层鞘流计数检测区3流出的接口。
[0027]如图3所示，单螺旋状弯曲微通道22的某一区域设有柱形筛选结构，包括第一柱形筛选结构27、第二柱形筛选结构28、第三柱形筛选结构29和第四柱形筛选结构210，均由若干行排列整齐的圆柱构成，从内到外，设置在单螺旋状弯曲微通道22不同螺旋圈中构成柱形筛选结构的圆柱之间的距离逐渐减小，主要负责去除单一尺寸的细胞流通路线中的少数其他尺寸的细胞。其中，第一柱形筛选结构27设置在单螺旋状弯曲微通道22的第一个螺旋圈中，构成第一柱形筛选结构27的圆柱之间的距离是最大的，第二柱形筛选结构28、第三柱形筛选结构29和第四柱形筛选结构210依次设置在单螺旋状弯曲微通道22的第二个至第四个螺旋圈中，构成第二柱形筛选结构28、第三柱形筛选结构29和第四柱形筛选结构210的圆柱之间的距离依次减小。单螺旋状弯曲微通道22的内侧(或外侧)设有旁侧通道211，主要负责将不能通过柱形筛选结构，且受到狄恩力侧向推动作用的细胞经由已分选样品液中层出口 23导出到下层鞘流计数检测区3。
[0028]如图4所示，当待分选样品液流经单螺旋状弯曲微通道22时，除了沿流道向前运动夕卜，在单螺旋状弯曲微通道22的横截面上会形成一对流动方向相对的狄恩流213，它们在流道中部向管壁内侧运动，而在顶部和底部向管壁外侧运动。单螺旋状弯曲微通道22的横截面垂直于待分选样品液流动方向212。
[0029]在狄恩流惯性效应的作用下，待分选样品液中的细胞按大小排列在单螺旋状弯曲微通道22的横截面内，沿单螺旋状弯曲微通道22向前运动形成各自的流通路线。当不同尺寸的细胞沿各自的流通路线向前运动到设有柱形筛选结构的区域时，尺寸比柱形筛选结构的圆柱之间距离小的细胞得以通过柱形筛选结构，进入单螺旋状弯曲微通道22的下一个螺旋圈中，尺寸比柱形筛选结构的圆柱之间距离大的细胞则不能通过柱形筛选结构，而在单螺旋状弯曲微通道22的横截面上的狄恩力214的侧向推动作用下，进入设置在单螺旋状弯曲微通道22—侧的旁侧通道211中，防止细胞在柱形筛选结构附近团聚，形成堵塞。
[0030]由于从内到外，单螺旋状弯曲微通道22各个螺旋圈上构成柱形筛选结构的圆柱之间的距离逐渐减小，在第一个螺旋圈首先分离出尺寸最大的细胞，在第二个螺旋圈首先分离出尺寸稍小的细胞，在后几个螺旋圈中依次分选出尺寸逐渐减小的细胞。单螺旋状弯曲微通道22各个螺旋圈中设置的柱形筛选结构有效过滤了混杂在某一单一尺寸的细胞流通路线中的少数其他尺寸的细胞，因此进一步提高了基于狄恩流效应进行细胞分选的效率，提高了微流控芯片分选细胞的精确程度和可靠性。
[0031]如图5所示，当大尺寸细胞61、中等尺寸细胞62、小尺寸细胞63和最小尺寸细胞64沿待分选样品液流动方向212向前运动至设置在单螺旋状弯曲微通道22的第一个螺旋圈中的第一柱形筛选结构27前，构成第一柱形筛选结构27的圆柱之间的距离是最大的。因此，大尺寸细胞61将无法通过第一柱形筛选结构27，而尺寸较小的中等尺寸细胞62、小尺寸细胞63和最小尺寸细胞64将穿过第一柱形筛选结构27沿待分选样品液流动方向212进入到单螺旋状弯曲微通道22的下一个螺旋圈中。无法穿过第一柱形筛选结构27不能进入到单螺旋状弯曲微通道22的下一个螺旋圈中的大尺寸细胞61，在单螺旋状弯曲微通道22的横截面上的狄恩力214的侧向推动作用下，进入设置在单螺旋状弯曲微通道22—侧的旁侧通道211中，并通过相应的已分选样品液中层出口 23进入下层鞘流计数检测区3。
[0032]如图6所示，下层鞘流计数检测区3划分为聚焦区域34、计数区域35和采谱检测区域36。聚焦区域34中微通道的形状为“Y”型十字形，当包含按大小分选完成后的同尺寸细胞65的已分选样品液从已分选样品液下层入口 31流入聚焦区域34的主通道时，从夹持流上层入口 12经由夹持流中层过渡口 25向夹持流下层入口 33输入夹持流，夹持流从聚焦区域34的两侧通道流入主通道中，与已分选样品液汇聚形成鞘流。鞘流是指流体在侧向挤压效应作用下，形成类似于鞘形状的压缩流动形态。通过鞘流对已分选的同尺寸细胞65进行聚焦，使同尺寸细胞65排列成行逐个通过计数区域35和采谱检测区域36。计数区域35和采谱检测区域36中微通道的形状为直线式，主要为分选、聚焦后的细胞的计数和采谱检测提供操作空间。
