分级分离方法

分级分离方法
【专利摘要】一种从制剂纯化IgG抗体的方法，其包括提供相比于从中获得所述制剂的样品的染色质水平具有显著降低的染色质水平的形式的所述制剂，和使所述制剂与正电膜接触，所述正电膜具有下述的孔隙度，所述孔隙度保留至少50％的流体动力学直径大于所选大小的未被吸附的溶质，但允许流体动力学直径小于所述所选大小的未被吸附的溶质通过，其中所述所选大小为约10nm到约15nm，其中在所述接触步骤的至少一部分期间，所述制剂包含盐，使得(1)当以小于50mM的浓度存在时，pH值在约3到所述制剂中的所述IgG抗体的最碱性糖型的等电点的0.5个pH单位内的范围；或(2)当以大于50mM的浓度存在时，所述制剂的pH值在3到9的范围；以及将操作条件调节为不导致超过5％的所述抗体结合到所述膜的最高pH值和最低盐浓度。
【专利说明】分级分离方法
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求于2014年2月19日提交的美国临时专利申请号61 /941，911的优先权， 其全部公开内容以引用方式并入本文中。
【背景技术】
[0003] 本文所公开的实施方案涉及用于纯化抗体、特别是IgG抗体的方法。
[0004]阴离子交换色谱已被用于纯化IgG抗体，因为它选择性地结合酸性污染物，而IgG 微弱地结合阴离子交换剂表面，完全不结合阴离子交换剂表面，或者它从阴离子交换剂表 面被排斥。这提供了从抗体中消除酸性污染物的一种方便有效的手段。阴离子交换色谱的 通常实施的示例包括：向含IgG的样品中大量添加带正电荷的聚合物或粒子、使所述样品通 过呈流通或空隙排阻模式的填充有阴离子交换粒子的柱;或高效正切流动过滤技术，其中 在极低的盐浓度下仅仅通过它们与膜的表面上的带正电荷的基团的静电排斥而阻止抗体 通过膜孔。除以空隙排阻模式操作的粒子填充柱上的阴离子交换（R.Nian等， J.Chromatogr.A 1282(2013)127-132)以外，所有阴离子交换方法均需要首先将样品平衡 到适于结合污染物的化学条件。这限制了阴离子交换的适用性，因为它意味着来自先前分 级分离步骤的样品必须在被施加到阴离子交换剂之前进行缓冲液交换，以使所述条件适于 实施所述技术。更高限制性的选择是，必须对先前的分级分离步骤本身进行选择，以使得在 完成所述分级分离步骤时被加工的IgG已经被提供在适于施加到阴离子交换剂的条件下。 这些限制特别加重了其中IgG抗体处于高盐环境下的纯化过程顺序的负担，例如跟着阳离 子交换色谱步骤、或多模式（阳离子交换-疏水相互作用、或羟基磷灰石步骤），或者加重了 其中盐已出于任何原因被添加到样品中的纯化过程顺序的负担。
[0005] 已经描述了用于加工特别去除了染色质分解代谢产物的含IgM抗体的细胞培养收 获物的方法（（Gan等J · Chromatogr · A，1291 (2013)33-40)。这些方法特别描述了在大致生理 条件下使用DNA嵌入化合物依沙吖啶澄清含I gG的细胞培养收获物。
[0006] 通过污染物与辛酸共沉淀对单克隆IgG抗体的部分纯化已被公开(Chantuin，A. 等，Arch.Biochem.Biophys.89(1960)218-220)。所述脂肪酸结合所有蛋白质，但选择性地 沉淀非IgG污染物(Gagnon,P.，purification Tools for Monoclonal Antibodies , 1996, Validated Biosystems,Tucson；Morals,V.^,Biotechno1.Appl.Biochem.,59(2012)50-54)。已经指明用于应用于无细胞的细胞培养收获物的工艺开发指南(Gagnon见上文）。已经 描述将辛酸应用于含细胞的细胞培养收获物(Brodsky等Biotechnol .Bioeng. 109(2012) 2589-2598)。所述技术具有共同产生干扰进一步纯化的浑浊、粘性、电负性浑浊物的不适当 的特征(Gagnon见上文;Brodsky等，见上文）。
[0007] 尿囊素是经FDA批准的广泛用于非处方卫生保健产品中的炎性因子。已知它可以 从蛋白质溶液（包括从I g G溶液）去除内毒素 （V · V a g e n e n d e等， ACS·Appl.Mater·Interfaces，22(2013)4472-4478;V.Vagenende等，J.Chromatogr·A 1310 (2013)15-20)。

【发明内容】

[0008]在某些方面，本发明提供了从含有IgG抗体和污染物的制剂纯化所述抗体的方法， 优选地其中所述制剂已被加工，以去除至少95%的存在于从中得到所述制剂的原始生产介 质中的染色质。该方法包括使所述制剂与正电膜接触的步骤，所述正电膜具有下述的孔隙 度，所述孔隙度保留至少50%的流体动力学直径大于所选大小的未被吸附的溶质，但允许 流体动力学直径小于所选大小的未被吸附的溶质通过，并且所选大小可以是约l〇 nm到约 15nm的任何量。在所述接触步骤的至少一部分期间，所述制剂包含盐，
[0009 ]使得(1)当所述盐以小于约50mM的浓度存在时，所述制剂的pH值在约3到所述制剂 中的IgG抗体的最碱性糖型的等电点的约0.5个pH单位内的范围；或(2)当所述盐以大于约 50mM的浓度存在时，所述制剂的pH值在约3到约9的范围。接触步骤的最终操作条件由以下 来限定:所述制剂中不存在过量盐或所述制剂不大于20mM的非零盐浓度，以及在约5到IgG 抗体的最碱性糖型的等电点的约〇. 5个pH单位内的范围的pH值。
[0010] 在某些实施方案中，向所述方法提供的所述制剂为具有降低的染色质水平的形 式，使得所述制剂中的染色质的量是原来存在于从中获得所述制剂的来源样品中的染色质 的量的小于约5%。在某些方面，所述来源样品是具有显著量染色质存在的细胞培养收获 物、组织样品或体液，并且使所述来源样品经受一个或多个用于澄清、纯化或分级分离的过 程以获得用于本发明方法中的具有小于约5%的来源样品的染色质的制剂。
【具体实施方式】
[0011] 关于本发明的某些方面，已发现通过下述方式可以实现在含有IgG抗体的制剂的 纯化水平方面的惊人改进:进行针对染色质的澄清，之后采用具有足以保留抗体的孔隙度 的带电膜进行分级分离过程。因此在某些方面，本发明的纯化方法针对含有IgG抗体的制 剂，其中所述制剂已通过导致染色质水平相比于其原始来源显著降低的一个或多个过程而 获得。例如，在某些实施方案中，提供期望的IgG抗体的原始来源样品是细胞培养收获物、体 液或组织样品，并且使所述原始来源样品经受用于显著降低染色质水平的步骤;在某些此 类实施方案中，原始来源样品的染色质水平降低超过95%，使得向本发明方法提供的所述 制剂具有小于5%的最初存在于来源样品中的染色质。染色质降低的水平可以参考原始来 源样品中以及本发明方法中提供的制剂中的水平来评估。染色质降低的水平可以参考组蛋 白的水平和/或DNA的水平来评估。在某些实施方案中，所述制剂中的染色质水平相对于从 中最终得到所述制剂的原始来源样品或介质中的染色质水平降低了至少96%、97%、98%、 99%或99.9%。在其中采取多个步骤来制备所述制剂的某些实施方案中，染色质水平的降 低的确定是针对在所有制备或纯化步骤之前的原始样品中的量而做出的，而不是与在即将 获得所述制剂之前的倒数第二样品进行比较而做出的。
[0012] 在某些方面，本发明提供从含有IgG抗体和污染物的制剂纯化所述抗体的方法。该 方法包括使所述制剂与正电膜接触的步骤，所述正电膜具有下述孔隙度，所述孔隙度保留 至少50%的流体动力学直径大于所选大小的未被吸附的溶质，但允许流体动力学直径小于 所选大小的未被吸附的溶质通过，并且所选大小可以是约1 Onm到约15nm的任何量。在所述 接触步骤的至少一部分期间，所述制剂包含盐，使得(1)当所述盐以小于约50mM的浓度存在 时，所述制剂的pH值在约3到所述制剂中的IgG抗体的最碱性糖型的等电点的约0.5个pH单 位内的范围；或(2)当所述盐以大于约50mM的浓度存在时，所述制剂的pH值在约3到约9的范 围。接触步骤的最终操作条件由以下来限定:所述制剂中不存在过量盐或所述制剂不大于 20mM的非零盐浓度，以及在约5到IgG抗体的最碱性糖型的等电点的约0.5个pH单位内的范 围的pH值。
[0013] 在某些实施方案中，向所述方法提供的所述制剂为具有降低的染色质水平的形 式，使得所述制剂中的染色质的量是原来存在于从中获得所述制剂的来源样品中的染色质 的量的小于约5%。在某些方面，所述来源样品是具有显著量染色质存在的细胞培养收获 物、组织样品或体液，并且使所述来源样品经受一个或者多个用于澄清、纯化或分级分离的 过程以获得用于本发明方法中的具有小于约5%的来源样品的染色质的制剂。
[0014] 在某些方面，本文所公开的实施方案提供具有下述孔隙度的正电膜，所述孔隙度 被选择为使得至少最小百分比的流体动力学直径大于所选大小的未被吸附的溶质基于大 小而被保留，但流体动力学直径小于所选大小的未被吸附的溶质被允许通过所述膜。在某 些实施方案中，最小百分比可以是50%到100%的任何量;在某些此类实施方案中，最小百 分比是50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%。在这些实施方案中的任一个实施方案中， 所选大小可以是约l〇nm到15nm的任何量；在某些此类实施方案中，所选大小可以是大约 10nm、llnm、12nm、13nm、14nm或15nm。在某些实施方案中，正电膜的孔隙度可以被选择以保 留待从所述制剂纯化的所有或基本上所有期望的IgG抗体。
