在纳米颗粒表面控制功能分子密度的方法

专利名称：在纳米颗粒表面控制功能分子密度的方法
技术领域：
本发明涉及一种用功能分子修饰纳米颗粒的技术，尤其是涉及用巯基化或者硫代 磷酸化的、合成或者天然的核酸(如DNA)或肽与纳米颗粒结合的方法，以及用该功能化的 纳米颗粒检测生物分子的方法。
背景技术：
纳米颗粒，尤其是金等贵金属纳米颗粒，因具有与颗粒尺寸相关的物理化学特性 而广为人知。巯基化分子修饰的纳米颗粒现已被广泛应用于分子诊断、纳米医药和纳米技 术各个领域的研究。其中，DNA修饰的金纳米颗粒已成为研究的模型体系，并成功的应用在 对核酸、蛋白质及金属离子的生物分析、以及用在细胞成像、癌症治疗和纳米加工等领域。 然而，不同的应用对象对DNA分子在纳米颗粒表面的修饰密度有着不同的要求，其差别可 以从每个颗粒几条DNA链到上百条DNA链。例如，基于DNA杂交的生物检测通常需要每个颗粒结合几十条到上百条DNA链的 高密度修饰，因其可以产生很强的纳米颗粒间相互作用及锐化其特征解链温度的转变，这 些对提高检测的灵敏度尤为重要(Mirkin et al.，J. Am. Chem. Soc.，2003，125，1643-1654 ； J. Am. Chem. Soc.，2005，127，12754-12755.)。在基于纳米颗粒的生物条形码检测中，金纳 米颗粒表面较多的DNA链还可作为信号放大器以实现超灵敏蛋白质检测(Mirkin etal., Science，2003，301，1884-1886.)。在用DNA修饰的金纳米颗粒进行细胞内基因调控时， DNA在颗粒表面的紧密排列可防止核酸酶对其的降解(Mirkin et al.，Science，2006，312， 1027-1030.)。在用酶操控金纳米颗粒表面的DNA分子时，纳米颗粒的稳定以及反应效率的 进一步提高也需要在颗粒表面具有高密度的DNA (Brust et al.，J. Mater. Chem.，2004，14， 578-580 ；Qin and Yung, Biomacromolecules，2006，7，3047-3051·)。而另一方面，利用DNA分子实现金纳米颗粒的纳米组装时，研究者却通常都需要 低的DNA密度，其中每个颗粒带一个到少数几个DNA链，以便用其作为组装结构的基本设计 单元，如端点(每个颗粒一条链)、线(每个颗粒两条链)、角(每个颗粒三条链)或交叉 点(每个颗粒四条链)(Alivisatos et al.，Angew. Chem.，Int. Ed.，1999，38，1808-1812 ； J. Am. Chem. Soc.，2004，126，10832-10833 ；Chem. Mater.，2005，17，1628-1635.)。目前，为了满足不同研究对DNA在纳米颗粒表面密度或高或低的截然不同的要 求，两种独立且完全不同的纳米粒子修饰方法被广泛地应用于各种领域。对于高密度DNA修饰的纳米颗粒的合成，Mirkin等人建立了的方法被广泛采用， 以配合如基于大量DNA杂交的生物检测等的应用(Mirkin et al.，J. Am. Chem. Soc.，120， 1959-1964 (1998) ；US 专利 No. 6，361，944 ；US 专利 No. 6，777，186 ；US 专利 No. 6，878，814)。该方法是在对离子强度进行精细调控的条件下，直接孵育DNA与纳米颗粒的混合物，从而 在金纳米颗粒表面获得一层紧密排列的DNA。这个方法在下文中被称为“直接结合法”。 Mirkin等人更进一步研究了影响DNA表面密度的因素，包括盐浓度、间隔分子组成成分、纳 米颗粒尺寸和超声波处理程度等因素(Mirkin et al.，Anal. Chem.，78，8313-8318 (2006) 和US专利申请公开No. 2010/0099858 (PCT申请日2007年9月25日)。他们发现达到最 大表面密度需要DNA分子有聚乙二醇作为间隔分子，同时DNA与纳米颗粒的混合物需要在 含0. 