[0033]如图7所示，激光计数部件4包括激光器41、信号接收器42和数据处理系统43，激光器41输出的激光束垂直于计数区域35入射。激光器41持续发出激光信号，当同尺寸细胞65通过激光束时，会对光线产生折射和反射，通过信号接收器42采集到折射和反射的信号，在数据处理系统43中以一个峰值的形式进行记录。每通过一个同尺寸细胞65，就会产生一个峰值，最后记录峰值出现的总次数，即得到同尺寸细胞65的个数。
[0034]如图8所示，拉曼激光采谱与检测部件5包括拉曼激光光源51、检测器52和拉曼信号处理系统53，拉曼激光光源51输出的激光束垂直于采谱检测区域36入射。拉曼激光光源51发出激光信号，当同尺寸细胞65通过拉曼激光束时，通过检测器52记录同尺寸细胞65使入射光线发生散射的拉曼信号，通过拉曼信号处理系统53对拉曼信号进行处理，完成对同尺寸细胞65的采谱和检测。
[0035]以上所述实施方式仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。
【主权项】
1.一种用于细胞精细分选、计数和检测的微流控芯片装置，其特征在于:包括微流控芯片以及设置在所述微流控芯片一侧的激光计数部件和拉曼激光采谱与检测部件，所述微流控芯片包括上层辅助结构、中层筛选区和下层鞘流计数检测区，所述上层辅助结构覆盖在中层筛选区之上，所述中层筛选区覆盖在下层鞘流计数检测区之上； 所述上层辅助结构上设有待分选样品液上层入口、夹持流上层入口、剩余样品液上层出口和鞘流液上层出口，所述中层筛选区上设有待分选样品液中层入口、单螺旋状弯曲微通道、已分选样品液中层出口、剩余样品液中层出口、夹持流中层过渡口和鞘流液中层过渡口，所述下层鞘流计数检测区上设有已分选样品液下层入口、夹持流下层入口、微通道和鞘流液下层出口； 所述待分选样品液上层入口与待分选样品液中层入口连通，所述已分选样品液中层出口与已分选样品液下层入口连通，所述剩余样品液中层出口与剩余样品液上层出口连通，所述夹持流上层入口通过夹持流中层过渡口与夹持流下层入口连通，所述鞘流液下层出口通过鞘流液中层过渡口与鞘流液上层出口连通； 所述单螺旋状弯曲微通道具有若干个螺旋圈，每个螺旋圈中均设有柱形筛选结构，所述柱形筛选结构由若干行均匀排列的圆柱构成，由内而外的各个螺旋圈中的柱形筛选结构，其圆柱之间的距离依次减小;所述单螺旋状弯曲微通道的内侧或外侧设有旁侧通道，所述旁侧通道的一端与单螺旋状弯曲微通道连通，另一端与已分选样品液中层出口连通； 所述下层鞘流计数检测区划分为聚焦区域、计数区域和采谱检测区域，所述已分选样品液和夹持流在聚焦区域汇聚成鞘流，所述鞘流用于对已分选的同尺寸细胞进行聚焦，使同尺寸细胞排列成行逐个通过计数区域和采谱检测区域。2.根据权利要求1所述的用于细胞精细分选、计数和检测的微流控芯片装置，其特征在于:所述激光计数部件包括激光器、信号接收器和数据处理系统，所述激光器输出的激光束垂直于计数区域入射，所述信号接收器的输出端与数据处理系统的输入端连接。3.根据权利要求1所述的用于细胞精细分选、计数和检测的微流控芯片装置，其特征在于:所述拉曼激光采谱与检测部件包括拉曼激光光源、检测器和拉曼信号处理系统，所述拉曼激光光源输出的激光束垂直于采谱检测区域入射，所述检测器的输出端与拉曼信号处理系统的输入端连接。4.根据权利要求1所述的用于细胞精细分选、计数和检测的微流控芯片装置，其特征在于:所述聚焦区域的微通道为类十字形，由主通道和设置在主通道两侧且夹角小于90度的两个侧通道构成;所述主通道的一端与已分选样品液下层入口连通，另一端分别与两个侧通道的一端连通，所述两个侧通道的另一端分别与夹持流入口连通。5.根据权利要求1所述的用于细胞精细分选、计数和检测的微流控芯片装置，其特征在于:所述计数区域和采谱检测区域的微通道均为直线形。6.根据权利要求1所述的用于细胞精细分选、计数和检测的微流控芯片装置，其特征在于:所述上层辅助结构、中层筛选区和下层鞘流计数检测区均为长方形，其中，所述中层筛选区和下层鞘流计数检测区均由一块整体的PDMS板构成。
【文档编号】C12M1/34GK105907633SQ201610302536
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年5月6日
【发明人】赵爱武, 孙恒辉, 王大朋, 史庆华
【申请人】中国科学院合肥物质科学研究院