[0015] 在一些方面，本发明的实施方案提供了如本文所述的方法，其中正电膜具有特征 为具有约3nm到约6nm的平均孔径的孔隙度。在某些此类实施方案中，正电膜的平均孔径将 为约6nm、或约5nm、或约4nm、或约3nm。在一些方面，本发明的实施方案提供了如本文所述的 方法，其中正电膜具有特征为具有约9nm或更小、或约8nm或更小、或约7nm或更小、或约6nm 或更小、或约5nm或更小的最大孔径的孔隙度。如根据IgG抗体的最长尺寸测量的IgG抗体的 流体动力学直径倾向于为大约l〇-15nm，取决于局部条件，有一些变化。鉴于抗体的柔性和 它们的大小的变化，选择孔径以保留抗体通常需要孔径明显小于目标抗体的流体动力学直 径。例如，大约9nm的最大孔径可以保留基本上所有更大的IgG，而一些更小的或更高柔性的 IgG可能需要更小的最大孔径如大约5nm。此外，可以预计膜中的孔径具有使得平均孔径明 显小于最大孔径的分布。例如，具有大约9nm的最大孔径的膜可以具有6nm的平均孔径;类似 地，具有大约5nm的最大孔径的膜可以具有3nm的平均孔径。
[0016] 在一些方面，本发明的实施方案提供了如下方法，在并非在应用最终操作条件时 的接触步骤的一部分期间，用于该方法的制剂条件的特征在于不存在盐或存在最高达饱和 的非零浓度的盐。在某些此类实施方案中，所述盐是氯化钠、氯化钾、氯化铵、溴化钠、溴化 钾、溴化铵、乙酸钠、乙酸钾、乙酸铵和其组合。在某些实施方案中，在接触步骤的各部分期 间或之前，使所述制剂暴露于特定的盐浓度，如本文所进一步讨论的。
[0017] 在某些实施方案中，在与正电膜的接触步骤的一部分期间进行缓冲液交换。在某 些此类实施方案中，将正电膜容纳在正切流动过滤设备中，并且在接触步骤的至少部分期 间IgG抗体浓缩于正切流动过滤设备的渗余物中。
[0018] 在一些方面，本发明的实施方案提供如下方法，其包括通过将所述制剂与驻留于 来源样品中的至少95%染色质分离开而由原始来源样品获得所述制剂的额外步骤。在某些 此类实施方案中，所述来源样品是细胞培养收获物、体液或组织提取物或已经受一些纯化 或加工的此类材料。在某些实施方案中，通过包括分级分离的过程从来源样品获得所述制 剂。在某些此类实施方案中，在培育来源样品或来源于所述来源样品的样品与尿囊素和辛 酸之后进行分级分离。在某些此类实施方案中，所述制剂包含来自分级分离过程的再溶解 IgG〇
[0019] 在一些方面，本发明的实施方案提供如下方法，其中所述制剂含有使病毒灭活的 一种或多种试剂。在某些此类实施方案中，病毒灭活剂可以是依沙吖啶、亚甲蓝、氯己定、苯 扎氯铵(benzalkonium chloride)、磷酸三(正丁基)酯和其组合中的任一种。在某些此类实 施方案中，病毒灭活剂各自以约〇. 1 %或更小的浓度存在。
[0020] 在一些方面，本发明的实施方案提供如下方法，其中正电膜具有多个共价固定到 膜的结构或位于膜的结构内的带正电荷的含氮部分，使得它们位于该膜与所述制剂接触的 表面上。在某些此类实施方案中，带正电荷的含氮部分是以下中的任一种：（1)伯胺、（2)仲 胺、（3)叔胺、（4)季胺、（5)聚胺、（6)亚胺、（7)N-杂环、（8)氨基酸、（9)N-羟基酰胺、（10)芳基 胺、其聚合物和其组合。在某些此类实施方案中，带正电荷的含氮部分还结合金属离子。在 某些此类实施方案中，带正电荷的含氮部分还可以包括烷基或芳基组成的一个或者多个疏 水部分。
[0021] 在一些方面，本发明的实施方案提供如下方法，其中带正电荷的含氮部分选自由 以下组成的组:三(2-氨乙基)胺、二亚乙基三胺、三亚乙基三胺、四亚乙基五胺、聚丙烯亚胺 四胺、聚(酰胺基胺）(PAMAM)树枝状聚合物、去铁胺、精氨酸、组氨酸、组胺、咪唑和其组合。
[0022] 在一些方面，本发明的实施方案提供如下方法，其中带正电荷的含氮部分各自如 式I中所述：
[0024]其中R在每次出现时独立地为氢或Q-Ckj烷基或被羟基、氨基或卤代部分取代的 &-CK)烷基，前提是至少一个R基团是与正电膜连接的位点，任选地经由连接体;并且其中X、 Y和Z中的每一个独立地为（CH2)n，其中η是2到8的整数并且CH2基团可以任选地被0或NH替 代。在某些此类实施方案中，R在每次出现时独立地为氢或C 3-C8烷基，前提是至少一个R基团 是与正电膜连接的位点，任选地经由连接体。在某些此类实施方案中，每个η是2到6的整数。 在某些此类实施方案中，带正电荷的含氮部分是三(2-氨乙基)胺。
[0025]在一些方面，本发明的实施方案提供如下方法，其包括以通过如下方式制备的接 枝的树枝状形式呈现带正电荷的含氮部分:将二价或三价伯氨基化合物固定在膜表面上， 然后活化游离氨基并连接另一个二价或三价氨基化合物层，任选地重复所述过程。
[0026]在一些方面，本发明的实施方案提供如下方法，其中所述正电膜被容纳于支持正 切流动过滤的装置中，并且以正切流动过滤模式进行接触步骤的至少部分。在某些此类实 施方案中，所述接触步骤通过使用正电膜的TFF进行。
[0027]在一些方面，本发明的实施方案提供用于实施本文所公开的任何方法的试剂盒。 在某些此类实施方案中，所述试剂盒还包括用于澄清来源样品以获得所述制剂的组分，如 被选择用于降低染色质含量的澄清组分。
[0028] 关于本发明的某些方面，已经发现，可以通过以下方式使对驻留在封闭阴离子交 换色谱的官能性的缓冲液中的样品尝试阴离子交换色谱有用：采用具有大小对应于10-50kDa的球状蛋白质的孔的带正电荷的膜，使所述膜与驻留在高浓度的盐中的含抗体的溶 液接触，然后用适于实施阴离子交换色谱的第二溶液置换原始溶液。不归因于任何特定的 理论，所述过程被认为按以下方式起作用：当高盐样品如1M NaCl中的IgG被引入到膜中时， IgG被保留，但比孔小的盐和污染物质流过该膜。这些包括小的电中性污染物、碱性污染物 和酸性污染物，其中高盐具有通过来自带正电荷的膜的静电排斥阻止碱性污染物的保留以 及阻止酸性污染物与带正电荷的膜的静电结合的特定作用。这阻止了大部分酸性污染物污 染带正电荷的表面，这原本是阴离子交换方法的普遍问题。额外的清洁的高盐缓冲液充分 地洗涤小污染物使其通过孔。然后用中性到微碱性pH的低盐或无盐缓冲液替代高盐缓冲 液，并且大到足以被孔保留的任何残留的酸性污染物如病毒粒子(如果存在)结合到膜上的 带电荷基团。由于小酸性污染物的结合最初被高盐阻止并且小污染物被孔消除，因此与传 统的阴离子交换色谱方法不同，所述膜的满荷电容量(full-charge capacity)可用于病毒 结合，在传统的阴离子交换色谱方法中，病毒必定与酸性蛋白质竞争结合位点，因此其结合 和去除效率较低。由于小的碱性污染物的保留被阻止它们来自膜表面的静电排斥的高盐阻 止，因此这一污染物亚群也被去除。没有其它阴离子交换方法提供性能特征的这一组合。
[0029] 有利的是，本文所公开的方法不受限于含有升高的盐浓度的样品的体积限制。虽 然常规的阴离子交换方法可以耐受非常大的体积，但这些只可以在盐浓度低到零时进行。 因此，例如，在一些实施方案中，本文所公开的方法中的样品体积甚至在升高的盐浓度下也 可以显著大于膜的表示体积。
[0030] 所公开的方法还提供了不与其它阴离子交换方法相关的额外机会，即所述样品可 以用中间缓冲液制剂洗涤，所述中间缓冲液制剂被明确设计来解离可能最初通过非特异性 化学力如静电相互作用和氢键结合到抗体或膜的污染物，使得可能通过膜孔消除解离的污 染物。以下实施方案突出了所述方法的独特能力：IgG最初通过以2M硫酸铵沉淀进行沉淀而 被分级分离。抗体沉淀，大部分污染物随上清液被消除。通过例如通过添加水将铵浓度降低 到1M，使IgG再溶解。这使得IgG需要额外的纯化，但由于它驻留在这样高盐的缓冲液中，因 此它与原本是通常选择的阴离子交换色谱不相容。一个选择是进行单独的缓冲液交换步 骤，但这样成本高，且会导致产品损失。利用所公开的方法，将高盐样品引入装配有平均孔 径对应于50kDa的假定球状蛋白质的正电膜的切向流动过滤设备中。IgG仍被保留，但高盐 大大地暂时阻断了如上文所述的静电相互作用，并且允许消除小污染物，而不管电荷如何。 然后用低盐缓冲液如50mM Tris(pH 8.2)置换高盐缓冲液。任何残留的酸性污染物均结合 到正电膜表面，但IgG不会。如果期望的话，可以浓缩IgG，并且如果期望的话，可以将其收集 用于进一步加工。
[0031] 在一些方面，本文所公开的实施方案涉及纯化驻留在具有过高盐浓度和/或pH值 的溶液中的IgG抗体的方法，所述IgG抗体用于随后通过传统的阴离子交换色谱技术加以纯 化。这是通过以下方式实现的：使所述溶液与具有大小对应于约10_50kDa的球状蛋白质的 孔的带正电荷的（阴离子交换)膜接触，然后将所述缓冲液交换为适于实施阴离子交换色谱 方法的缓冲液，此后残留的酸性污染物将结合到所述膜上带正电荷的部分，结果使得不需 要随后的独立的阴离子交换色谱步骤。在一些实施方案中，可以进行中间步骤，其中将原始 溶液经缓冲液交换到含有意在解离IgG污染物之间或污染物与膜之间的非特异性相互作用 的组分的缓冲液中，然后将样品经缓冲液交换到适于允许酸性污染物结合到所述膜上的正 电荷的条件。在一些实施方案中，由于先前已通过盐沉淀技术分级分离，或已在高盐下由色 谱步骤洗脱，或已添加盐，因此含抗体的原始样品可以驻留在高浓度的盐中。