7M氯化钠溶液中进行老化处理。结合过程中的超声波处理也将使得最终的DNA表面 密度产生实质性提高。虽然实际的DNA密度受Mirkin等人所描述的各种因素影响较大，但 是其大体上可以通过DNA与金纳米颗粒之间的孵育比进行调控。此外，Mirkin等人没有研 究如何控制负载在金纳米颗粒上的DNA的密度，以根据预期的应用在短时间内获得或高或 低的 DNA 密度。Brust 等人(Angew. Chem.，Int. Ed. 42，191-194(2003))在直接结合法中使 用真空离心处理从而进一步提高了 DNA表面密度。然而，在直接结合法中，DNA修饰层需要排列的足够紧密以保证纳米颗粒的稳定 性。因而，低密度DNA修饰的纳米颗粒很难合成，除非引入稀释链与目标链同时结合纳米颗 粒，以确保总修饰密度满足颗粒稳定性的要求。此外，鉴于DNA分子与颗粒表面存在静电排 斥，长时间孵育(20小时到2天)在这一方法中是不可避免的。对于合成低密度DNA修饰的金纳米颗粒，Alivisatos等人报道的另外一种方法被 广泛采用。他们先将纳米颗粒用二水合双(对磺酰苯基)苯基膦(biS(p-SUlfonatophenyl) phenylphosphine dihydrate) (BSPP)包被，再连接 H 基化 DNA(Alivisatos et al.， Nature，382，609-611 (1996))。这个方法在下文中被称为“BSPP法”。其总结合时间缩短到 12小时，且其每个颗粒表面的DNA链数量为离散分布。然而，鉴于BSPP层在颗粒表面的阻 碍作用，DNA密度很难通过这一方法提高。由前述可见，要想实现对DNA表面密度在从低到高的大范围内进行有效调节，上 述的两种方法本身都不能很好的解决。目前为止，尚缺一个统一且快速的方法来实现这一 控制目的，以满足不同应用对纳米颗粒修饰密度的要求。因此，需要一种能够在短时间内达 到或低(每个颗粒一条链)或高(每个颗粒数十条链)的功能性分子修饰密度的新方法。

发明内容
本发明提出了一种将纳米颗粒与功能性分子相结合的方法，其表面结合密度可通 过调节盐浓度和阻化剂的引入时间加以操控。本发明中所用的核苷酸和阻化剂可协助对结 合反应过程的调节，也使得对纳米颗粒表面功能性分子(其具有巯基部分)密度的大幅度 控制更为灵活。与传统方法需要的几天时间相比，本发明所描述的方法可使整个结合反应 时间缩短到几个小时或几分钟。本发明的方法包括将纳米颗粒、核苷酸和功能性分子在适当条件下混合，以形成 纳米颗粒和功能性分子的结合体。其中适当条件是指对缓冲液、盐和可停止结合反应的阻 化剂的使用，以及通过调节盐浓度和阻化剂引入时间而对功能性分子表面密度的操控。在 本发明的实施方案之一中，其功能性分子为巯基化分子而其阻化剂为巯基化低聚乙二醇。 在相应的方案中，本发明方法包括以下几个步骤孵育纳米颗粒与核苷酸以形成核苷酸包 被的纳米颗粒；调节结合反应体系的缓冲液和盐的浓度；在结合反应体系中加入巯基化分
5子与核苷酸包被的纳米颗粒孵育；在结合反应体系中引入巯基化低聚乙二醇以终止巯基化 分子与纳米颗粒间的结合反应。本发明方法简便、有效、成本效益好，且可以很快的大范围调控功能性分子在纳米 颗粒表面的结合密度，从而可以满足生物检测、分子诊断、纳米医药和纳米组装等多种实际 应用的要求。


图1是本发明的示意图。图中(a)为通过两个要素对功能性分子在纳米颗粒表面 密度的调控示意；(b)为(a)的一个实例演示图。图2展示了盐浓度对巯基化DNA在金纳米颗粒表面修饰密度的影响。图中(a)为 巯基化DNA thiol-T30与金纳米颗粒在一系列NaCl浓度(OmM、10mM、50mM和IOOmM)下结 合后的凝胶电泳图片；(b)为荧光法测得的(a)中各条件下样品的DNA表面密度。图3对比了巯基化DNA thiol-T5与巯基化低聚乙二醇用作本发明中阻化剂的功 效。