[0032] 在一些方面，本文所公开的实施方案涉及通过特别去除染色质的方法澄清的含 IgG抗体的细胞培养收获物，例如在一个实施方案中，通过以下方式澄清:与至少一种具有8 到10个碳原子的脂肪酸接触以形成混合物，使所述混合物与一种或多种固体接触以形成混 合物，其中所述一种或多种固体包含阳离子性官能团和结合金属的官能团，所述结合金属 的官能团包含选自由以下组成的组的含氮部分：（1)聚胺、（2)亚胺、（3)N_杂环、（4)氨基酸、 (5)N-羟基酰胺、（6)芳基胺和其组合;和在使所述混合物与一种或多种固体接触之后分离 固体材料，以提供包含所述IgG抗体的溶液。
[0033] 在一些方面，本文所公开的实施方案涉及用于纯化IgG抗体的方法，其包括特别去 除染色质的澄清方法，之后使含IgG的溶液与具有大小与约50kDa的假定球状蛋白质对应的 孔的带正电荷的膜接触，并且任选地将所述缓冲液交换为被设计为减弱或暂时阻断非特异 性化学相互作用的制剂，然后将所述缓冲液交换为通常被认为适于以流通模式进行阴离子 交换色谱的方法的制剂，此后，收集纯化的抗体。所述抗体可以根据需要进一步通过其它方 法纯化。
[0034] 在一些方面，本文所公开的实施方案涉及用于纯化IgG抗体的方法，其包括特别去 除染色质的澄清方法，之后是盐沉淀步骤，之后使含IgG的高盐溶液与具有大小对应于约 50kDa的假定球状蛋白质的孔的带正电荷的膜接触，然后将所述缓冲液交换为适于以流通 模式进行阴离子交换色谱的方法的制剂，此后，收集纯化的抗体。
[0035] 在一些实施方案中，所公开的方法令人惊讶地使得能够从由以下组成的过程纯化 治疗级抗体:特别去除染色质的澄清方法，之后是所公开的方法，其中要么在使所述样品与 带正电荷的膜接触之前将盐添加到所述样品中，要么在一个中间步骤期间将原始样品经缓 冲液交换到高盐中，然后将所述缓冲液最终交换为适于进行阴离子交换色谱的缓冲液。在 完成所公开的方法之后，如果需要，可以通过其它方法加工样品，以获得期望的纯化程度。
[0036] 在一些实施方案中，所公开的方法令人惊讶地使得能够从由以下组成的过程纯化 治疗级抗体:特别去除染色质的澄清方法，之后是盐介导的IgG沉淀的方法，其中将含高盐 的再溶解上清液直接应用于所公开的方法。该核心可以与病毒灭活、病毒过滤和超滤成最 终制剂组合，以提供无需任何柱色谱步骤特别是缺乏由生物亲和色谱与固定化蛋白A组成 的柱色谱步骤的总体过程。
[0037] 在一些实施方案中，所公开的方法令人惊讶地使得能够从由以下组成的过程纯化 治疗级抗体:特别去除染色质的澄清方法，之后是其中洗脱的IgG级分存在于高盐中的色谱 方法，如阳离子交换色谱、或采用疏水性阳离子交换剂的多模式色谱、或组合阳离子交换和 金属亲和官能性的多模式色谱，其中将含高盐的IgG直接应用于所公开的方法。该核心可以 与病毒灭活、病毒过滤和超滤成最终制剂组合，以提供无需由生物亲和色谱与固定化蛋白A 组成的柱色谱步骤的总体过程。
[0038]在一些实施方案中，所公开的方法可以与附加的正电装置组合以增加整个纯化过 程的效能。例如，不是简单地在完成所述方法时收集抗体，而是可以将所述抗体栗送通过附 加的阴离子交换整体柱(monolith)，因为相比于膜，整体柱中的大规模输运得到更好地控 制并且可以支持更高程度的污染物去除效率。整体柱可以被交换为可以增强总体结果的任 何其它类型的装置，例如具有不同的固定化正电物质的膜装置、或填充有带正电荷的粒子 的柱。
[0039]在一些实施方案中，所述膜上的带正电荷的基团可以包括至少一种含氮化合物。 在一些此类实施方案中，至少一种含氮化合物可体现结合金属离子的能力。在一些此类实 施方案中，至少一种含氮化合物可以带正电荷并且可以包括一种或多种来自尤其包括以下 的组的化合物:TREN、二亚乙基三胺、三亚乙基四胺、四亚乙基五胺、聚丙烯亚胺四胺、PAMAM 树枝状聚合物(乙二胺核）、去铁胺、精氨酸、组氨酸、组胺和咪唑。
[0040]在前述实施方案的一个或多个中，所述膜上的带正电荷的基团是式I化合物：
[0042]其中R在每次出现时独立地为氢或C1-C4烷基，前提是至少一个R为与固体载体连 接的位点，任选地经由连接体;并且X、Y和Z中的每一个独立地为(CH2) η，其中η为2到6的整 数，其中CH2基团任选地被0或ΝΗ替代。在一个此类实施方案中，结合金属的官能团为阳离子 螯合剂三(2-氨乙基)胺(TREN)。在其它实施方案中，根据式I的任何接近的TREN类似物均可 用于本文所公开的方法中。式I涵盖了许多市售化合物，并且可通过本领域技术人员常规使 用的方法容易地制备其它合成的设计化合物。例如，式I的叔胺可通过依序还原性胺化反应 由伯胺制备。
[0043]在前述实施方案的一个或多个中，通过以下方式在膜表面上构造树枝状正电荷 层:连续地活化现有层，例如通过还原性胺化，然后引入多价氨基物质，洗掉未结合的过量 氨基物质，然后再次活化该表面等。在TREN的情况下，例如，使初始TREN层共价连接到所述 膜并且将过量的洗掉。然后将结合的TREN活化，去除活化剂，并引入新TREN，作用是在最初 固定化的TREN的末端处的反应性氨基上添加 TREN分子，作用是使电荷场的深度基本上增加 一倍，并且使带正电荷的基团数目增加两倍。在洗掉未结合的TREN之后，可添加额外的层。 [0044]在使用用TREN官能化的膜的一个示例性实施方案中，TREN通过一个末端基团共价 连接到所述膜，产生具有2个伯胺氮原子、1个仲胺氮原子、1个叔胺氮、5个末端氢原子和3个 疏水乙基的物质。在另一此类实施方案中，TREN通过2个末端基团共价连接到固体，产生具 有1个伯胺氮原子、2个仲胺氮原子、1个叔胺氮原子、4个末端氢原子和3个乙基的物质。在另 一此类实施方案中，TREN通过3个末端基团共价连接到固体，产生具有3个仲胺氮原子、1个 叔胺氮原子、3个末端氢原子和3个乙基的物质。在一个实施方案中，共价固定化的TREN可以 这些或其它形式的任何组合或亚组存在。
[0045]在其中正电性物质固定在膜上的一个或多个前述实施方案中，除TREN以外的正电 性物质可以包含一种或多种伯胺、一种或多种仲胺、一种或多种叔胺、或一种或多种季胺， 其中一些具体示例包括但不限于1，3_二氨基-2-丙醇；2-氨基-1，3-丙二醇；乙醇胺；1-氨 基 -4_胍基丁烧;氨；1,2-二氨基乙烧；1,3-二氨基丙烷；1,3-二氨基-2-丙醇;双(TRIS)戊 烧;1,2-二氨基乙烧;二甲胺;双(3-氨基丙基)胺;4-氨基-4-( 3-轻丙基)-1,7-庚二醇；1，3-二氨基丙烷;2-氨基-2-甲基-1，3-丙二醇；1，2-二氨基乙烷;二乙醇胺;三(羟甲基)氨基甲 烧;N_(3-氨基丙基）二乙醇胺；乙醇胺;N-丁胺；1,3-二氨基戊烧;2-(2-氨基乙氧基）乙醇； 聚乙稀亚胺(Mff:2000);聚稀丙胺;聚苯并稀丙胺(Polybenzallylamine)、聚赖氨酸、聚精氨 酸、卜氨基-卜脱氧-d-山梨糖醇;三(羟甲基)氨基甲烷;N，N-双（2-羟乙基）乙二胺;五亚乙 基六胺;二乙醇胺；1，3_二氨基-2，2_二甲基丙烷;3-甲氨基-1，2_丙二醇；2-氨基-乙硫醇； 二稀丙基胺;二亚乙基二胺;N-甲基二乙醇胺；1,5-二氨基戊烧;4-氨基_4_( 3-轻丙基)_1， 7-庚二醇；1，4_二氨基丁烷;三甲胺;二乙基三胺;6-氨基-1-己醇;三(羟甲基)氨基甲烷;2-(甲氨基）乙醇;蛋氨醇;4-氨基-1 -丁醇;和肼;或其组合。
[0046]在一个或多个实施方案中，固定在膜上的带正电荷的物质可以特别体现高度的金 属亲和力，可以包括但不限于三(2-氨乙基)胺(TREN);TREN树枝状聚合物、二亚乙基三胺、 三亚乙基四胺、聚丙烯亚胺四胺、PAMAM树枝状聚合物（乙二胺核）、去铁胺、精氨酸、组氨酸、 组胺、咪唑、氨基乙基磷酸盐、氨基苯基磷酸盐或其组合。
[0047]在一个或多个先前的实施方案中，多于一种带正电荷的物质可以被固定在膜上。 在一个或多个先前的实施方案中，带正电荷的物质可以与不带正电荷的物质组合被固定在 膜上。在一个此类实施方案中，额外的物质可以赋予增强的参与带正电荷特征的样品组分 的氢键、疏水相互作用、金属亲和相互作用、范德瓦尔斯相互作用（van der Waals interaction)或静电相互作用的能力。包含除带正电荷的物质以外的物质将不会具有中和 膜的正电性的净效应;所述膜将在所选应用条件下保持正电性，而不管是否存在不同化学 特性的固定化物质。一般来说，为了增加可以通过实施所公开的方法去除的污染物组分的 质量或多样性的目的，可以将非正电物质固定在所述膜上。
[0048]在一个或多个前述实施方案中，所述膜的孔径分布物理地阻止显著比例的IgG通 过，但允许大小对应于具有50kDa质量或低到10kDa或更小的更低质量的假定球状蛋白质的 溶解物质通过。
[0049] 在一个或多个前述实施方案中，所述膜的基本材料是天然聚合物如纤维素，或合 成材料如聚醚砜、聚酰胺，或适于合成膜的其它材料。
[0050] 在一个或多个前述实施方案中，所述膜的物理构造呈平坦片材、或螺旋卷绕片材、 或中空纤维、或其它物理配置的形式。
[0051] 在所有前述实施方案中，在含IgG的溶液与带正电荷的膜接触期间的某时间点，所 述条件不适于实施阴离子交换色谱。适于阴离子交换的条件通常被理解为是指其中大部分 污染物结合并且大部分IgG不结合的条件。对于人IgGl、人源化IgGl或嵌合IgGl，被认为适 于实施阴离子交换的条件将包括低电导率和弱酸性到弱碱性范围的pH值。被认为不适于实 施阴离子交换的条件被理解为包括不必然阻止酸性污染物的结合、或不必然引起IgG的结 合的条件。对于人IgGl、人源化IgGl或嵌合IgGl，被认为不适于实施阴离子交换的盐浓度将 具有高于lmS/cm且潜在高于lOOmS/cm的电导率，以及任何中间值，并且没有上限。对于此类 抗体，被认为不适于实施阴离子交换的pH值将在其等电点以下高于约0.5个pH单位，或为在 其等电点以下小于1个单位的pH值。所公开的方法的具体益处之一在于待施加的样品的盐 浓度与pH值均不需要小心地选择，甚至也不需要被高度地限定，因为所述方法耐受远超过 阴离子交换的通常限度的条件的有效性与它耐受非常接近于适于阴离子交换的条件的有 效性一样。所公开的方法的惊人特征之一在于它可以受益于远超出阴离子交换色谱的典型 范围的条件，因为它允许包含阻止静电相互作用、非特异性相互作用的添加剂或甚至包含 增进病毒灭活的添加剂。
[0052] 在一个或多个前述实施方案中，与带正电荷的膜接触的原始样品的条件不适于以 结合-洗脱、流通或HPTFF的传统模式实施阴离子交换色谱方法。
[0053] 在一个或多个前述实施方案中，与带正电荷的膜接触的原始样品的条件适于以结 合-洗脱、流通或HPTFF的传统模式实施阴离子交换色谱方法，但在所公开的方法期间改变 条件以包括不适于以传统模式实施阴离子交换色谱方法的盐浓度和/或pH值。
[0054] 在一个或多个前述实施方案中，与带正电荷的膜接触的原始样品的条件不适于以 结合-洗脱、流通或HPTFF的传统模式实施阴离子交换色谱方法，并且在所公开的方法期间 改变条件以包括不适于以传统模式实施阴离子交换色谱方法的其他盐浓度和/或pH值，然 后通过缓冲液交换为适于以传统模式进行阴离子交换色谱的制剂完成所公开的方法的进 行。
[0055] 在一个或多个前述实施方案中，用于产生不适于实施阴离子交换方法的条件的盐 是被称为的中性盐，如氯化钠或氯化钾。
[0056] 在一个或多个前述实施方案中，用于产生不适于实施阴离子交换方法的条件的盐 是被称为的离液盐，如硫氰酸钠或硫氰酸钾、或盐酸胍或乙酸胍。
[0057] 在一个或多个前述实施方案中，用于产生不适于实施阴离子交换方法的条件的盐 是被称为的亲液(kosmotropic)盐，如硫酸钠或硫酸钾、硫酸铵、磷酸钾、柠檬酸钠或柠檬酸 钾。
[0058]在一个或多个前述实施方案中，为了解离污染物与抗体之间和/或污染物与带正 电荷的膜之间的非特异性相互作用的明确目的，在原始样品缓冲液或中间缓冲液中可以包 含其它添加剂。此类添加剂可以包括非离子型离液剂，如酰脲，例如尿素或尿囊素;或有机 溶剂，如醇或二醇;或糖;或表面活性剂，如非离子型洗涤剂、两性离子型洗涤剂或阳离子型 洗涤剂。
[0059] 在一个或多个前述实施方案中，为了降低病毒含量的明确目的，在原始样品缓冲 液或中间缓冲液中可以包含其它添加剂，如非离子型抗病毒剂、两性离子型抗病毒剂或阳 离子型抗病毒剂，如磷酸三(正丁基）酯、依沙吖啶、苯扎氯铵、亚甲蓝或氯己定;尿素或胍、 中性盐或离液盐。
[0060] 在一个或多个前述实施方案中，为了降低病毒的明确目的，可以在中间步骤期间 改变所述条件，如降低pH值，或降低pH值连同添加抗病毒化合物或连同添加本身不被视为 主要抗病毒剂但仍然能够增强低pH处理的化合物，如包括氯化钠、精氨酸或精氨酸基化合 物或尿囊素的化合物。
[0061] 在一个或多个前述实施方案中，在用于支持正切流动过滤的装置中实施所述方 法。这是允许不通过膜的材料保留和再循环、同时通过膜的材料可以被消除的系统。这种类 型的系统还支持缓冲液交换技术，该技术改变其中驻留蛋白质的缓冲液。在一个此类实施 方案中，TFF单元可以完全自动化。在某些此类实施方案中，所述过程可以以任何规模手动 进行。
[0062] 在一个或多个前述实施方案中，所述方法可以利用被称为的闭端式(dead-end)膜 来实施，其中将原始高盐样品的体积下吸到最低，利用清洁的低盐缓冲液再膨胀，然后再次 下吸等，直到判断所述缓冲液已被充分交换为低盐制剂。这个过程可以以任何规模进行。
[0063]在一个或多个前述实施方案中，含有IgG的原始样品是体液或来自细胞培养过程 的收获物，如哺乳动物细胞、酵母菌、细菌、昆虫细胞或其它生物产生介质。
[0064]在一个或多个前述实施方案中，IgG是单克隆来源或多克隆来源、或重组来源、或 合成来源或酶来源的具有约150到170kDa的分子量的完整IgG。在一个或多个此类实施方案 中，所述抗体可以是双功能的，是指其各自的抗原结合位点对不同抗原具有免疫特异性的 能力。在一个或多个此类实施方案中，所述抗体可以缀合到使所述抗体具有通常不与抗体 相关的官能性的化合物。在一个或多个此类实施方案中，所添加的官能性可以介导与对于 疾病状况的疗法有关的生物过程;或所添加的化合物可以是发荧光或有色的，或产生信号 以辅助检测所述抗体可能意在结合的带抗原的物质。
[0065] 在一个或多个前述实施方案中，与带正电荷的膜接触的样品由含IgG的细胞培养 收获物组成，所述收获物已通过施加特别降低收获物的染色质含量的处理被澄清。在一个 此类实施方案中，降低染色质的处理由使所述收获物与带正电荷的粒子接触组成。在一个 此类实施方案中，降低染色质的处理由使所述收获物与带正电荷的膜接触组成。在一个此 类实施方案中，降低染色质的处理由使所述收获物与带正电荷的疏水化合物接触组成，并 且所述处理可以与使所述样品与带正电荷的膜或带正电荷的粒子接触组合。在一个此类实 施方案中，降低染色质的处理可以由使所述收获物与一种脂肪酸接触组成，并且所述处理 可以与使所述样品与带正电荷的膜或带正电荷的粒子接触组合。在这些实施方案中的任一 个中，可以将过饱和量的尿囊素添加到原始收获物中。在这些实施方案中的任一个中，可以 通过离心、膜过滤或深度过滤去除固体，包括其中膜过滤器或深度过滤器含有共价固定的 正电荷。
[0066] 在一些实施方案中，提供从制剂纯化IgG抗体的方法，其包括使所述制剂与具有足 以保留至少50%所述IgG抗体的孔隙度的正电膜接触，其中在接触步骤期间，所述制剂包含 最高达饱和的浓度的中性盐，并且（1)当所述中性盐以大于约50mM的浓度存在时，所述制剂 的pH值在约3到约9的范围，或（2)当所述中性盐以小于约50mM的浓度存在时，pH值在约3到 所述I gG抗体的平均等电点的约0.5个pH单位内的范围。
[0067]不受理论的约束，初始接触溶液的高盐浓度可以抑制静电相互作用并且防止初始 接触溶液中潜在的大量酸性污染物对所述膜的污染，所述污染物通过穿过所述膜中的孔被 消除。
[0068] 在接触步骤施加的制剂的相对体积可以大于所述膜的表示体积当量的约50%。在 本文所公开的方法中，相对体积还可以大于正电膜的表示体积当量的50 %、100%、200%、 500%、1000%或以上，理论上没有限度。所公开的方法还可以适应小于所述膜的表示体积 当量的50%的制剂体积，并且仍然发挥它向更大体积的样品提供的所有优点。因此，样品体 积还可以是所述膜的表示体积当量的约25%，或10%、或5%、或1 %、或更小的非零体积。
[0069] 最后，本文所公开的方法进一步包括将操作条件调节为不导致超过5 %的IgG抗体 结合到正电膜的最高pH值和最低盐浓度。在这一步骤期间，尚未通过所述膜孔消除的酸性 污染物结合到正电荷并且因此从IgG溶液中被去除。不能指定盐浓度和pH值，因为它们对于 每种抗体来说是不同的。截止值可以不超过5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%或更小，甚 至接近零。
[0070]在一些实施方案中，方法进一步包括在接触步骤之前将正电膜平衡到任何目标盐 浓度或pH值。在一些实施方案中，所述方法进一步包括不在接触步骤之前平衡所述膜。
[0071 ]在一些实施方案中，方法进一步包括在接触步骤之后用约50mM到最高达饱和范围 的浓度的中性盐洗涤正电膜。这一步骤可以增强所述方法通过膜孔消除小酸性污染物的能 力，而不是它们污染所述膜上的正电荷(或消耗其容量）。在初始接触溶液不含有高浓度盐 的情况下，这一步骤提供机会以释放可能已结合到正电荷的此类污染物并且通过所述膜中 的孔消除它们，为可能残留在制剂中的相对少数的酸性污染物留下更多的容量。
[0072] 在一些实施方案中，方法可以进一步包括在接触步骤之后的任何方法步骤浓缩所 述制剂。
[0073] 在一些实施方案中，中性盐选自由氯化钠、氯化钾、氯化铵、溴化钠、溴化钾、溴化 铵、乙酸钠、乙酸钾、乙酸铵和其组合组成的组。
[0074]在一些实施方案中，在接触步骤之前，IgG制剂包含能够破坏IgG抗体与污染物、与 正电膜或与这两者的非特异性相互作用的一种或多种试剂。
[0075]在一些实施方案中，洗涤步骤期间的溶液包含能够破坏IgG抗体与污染物、与正电 膜或与这两者的非特异性相互作用的一种或多种试剂。
[0076]在一些实施方案中，所述一种或多种试剂包括选自由盐酸胍、乙酸胍、硫氰酸钠、 硫氰酸钾和其组合组成的组的离液盐，其中所述离液盐以最高达约1M的非零浓度存在。
[0077] 在一些实施方案中，所述一种或多种试剂包括非离子型离液剂。
[0078] 在一些实施方案中，非离子型离液剂是尿素，其中尿素以最高达约6M的非零浓度 存在。
[0079] 在一些实施方案中，所述一种或多种试剂包括非离子型表面活性剂、两性离子型 表面活性剂或阳离子型表面活性剂。
[0080] 在一些实施方案中，所述一种或多种试剂包括选自由甲醇、乙醇、异丙醇和其组合 组成的组的有机溶剂，其中所述有机溶剂以最高达约10 %的非零浓度存在。
[0081] 在一些实施方案中，所述一种或多种试剂包括选自由乙二醇、丙二醇、二甲亚砜和 其组合组成的组的有机溶剂，其中所述有机溶剂以最高达约25 %的非零浓度存在。
[0082] 在一些实施方案中，所述一种或多种试剂包括选自由EDTA、EGTA、TREN、去铁胺和 其组合组成的组的螯合剂，其中所述螯合剂以最高达50mM的非零浓度存在。
[0083] 在一些实施方案中，所述一种或多种试剂包括非离子型疏水化合物、两性离子型 疏水化合物或阳离子型疏水化合物。
[0084] 在一些实施方案中、所述一种或多种试剂包括选自由依沙吖啶、亚甲蓝、氯己定、 苯扎氯铵、磷酸三(正丁基）酯和其组合组成的组的试剂，其中所述一种或多种试剂以最高 达约0.1 %的非零浓度存在。
[0085]在一些实施方案中，所述一种或多种试剂包括还原剂。
[0086]在一些实施方案中，所述还原剂选自由巯基乙醇、二硫苏糖醇、二硫赤藓醇、谷胱 甘肽、半胱氨酸和其组合组成的组，其中所述还原剂以最高达约20mM的非零浓度存在。
[0087]在一些实施方案中，所述制剂是通过去除细胞和碎片的方法澄清的细胞培养收获 物。
[0088]在一些实施方案中，所述制剂是体液。
[0089]在一些实施方案中，所述体液是血清。
[0090]在一些实施方案中，所述制剂是来自色谱柱的洗脱液。
[0091 ]在一些实施方案中，所述制剂包含来自沉淀过程的再溶解IgG。
[0092] 在一些实施方案中，正电膜包含共价固定到膜材料表面的带正电荷的含氮化合 物。
[0093] 在一些实施方案中，带正电荷的含氮化合物包含选自由以下组成的组的部分：（1) 伯胺、（2)仲胺、（3)叔胺、（4)季胺、（5)聚胺、（6)亚胺、（7)N-杂环、（8)氨基酸、（9)N-羟基酰 胺、（1 〇)芳基胺、其聚合物和其组合。
[0094]在一些实施方案中，带正电荷的含氮化合物进一步结合金属离子。
[0095]在一些实施方案中，带正电荷的含氮化合物选自由以下组成的组:三(2-氨乙基） 胺、二亚乙基三胺、三亚乙基三胺、四亚乙基五胺、聚丙烯亚胺四胺、聚（酰胺基胺）（PAMAM) 树枝状聚合物、去铁胺、精氨酸、组氨酸、组胺、咪唑和其组合。
[0096]在一些实施方案中，带正电荷的含氮化合物是式I的化合物：
[0098] 其中R在每次出现时独立地为氢或&-C4烷基，前提是至少一个R为与固体载体连接 的位点，任选地经由连接体;并且
[0099] X、Y和Z中的每一个独立地为(CH2)n，其中η为2到6的整数，其中CH2基团任选地被0 或NH替代。
[0100] 在一些实施方案中，带正电荷的含氮化合物是三(2-氨乙基)胺。
[0101 ]在一些实施方案中，以通过如下方式制备的接枝的树枝状形式呈现带正电荷的含 氮化合物:将二价或三价伯氨基化合物固定在膜表面上，然后活化游离氨基并连接另一个 二价或三价氨基化合物层，且任选地重复所述过程。
[0102] 在一些实施方案中，带正电荷的含氮化合物可以包含烷基或芳基组成的一个或多 个疏水部分。
[0103] 在一些实施方案中，正电膜被容纳在支持正切流动过滤的装置中。
[0104] 在一些实施方案中，提供用于实施本文所公开的方法的试剂盒。此类试剂盒可以 适于进行小规模的纯化，或用于进行小规模的实验以确定用于大规模纯化的规格。存在用 于实施本文所公开的方法实施方案的其它物理形式。一种利用垂直地(或至少倾斜地)安装 在50mL(或更小）离心管中的切向流动（正电）膜，其中离心提供了驱动流体通过所述膜的 力。另一种可以利用出口连接的真空管线。另一种可以是每个末端具有压力连接件(螺纹锁 或或鲁尔锁（luer-lock))的封闭单元，这样所述单元可以装配至色谱仪。
[0105] 在一些实施方案中，试剂盒进一步包括用于澄清所述制剂的组分。在一些此类实 施方案中，澄清组分被选择用于降低染色质含量。
[0106] 对以下术语进行了定义，使得可以更容易地理解本文所公开的方法。另外的定义 在整个【具体实施方式】中有陈述。
[0107] "TREN"是指三(2-氨乙基)胺。特别已知该正电性化合物体现对金属离子的强亲和 力。它可以化学附着到各种材料以使那些材料具有由TREN介导的化学特性。
[0108] 在本发明上下文中，"细胞培养"是指出于产生IgG单克隆抗体的目的在液体培养 基中培育细胞。用于该目的的细胞通常包括中国仓鼠卵巢(CH0)细胞，但可以包括来自其它 哺乳动物的细胞类型，以及非哺乳动物的动物细胞、植物和微生物。在所有情况下，液体培 养基均含有营养素以支持细胞生长。
[0109] "收获物"或"细胞培养收获物"通常是指生物反应器在细胞培养过程终止时的内 容物。除了产生的IgG之外，收获物最初还将含有细胞、细胞分泌物和死细胞的排出内容物， 以及所述细胞最初在其中生长的营养培养基的内容物。这些非抗体组分构成了将要从抗体 中去除的污染物。它们特别包括宿主蛋白质和DNA，但还可包括病毒和内毒素。细胞培养收 获物也常常含有错误装配形式或受损形式的呈片段形式的抗体。
[0110] "澄清的细胞培养收获物"是指已从其中去除细胞的收获物。通过使用各种添加 剂，所述澄清过程还可以具有去除除细胞以外的一大组污染物的能力，在一些情况下具有 去除染色质的特定能力。 "染色质"是指在细胞死亡后从细胞核中排出的基因组DNA，其中所述DNA保持与组 蛋白连接，呈核小体阵列、单位核小体、降解的核小体以及游离的DNA和组蛋白形式，所有这 些形式还可以与抗体和其它细胞培养收获物组分稳定连接。
[0112] "正切流动过滤(TFF)"是指其中迫使流体通过由一个或多个多孔膜限定的空间的 膜过滤方法，其中小到足以通过所述孔的分子在滤液中被消除并且大到足以被孔抵制的分 子保留在渗余物中。名称切向流动特别是指以下事实:流体流动方向大致平行于所述膜，不 同于所谓的其中流动大致垂直于所述膜的闭端式过滤。
[0113] "渗滤"是指其中所述孔小到足以保留目标产物、但允许更小的材料通过的TFF方 法。连续引入组成不同于原始样品的溶液允许在有时被称为缓冲液交换的过程中将所述组 成逐渐改变为引入溶液的组成。
[0114] "蛋白质"是指含有碳、氢、氧、氮且通常含有硫并且主要由一条或多条通过肽键连 接的氨基酸链构成的复杂有机大分子群中的任一种。蛋白质可以是天然或重组来源的。可 用非氨基酸部分对蛋白质进行修饰，例如通过糖基化、聚乙二醇化或与其它化学部分缀合 来修饰。蛋白质的实例包括但不限于抗体、凝血因子、酶和肽激素。
[0115] "宿主污染物"或"宿主细胞污染物"是指由目标产物生长于其中的细胞产生的生 物分子。所述术语可包括多种类别的宿主污染物，例如宿主蛋白质和宿主DNA。
[0116] "宿主蛋白质"或"宿主细胞蛋白质"或"HCP"是指由目标产物生长于其中的细胞产 生的生物分子。此类蛋白质表示将要从目标产物中去除的一种类别的污染物。
[0117] 〃抗体〃是指源于人或其它哺乳动物细胞系的IgG、IgM、IgA、IgD或IgE类别的免疫 球蛋白，包括天然形式或遗传修饰形式，例如人源化抗体、人抗体、单链抗体、嵌合抗体、合 成抗体、重组抗体、杂合抗体、突变抗体、移植抗体和体外产生的抗体。所述抗体可通过单一 克隆产生，在这种情况下，它们被称为单克隆;或从超过一种的克隆产生，在这种情况下，它 们被称为多克隆。IgG抗体特别是指一类被称为免疫球蛋白G的抗体，其还可以作为一个亚 类或亚类的混合物存在，例如在人中作为IgG^IgUgGs或IgG4存在;或在小鼠中作为IgGi、 IgG2A、IgG2B或IgG3存在;或在大鼠中作为IgGl、IgG2A、IgG2B、IgG2C存在。在真核宿主中天然或 重组产生的抗体可以多种糖基化形式存在，而在非真核宿主中产生的抗体可以多种糖基化 形式和非糖基化形式存在。
[0118] "内毒素"是指存在于革兰氏阴性细菌的外膜中的、裂解后从细胞释放的有毒的、 热稳定的脂多糖物质。内毒素可以由于它们的高含量的磷酸和羧基残基而通常为酸性的， 并且可以由于脂质-A区域的脂肪酸含量而为高度疏水的。内毒素可以为氢键合提供大量机 会。
[0119] "表示的体积当量"是指阴离子交换当量的表示。所述表示被理解为在某方面是任 意的，因为许多膜的功能表面通常近似为二维。然而，它们的容量仍然可以与体积当量有 关，这通常基于与多孔粒子阴离子交换剂的比较，在所述多孔粒子阴离子交换剂中，由于在 粒子本体内存在产生内部可及空间的孔而，因此可以在三维中发生阴离子交换相互使用。 这也是任意的，因为三维程度随粒子构造不同而不同。一些膜还以允许一定的三维可及程 度的形式存在。由于阴离子交换领域的传统是表示每单位体积的容量，因此所述概念已被 延续并应用于膜，尽管它不准确。对实验室规模的膜，正电膜的表示的体积当量可以以所选 蛋白质或DNA的毫克数/毫升膜介质给出。在工业规模下，所表示的体积当量可以以每升膜 介质的毫克数或克数来表示。
[0120] "多核苷酸"是指由链中共价键合的多个核苷酸单体构成的生物聚合物。DNA(脱氧 核糖核酸)和RNA(核糖核酸)是多核苷酸的示例。多核苷酸可以具有形成氢键的高倾向性。 [0121 ] "蛋白质制剂"是指任何含有目标蛋白质的水性或主要为水性的溶液，例如含有细 胞的细胞培养收获物、（基本上)无细胞的细胞培养物上清液或来自某个纯化阶段的含有目 标蛋白质的溶液。
[0122] "病毒"或"病毒粒子"是指仅在主要为细菌、植物和动物的活宿主的细胞内复制的 超显微的（直径大约为20nm到300nm)、代谢惰性的感染原：其由RNA或DNA核、蛋白质外壳和 在更复杂的类型中围绕的包膜(surrounding envelope)构成。
[0123] 将有用的是，在了解所公开的方法的操作步骤和选项以及它们被预计产生的效果 的情况下实施所公开的方法。这些通过以下假定的实施例来说明。含有待纯化的IgG单克隆 抗体的哺乳动物细胞培养收获物通过特别降低所述收获物中的染色质含量的方法来澄清。 此类澄清方法特别降低收获物中的大污染物质的含量。将澄清的收获物引入适于实施所公 开的方法的装配有带正电荷的膜的正切流动过滤装置中。大小小到足以通过孔的污染物由 此被消除，而抗体被保留。这一步骤的污染物去除可以通过将所述样品经缓冲液交换到高 盐缓冲液中而被增强，所述高盐缓冲液抑制带负电荷的污染物与所述膜上的正电荷之间的 吸引相互作用，并且还抑制带正电荷的污染物与所述膜上的正电荷之间的排斥相互作用。 抑制此类相互作用的一个益处在于它阻止所述膜的荷电容量被粗制样品中相当高浓度的 酸性污染物消耗，并且它由此保存了所述膜结合少量大酸性污染物如病毒或DNA的容量，所 述污染物可以持续到所述方法的最终阶段中。抑制此类相互作用的另一个益处在于它阻止 高正电性的污染物通过来自所述膜的电荷排斥而被保留，即使它们可以小到足以通过所述 孔。除了含有高盐浓度之外，所述缓冲液还可以任选地含有倾向于解离IgG与污染物之间的 非特异性相互作用、或所述膜与污染物之间的非特异性相互作用的盐物质。可以包括其它 添加剂以扩大缓冲液的解离能力范围，和/或可以应用一系列的不同解离缓冲液。抗体通过 所述膜的孔隙度在这整个过程中被保留。所述方法的高盐耐受性突出了所公开的方法相对 于除空隙排阻阴离子交换色谱的柱技术以外的所有其它形式的阴离子交换色谱的有价值 的区别。所述方法的膜孔隙度和高盐耐受性特别突出了其相对于被称为高效正切流动过滤 (HPTFF)的膜式阴离子交换方法的益处和区别。HPTFF根本地取决于孔对抗体的静电排斥。 因此在引入进料流之前必须将HPTFF进料流平衡到适当低的电导率和高pH值条件，并且必 须将所述HPTFF进料流在所述范围内维持所述过程的持续时间。所述方法的最终阶段是将 IgG经缓冲液交换到预限定的端点条件，所述条件代表不导致所述抗体显著结合到所述膜 上的正电荷的最低电导率和最高pH值。此时，大的或小的但特别包括大污染物如DNA或病毒 的任何酸性污染物将结合到所述膜上的正电荷。应当认识到，消除小到足以通过膜孔的酸 性污染物的较早步骤已将可用于去除大酸性污染物的能力最大化。这突出了所公开的方法 相对于传统的阴离子交换方法的另一益处和区别，在传统的阴离子交换方法中，更小的酸 性污染物竞争固相上的同一正电荷可以不利地影响大酸性污染物的去除。然后从单元中移 出纯化的IgG。
[0124] 直到具有适当孔径分布的带正电荷的膜变得市面有售时，用于实施所述方法的必 要步骤都将是由具有所需孔隙度但缺乏正电荷的商业介质来制备所述膜。表面的化学修饰 可以通过多种处理方便地实现，这里为了说明目的简要讨论了其中一种处理。将羟基化膜 置于正切流动过滤盒中并且用1M NaOH在流动下平衡。然后引入I M NaOH、lmM硼氢化钠、 100mM三(2-氨乙基)胺(TREN)和100mM表氯醇并使其在50°C与连续地再循环通过所述膜的 缓冲液反应4h。然后可以从装置中逐出（chased)反应溶液，并且现在带有TREN残余物的膜 可以用于实施所公开的方法。或者，如果期望的话，可以进一步修饰现有的TREN基团以增加 表面上的正电荷量。这可以通过用50mM磷酸钠 (pH 6.4)中的8%戊二醛洗涤仍然存在于TFF 单元中的膜来实现。然后用50禮磷酸盐(？!16.4)、之后立即用5〇11^硼酸(？!19.1)中的10〇11^ TREN冲洗干净戊二醛溶液。将混合物培育2小时，然后用50mM磷酸盐、1M NaCl(pH 6.4)，然 后用20%乙醇冲洗干净。这一过程被理解为在第一代固定化的TREN分子的游离氨基末端上 具有固定化的第二代TREN分子，使膜表面上的电荷总量增加大约一倍并且使其远离膜表面 延伸两倍。将显而易见的是，戊二醛-TREN序列可以重复多次，以增加带电荷层的深度，并因 此增加膜的每单位表面积的电荷总数。对于本领域普通技术人员将显而易见的是，许多替 代材料和化学修饰方法可以用于制备适于实施本文所公开的方法的膜，如果期望的话，包 括也体现参与二次相互作用如疏水相互作用、氢键合相互作用、金属亲和相互作用、31-31相 互作用或其它相互作用的潜力的带正电荷材料。
[0125] 针对特定的单克隆抗体制剂(如例示细胞培养收获物)定制本文所公开的方法时 的有用起点是借助于特别包括固体或可溶性的带正电荷材料的处理来澄清进料流，所述固 体或可溶性的带正电荷材料与染色质、染色质亚结构如核小体和含组蛋白的核小体亚结构 的DNA组分形成稳定缔合。一种此类处理可以由简单地组合所述收获物与带有带正电荷的 表面的固体组成。另一种此类处理可以由组合所述收获物与带正电荷的聚合物组成。由Gan 等(见上文)描述的处理涉及组合所述收获物与尿囊素和依沙吖啶，然后添加带正电荷的粒 子和带负电荷的粒子以清除可溶性非抗体实体。该方法的一种未公开的变型是添加亚甲蓝 代替依沙吖啶。另一种未公开的变型涉及添加脂肪酸代替依沙吖啶或亚甲蓝。在所有这些 情况下，都可以通过离心和/或过滤技术去除固体，其中膜或深度形式的过滤介质可以带正 电荷。在所有上述示例中，处理过的样品将高度缺乏染色质，这将使样品组成尤其适于实施 所公开的方法。
[0126] 在一些实施方案中，将建议首先限定不导致抗体显著结合到膜上的正电荷的最低 电导率和最高pH值。方便的起始点将是50mM Tris，pH 8.0。随后的实验可以评价更低和更 高的pH值，以及更低的缓冲液浓度，或如果需要的话，甚至添加盐，如NaCl，以防止IgG结合 到正电荷。一旦确定最大效用的pH值和电导率的范围，则将建议通常进行二维实验，其中改 变这两个参数以限定支持最有效的污染物去除的组合条件。当确定出最有效的条件时，其 将代表用于所公开的方法的最终步骤的目标缓冲液交换端点缓冲液。
[0127] 在一些实施方案中，将建议进行简短的合格性(qualifying)实验，其中将足以产 生1M浓度的NaCl添加到含有IgG的样品中，然后通过使用带正电荷的膜经切向流动缓冲液 交换到期望的端点缓冲液中来加工所述样品，此后测量抗体回收。通常，如果原始膜的孔隙 度适当，则抗体损失应当小于5%。
[0128] 在一些实施方案中，将建议在所述样品中包含升高浓度的盐，然后将它引入到容 纳带正电荷的膜的TFF装置中以保护所述膜免于被驻留于所述样品中的污染物污染的可能 性。
[0129] 在一些实施方案中，为了解离污染物质与抗体之间、或污染物质与膜之间、或这两 者的原本稳定的缔合的明确目的，将建议应用中间缓冲液。此类中间缓冲液制剂可以特别 包括高浓度的盐，包括被称为的离液盐，如氯化胍或硫酸胍、或硫氰酸钠或硫氰酸钾;尿素； 糖;表面活性剂;螯合剂;氨基酸，如组氨酸或精氨酸;或根据需要，其它化合物。用于进行这 一步骤的潜在效用的快速评价的方便制剂是50mM Tris、2mM EDTA、200mM组氨酸、2M NaCl (pH 8.0)〇
[0130] 在一些实施方案中，可能适于对已仅通过物理手段如离心和/或膜过滤澄清的细 胞培养收获物实施所述方法，在这种情况下，所述方法可以用于在所述过程的早期产生高 浓度的产物，并且仍然大幅度降低污染物含量，尽管通常并非将通过对通过针对染色质的 方法澄清的细胞培养收获物或对部分纯化的材料实施所述方法所达到的污染物降低水平。 [0131]流速、膜表面积、跨膜压力、体积和其它基本操作参数的问题是正切流动过滤领域 中众所周知的并且所述实用知识可以被直接应用而无需修改。
[0132] 在一些实施方案中，可能有利的是，进行其中存在所有公开的要素的本文所公开 的方法，因为作为整体的系统中的各个要素所施加的影响程度不能通过它们的独立表现来 预测。在实施本文所公开的方法中，所述方法的单个要素可被连续地排除以为任何特定的 靶IgG抗体提供精简的方法。在一些实施方案中，如本领域内已知的统计技术例如实验设计 (DoE)可以提供一种手段来鉴别对减少数目的针对特定IgG纯化而设计的本文所公开的方 法实施方案的选择。
[0133] 对于本领域普通技术人员将显而易见的是，根据特定的过程设计或设计者的需 要，所述方法可以被置于多步骤纯化过程中的任何方便点。因此，它可以紧随细胞培养物澄 清之后，它可以作为某个过程中的最终分级分离步骤被应用，或它可以在某个过程中的任 何中间点被应用。
[0134] 以下实施例被理解为一般的，仅仅为了说明，且不应被解释为以任何方式进行限 制。
[0135] 实施例
[0136] 实施例1.实施所公开的方法的正电膜的制备。根据如世界专利W020018792A2的图 2A中所述的van Reis方法制备正电膜。简单地说，使30kDa纤维素膜(Sartorius 14459-76-D)与2M 3-溴丙基三甲基溴化铵在室温下反应过夜。不同于van Reis，然后将所述膜用1M NaCl洗涤，然后用水洗涤，以消除残余的反应物和反应副产物。通过阴离子性染料甲基蓝的 结合来确认季氨基的固定化。
[0137] 实施例2.所公开的方法的实施方案的应用。含有约2.5 g/L浓度的I gG单克隆抗体 的哺乳动物细胞培养收获物通过以下方式被澄清:调节到PH5.2，添加1 %尿囊素，之后添加 0.4 %辛酸钠，然后搅拌培育2小时。通过微滤去除固体并且使上清液流动通过含有用TREN 取代的琼脂糖珠 (WorkBeads 40 TREN 11丨811，13;[0￥(^1^，1^口8313)的柱，其中11^^柱的体积 是细胞培养收获物的原始体积的体积的5 %。这将宿主蛋白质污染物从原始的463，804ppm 降低到8292ppm。将样品直接应用到30kDa季胺取代过滤器并且经缓冲液交换到50mM Tris (pH 8.0)中。宿主蛋白质污染物被降低到2414ppm，代表了大约70%的降低。相比之下，使样 品通过流通模式的Sartobind Q膜吸附器(孔径2-5微米)将宿主蛋白质含量仅降低29.5%。 这表明所公开的方法的有效性显著大于使用流通模式的正电固相（阴离子交换器）的行业 标准实践。
[0138] 实施例3.所公开的方法的实施方案的应用。含有约0.6g/L浓度的IgG单克隆抗体 的哺乳动物细胞培养收获物通过以下方式被澄清:调节到PH5.4，添加1 %尿囊素，之后添加 0.4 %辛酸钠，搅拌2小时。通过微滤去除固体并且使上清液流动通过含有用TREN取代的琼 脂糖珠 (WorkBeads 40 TREN high,BioWorks，Uppsala)的柱，其中TREN柱的体积是细胞培 养收获物的原始体积的体积的5%，然后使之流动通过Sartorius PC1深度过滤器。这将宿 主蛋白质污染物从原始的3，841，397ppm降低到198ppm。将样品直接应用到30kDa季胺取代 过滤器并且经缓冲液交换到50mM Tris(pH 8.0)中。宿主蛋白质污染物降低到18ppm。本实 施例说明针对染色质的澄清、之后仅进行所公开的膜技术的实施方案实现宿主污染物水平 低于监管机构对于注射性治疗抗体的建议水平（lOOpprn)的能力。它还突出了针对染色质的 澄清组合膜分级分离方法获得优于通常利用蛋白A亲和色谱实现的结果的料想不到的能 力。蛋白A是一种适当的参考标准，因为它通常被认为是可利用的最强大的抗体纯化方法。 从蛋白A柱洗脱的IgG通常含有500-2000ppm的宿主细胞蛋白质。
[0139] 实施例4.所公开的方法的实施方案的应用。含有约1.5g/L浓度的I gG单克隆抗体 的哺乳动物细胞培养收获物通过以下方式被澄清:调节到PH5.4，添加1 %尿囊素，之后添加 0.4 %辛酸钠，搅拌培育2小时。通过微滤去除固体并且使上清液流动通过含有用TREN取代 的琼脂糖珠 (WorkBeads 40TREN High，BioWorks，Uppsala)的柱，其中TREN柱的体积是细胞 培养收获物的原始体积的体积的5%。这将宿主蛋白质污染物从原始的219，570ppm降低到 4441ppm。将样品直接应用到30kDa季胺取代过滤器并且经缓冲液交换到50mM Tris(pH 8.0)中。宿主蛋白质污染物降低到679ppm。本实施例说明针对染色质的澄清、之后仅进行所 公开的过滤技术实现与通过利用蛋白A的亲和色谱产生的水平一致的宿主污染的能力。
[0140] 实施例5.所公开的方法与另外的分级分离方法的整合。将NaCl添加到来自实施例 4的经加工的IgG中至1M的最终浓度，并且施加到用50mM Tris、lM NaCl(pH 8.0)平衡的 Capto adhere柱（GE Healthcare)。利用一个步骤将Capto adhere柱洗脱至50mM MES、 300mM NaCl(pH 6.0)。洗脱的IgG的HCP含量小于lppm，并且含有小于lppm的DNA和小于 0.1%的聚集物。这通过所有三种指标说明所公开的方法和单一修改步骤实现或超过治疗 I gG的质量标准的能力。
[0141]实施例6.带电荷膜与不带电荷膜的性能的比较。重复实施例4的方法，例外是使用 未被改性成含有带正电荷的基团的30kDa纤维素膜。带电荷的膜将宿主蛋白质污染物降低 到679ppm，而不带电荷的膜将它们仅降低到2280ppm。然而，污染物载荷接近50%的降低突 出了通过带电荷膜的孔进行的污染物降低消除显著比例的污染物的观点，并且部分地解释 了所公开的方法相比于使用流通模式的正电固相的标准实践更有效地进行的原因（实施例 2)。来自未带电荷的膜的样品进一步通过实施例5的方法被分级分离。带电荷的膜之后的 Capto adhere将宿主蛋白质降低到小于lppm，而用未带电荷的膜加工后的Capto adhere将 宿主蛋白质降低到86ppm。
[0142 ]实施例7.所公开的方法与另外的分级分离方法的整合。含有约2.5g/L浓度的I gG 单克隆抗体的哺乳动物细胞培养收获物通过以下方式被澄清:调节到pH 5.2，添加1 %尿囊 素，之后添加0.4%辛酸钠，然后搅拌培育2小时。将带有TREN的粒子(WorkBeads 40TREN 把811，81〇1沉1^，邱？仰1&)以5%&3)的比率添加并且搅拌培育4小时，然后离心以去除固 体。这将宿主蛋白质污染物从原始的243,997ppm降低到3551ppm。将样品滴定到pH 6.0并且 用水以1:1稀释以降低电导率，然后施加到柱中的P0R0S XS阳离子交换色谱介质，在pH 8.0 洗涤，然后利用一个步骤洗脱至50mM的NaCl。宿主蛋白质降低到155ppm。在不进行平衡的情 况下，将样品施加至具有约30kDa的孔隙度的季胺膜。将样品经缓冲液交换到50mM Tris(pH 8.2)中，然后从所述体系中取出。宿主蛋白质是24ppm。实施例5描述了所公开的方法与后续 的修改方法的整合，而本实施例描述了所公开的方法与先前抗体-捕获方法的整合。
[0143] 实施例8.实施所公开的方法的正电膜的制备。由于无适当的膜可用于实施所述方 法，因此需要制备它们。将具有对应于30kDa的假定球状蛋白质的平均孔径的再生纤维素膜 用1M NaOH、lmM硼氢化钠、100mM三(2-氨乙基)胺(TREN)和100mM表氯醇平衡，然后使其在50 °C与连续地再循环通过所述膜的缓冲液反应4h。将所述缓冲液用1M NaCl替代，然后用水替 代，以洗掉残余的反应物和反应副产物。通过阴离子性染料甲基蓝的结合来确认TREN的固 定化。
[0144] 实施例9.在细胞培养收获物的针对染色质的澄清后对所公开的方法的实施方案 的应用。含有约2.5g/L浓度的IgG单克隆抗体的哺乳动物细胞培养收获物通过以下方式被 澄清：调节到pH 5.2,添加1%尿囊素，之后添加0.4%辛酸钠，培育2h，添加5%BioWorks TREN，培育4小时，离心以去除固体，然后通过深度过滤器(Sartorius PCI)。这将宿主蛋白 质污染物从原始的243,997ppm降低到236ppm。将所述制剂直接施加到具有与质量为30kDa 的球状蛋白质对应的额定孔径的带有TREN的纤维素膜。将所述制剂经缓冲液交换到50mM Tris、2mM EDTA、200mM组氨酸、2M NaCl(pH 8.0)中以解离非特异性相互作用，然后经缓冲 液交换到5〇11^1^8(?!18.2)中，然后从所述体系中取出。186的宿主蛋白质含量降低到 10ppm〇
[0145] 实施例10.在细胞培养收获物的针对染色质的澄清和利用硫酸铵进行IgG沉淀后 对所公开的方法的实施方案的应用。含有约2.5g/L浓度的IgG单克隆抗体的哺乳动物细胞 培养收获物通过以下方式被澄清:调节到pH 5.2，添加1 %尿囊素，之后添加0.4 %辛酸钠， 培育2h，添加5 % BioWorks TREN，培育4小时，然后离心去除固体。这将宿主蛋白质污染物从 原始的243,997ppm降低到3551ppm。将IgG用2M硫酸铵沉淀，然后微滤以去除上清液。通过添 加1样品体积的水使IgG再溶解，使得IgG在1M硫酸铵中。宿主蛋白质污染降低到1423ppm。将 所述样品直接施加到如实施例8和10中所述的TREN膜，然后经缓冲液交换到50mM Tris、2mM EDTA、200mM组氨酸、2M NaCl(pH 8.0)中以解离非特异性相互作用，然后经缓冲液交换到 50mM Tris(pH 8.2)中，然后从所述体系中取出。186的宿主蛋白质含量降低到12??111。
[0146] 实施例11.在细胞培养收获物的针对染色质的澄清和阳离子交换色谱后对所公开 的方法的实施方案的应用。含有约2.5g/L浓度的IgG单克隆抗体的哺乳动物细胞培养收获 物通过以下方式被澄清:调节到pH 5.2,添加1%尿囊素，之后添加0.4%辛酸钠，培育2h，添 加5%BioWorks TREN，培育4小时，然后离心以去除固体。这将宿主蛋白质污染物从原始的 243,997ppm降低到3551ppm。将样品滴定到pH 6.0并且用水以1:1稀释以降低电导率，然后 施加到柱中的P0R0S XS阳离子交换色谱介质，在pH 8.0洗涤，然后利用至50mM的NaCl的步 骤洗脱。宿主蛋白质降低到5ppm。将所述样品直接施加到如实施例8中所述的TREN膜，然后 渗滤到50mM Tris、2mM EDTA、200mM组氨酸、2M NaCl(pH 8.0)中以解离非特异性相互作用， 然后渗滤到5〇!1^!1叩^(?!18.2)中，然后从所述体系中取出。宿主蛋白质降低到检测水平 以下。
[0147] 实施例12.TREN-树枝状聚合物膜的产生。用50mM磷酸钠 (pH 6.4)中的8%戊二醛 将如实施例8中所述制备的膜洗涤1小时。用50mM磷酸盐(pH6.4)、之后立即用50mM硼酸(pH 9.1)中的100mM TREN冲洗干净戊二醛溶液。将混合物培育2小时，然后用50mM磷酸盐、1M NaCl(pH 6.4)，然后用20%乙醇冲洗干净。这一过程被理解为在第一代固定化的TREN分子 的游离氨基末端上具有固定化的第二代TREN分子，使膜表面上的电荷总量增加一倍并且使 其远离膜表面延伸两倍。将显而易见的是，戊二醛-TREN序列可以重复多次，以进一步增加 效果。
[0148] 本文所引用的所有参考文献均以引用方式且出于所有目的整体并入，其并入程度 就如同每个单独的出版物或专利或专利申请被明确地且个别地被指明出于所有目的以引 用方式整体并入一样。当以引用方式并入的出版物和专利或专利申请与本说明书中所含的 公开内容相冲突时，本说明书意在替代和/或优先于任何此类相冲突的材料。
[0149] 用于本说明书和权利要求中的所有表示成分的量、色谱条件等的数字均应当被理 解为在所有情况下被术语"约"修饰。因此，除非另有相反指明，否则本说明书和所附权利要 求书中陈述的数字参数为近似值，其可根据本文所公开的方法试图获得的期望性能而改 变。
[0150] 如对本领域技术人员将显而易见的，可进行本文所公开的方法的许多更改和变 化，而不脱离它们的精神和范围。本文所述的具体实施方案仅以举例方式提供，而不意在以 任何方式进行限制。本说明书和实施例意在被认为仅仅是示例性的，本文所公开的方法的 真正范围和精神由所附权利要求书指明。
【主权项】
1. 一种从含有IgG抗体和污染物的制剂纯化所述IgG抗体的方法，其包括： 提供W下形式的制剂，所述制剂含有小于5%的驻留在从中获得所述制剂的来源样品 中的染色质，和 使所述制剂与正电膜接触，所述正电膜具有下述的孔隙度，所述孔隙度保留至少50% 的流体动力学直径大于所选大小的未被吸附的溶质，但允许流体动力学直径小于所述所选 大小的未被吸附的溶质通过，其中所述所选大小选自约lOnm到约15nm，进一步地，其中在所 述接触步骤的至少一部分期间，所述制剂包含盐，使得（1)当所述盐W小于约50mM的浓度存 在时，所述制剂的pH值在约3到所述制剂中的所述IgG抗体的最碱性糖型的等电点的约0.5 个抑单位内的范围；或(2)当所述盐W大于约50mM的浓度存在时，所述制剂的pH值在约3到 约9的范围； 并且其中所述接触步骤的最终操作条件由W下来限定:所述制剂中不存在过量盐或所 述制剂不大于20mM的非零的盐浓度，W及在约5到所述IgG抗体的最碱性糖型的等电点的约 0.5个抑单位内的范围的抑值。2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述所选大小是大约llnm。3. 根据权利要求1所述的方法，其中所述所选大小是大约12nm。4. 根据权利要求1所述的方法，其中所述所选大小是大约13nm。5. 根据权利要求1所述的方法，其中所述所选大小是大约14nm。6. 根据权利要求1-5所述的方法，其中所述正电膜具有下述的孔隙度，所述孔隙度保留 至少60%的流体动力学直径大于所选大小的未被吸附的溶质，但允许流体动力学直径小于 所述所选大小的未被吸附的溶质通过。7. 根据权利要求1-5所述的方法，其中所述正电膜具有下述的孔隙度，所述孔隙度保留 至少70%的流体动力学直径大于所选大小的未被吸附的溶质，但允许流体动力学直径小于 所述所选大小的未被吸附的溶质通过。8. 根据权利要求1-5所述的方法，其中所述正电膜具有下述的孔隙度，所述孔隙度保留 至少80%的流体动力学直径大于所选大小的未被吸附的溶质，但允许流体动力学直径小于 所述所选大小的未被吸附的溶质通过。9. 根据权利要求1-5所述的方法，其中所述正电膜具有下述的孔隙度，所述孔隙度保留 至少90%的流体动力学直径大于所选大小的未被吸附的溶质，但允许流体动力学直径小于 所述所选大小的未被吸附的溶质通过。10. 根据权利要求1-5所述的方法，其中所述正电膜具有下述的孔隙度，所述孔隙度保 留至少95%的流体动力学直径大于所选大小的未被吸附的溶质，但允许流体动力学直径小 于所述所选大小的未被吸附的溶质通过。11. 根据权利要求1-5所述的方法，其中所述正电膜具有下述的孔隙度，所述孔隙度保 留至少99%的流体动力学直径大于所选大小的未被吸附的溶质，但允许流体动力学直径小 于所述所选大小的未被吸附的溶质通过。12. 根据权利要求1-11所述的方法，其中在并非在应用最终操作条件时的所述接触步 骤的一部分期间，所述制剂的条件的特征在于不存在盐或存在最高达饱和的非零浓度的 盐。13. 根据权利要求1-12所述的方法，其中所述盐选自由氯化钢、氯化钟、氯化锭、漠化 钢、漠化钟、漠化锭、乙酸钢、乙酸钟、乙酸锭和其组合组成的组。14. 根据权利要求1-13所述的方法，其中所述方法包括:通过将所述制剂与驻留于所述 来源样品中的至少95%染色质分离开而由所述来源样品获得所述制剂的步骤。15. 根据权利要求1-14所述的方法，其中所述来源样品是细胞培养收获物、体液或组织 提取物。16. 根据权利要求15所述的方法，其中所述来源样品是细胞培养收获物。17. 根据权利要求1-16所述的方法，其中所述制剂通过包括分级分离的过程从所述来 源样品获得。18. 根据权利要求17所述的方法，其中所述分级分离在培育所述来源样品或来源于所 述来源样品的样品与尿囊素和辛酸之后进行。19. 根据权利要求17-18所述的方法，其中所述制剂包含来自所述分级分离过程的再溶 解 IgG。20. 根据权利要求1-19所述的方法，其中所述制剂含有使病毒灭活的一种或多种试剂。21. 根据权利要求20所述的方法，其中所述使病毒灭活的一种或多种试剂选自由依沙 叮晚、亚甲蓝、氯己定、苯扎氯锭、憐酸Ξ(正下基)醋和其组合组成的组。22. 根据权利要求20-21所述的方法，其中所述使病毒灭活的一种或多种试剂各自W约 0.1 %或更小的浓度存在。23. 根据权利要求1-22所述的方法，其中所述正电膜包含多个带正电荷的含氮部分，所 述多个带正电荷的含氮部分被共价固定到膜材料的结构或膜材料的结构内，从而位于所述 膜的制剂接触表面上。24. 根据权利要求23所述的方法，其中所述带正电荷的含氮部分选自由W下组成的组： (1)伯胺、（2)仲胺、（3)叔胺、（4)季胺、（5)聚胺、（6)亚胺、（7)N-杂环、（8)氨基酸、（9)N-径基 酷胺、（10)芳基胺、其聚合物和其组合。25. 根据权利要求23或24所述的方法，其中所述带正电荷的含氮部分进一步结合金属 离子。26. 根据权利要求23所述的方法，其中所述带正电荷的含氮部分选自由W下组成的组： Ξ(2-氨乙基）胺、二亚乙基Ξ胺、Ξ亚乙基Ξ胺、四亚乙基五胺、聚丙締亚胺四胺、聚（酷胺 基胺ΚΡΑΜΑΜ)树枝状聚合物、去铁胺、精氨酸、组氨酸、组胺、咪挫和其组合。27. 根据权利要求23-26中任一项所述的方法，其中所述带正电荷的含氮部分各自具有 式I的式：其中R在每次出现时独立地为氨或Ci-Cio烷基或被径基、氨基或面代部分取代的Ci-Cio 烷基，前提是至少一个R为与所述正电膜连接的位点，任选地经由连接体与所述正电膜连 接;并且 Χ、Υ和Z中的每一个独立地为(C出)n，其中η为2至化的整数，其中C此基团任选地被0或NH 替代。28. 根据权利要求27所述的方法，其中R在每次出现时独立地为氨或C3-C8烷基，前提是 至少一个R是与所述正电膜连接的位点，任选地经由连接体与所述正电膜连接。29. 根据权利要求27-28所述的方法，其中每个η是2至化的整数。30. 根据权利要求23-29所述的方法，其中所述带正电荷的含氮部分是Ξ(2-氨乙基） 胺。31. 根据权利要求23-30所述的方法，其中W通过如下方式制备的接枝的树枝状形式呈 现所述带正电荷的含氮部分:将二价或Ξ价伯氨基化合物固定在膜表面上，然后活化游离 氨基并连接另一个二价或Ξ价氨基化合物层，任选地重复所述过程。32. 根据权利要求23-25所述的方法，其中所述带正电荷的含氮部分可W包括烷基或芳 基组成的一个或者多个疏水部分。33. 根据权利要求1-32中任一项所述的方法，其中所述正电膜被容纳支持正切流动过 滤的装置中。34. -种用于实施根据权利要求1-33中任一项所述的方法的试剂盒。35. 根据权利要求34所述的试剂盒，其进一步包含用于澄清所述来源样品W获得所述 制剂的组分。36. 根据权利要求35所述的试剂盒，其中所述澄清组分被选择用于降低染色质含量。
【文档编号】C07K1/34GK105980397SQ201580008009
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2015年2月17日
【发明人】彼得·斯坦利·加尼翁
【申请人】新加坡科技研究局