图中(a)为用巯基化DNA-T5阻化金纳米颗粒与巯基化DNA-T30结合过程的凝胶电泳 图片；(b)为用巯基化低聚乙二醇阻化金纳米颗粒与巯基化DNA-T30结合过程的凝胶电泳 图片；(c)为荧光法测得的(a)与(b)中各样品的DNA表面密度。图4是本发明方法在金纳米颗粒与103bp巯基化双链DNA分子(103bp-dsDNA)结 合反应中的演示实例。图中(a)为在同样于30分钟时间点引入巯基化低聚乙二醇的前提 下，一系列盐浓度中生成的结合体；(b)为在50mM氯化钠中，于不同时间点引入巯基化低聚 乙二醇所生成的结合体。图5是本发明方法应用于金纳米颗粒的纳米组装上的实例演示。图中(a)为金纳 米颗粒通过DNA杂交而形成的组装结构的示意图；(b)和(c)分别为由OmM和50mM氯化钠 溶液中所生产的结合体组装而成的样品的凝胶电泳图，在其相应的结合过程中巯基化低聚 乙二醇在一系列不同的时间引入反应过程；(d)和(e)分别展示了二聚体(凝胶底部第二 条带)与三聚体(凝胶底部第三条带)的相应透射电镜图像(比例尺100nm)。图6是本发明方法合成的具有不同表面密度的DNA/DNA或者DNA/肽共结合的金 纳米颗粒的凝胶电泳图。图中(a)为两种DNA/DNA共结合产物，(b)为两种DNA/肽共结合 产物。图7是采用本发明方法合成的DNA/肽共修饰的金纳米颗粒用于多重酶检测的应 用实例演示。图中(a)和(b)分别为酶反应样品与链亲和素修饰的磁珠作用前与作用后的 凝胶电泳图。图8是本发明所介绍的ATP介导的纳米颗粒修饰法与BSPP法在不同结合时间的 对比凝胶电泳演示。
具体实施例方式本发明所适用的纳米颗粒包括但不局限于金属的(非局限性示例包括金、银、铜 和钼)；半导体的(非局限性示例包括量子点，CdSe, CdS,以及ZnS包被的CdS或CdSe)； 磁性胶体材料。在一个实例中，其可为金纳米颗粒、银纳米颗粒或量子点(quantum dots)。 纳米颗粒的平均直径可以是5-250nm，或者是5-50nm，亦或为10-30nm，具体范围取决于需要被修饰的纳米颗粒的实际用途。适用的纳米颗粒可以是通过常规方法合成的或者是Ted Pella, Inc.(金)、Amersham Corp.(金)禾口 Nanoprobes，Inc.(金)等公司的商品化产品。 纳米颗粒也可已有其他功能分子修饰，以使其可以与巯基或巯基化物质结合。功能化的纳 米颗粒可以是以一种生物分子官能团单一修饰，也可以是由两种或两种以上的生物分子官 能团的多重或异化修饰。本发明所适用的功能化分子(也称为“功能分子”或“功能性分子”)可以是天然 的或者合成的物质，其分子结构可以含有巯基或硫代磷酸酯等选择性修饰的官能团。这些 功能化分子包括但不局限为巯基化核酸、含有半胱氨酸的肽链和硫代磷酸化的核酸。这一 类的核酸包括但不局限为以下实例基因；病毒RNA和DNA ；细菌DNA ；真菌DNA，cDNA，mRNA， RNA和DNA片段；寡聚核苷酸；合成寡聚核苷酸；修饰的寡聚核苷酸；单链和双链核酸；天然 的和合成的核酸，等等。其一种实施方式可为巯基化DNA。巯基化分子可以是单一组分，也可是两种及两种以上的混合组分以制备共修饰的 纳米颗粒，其非局限性示例包括不同DNA分子(DNA/DNA)共修饰的纳米颗粒、DNA和肽链 共修饰的纳米颗粒、DNA和抗体共修饰的纳米颗粒、和肽链与聚乙二醇同修饰的纳米颗粒。 不同DNA分子共修饰的纳米颗粒的一种实施方案可以是thiol-T5/thiol-T30共同修饰的 金纳米颗粒、或thi0l-T5/bi0tin-thi0l-DNA共同修饰的金纳米颗粒。在另一种实施方 案中，DNA和肽链共修饰的纳米颗粒可以是thiol-T5/Peptide 1共同修饰的金纳米颗粒、 thiol-T30/P印tide 1共同修饰的金纳米颗粒、或thiol-T30/P印tide 2共同修饰的金纳 米颗粒。本发明中用以停止结合反应的阻化剂包括但不局限于巯基化低聚乙二醇(聚合 度介于3到7之间)。与要修饰的功能性分子相比，阻化剂可以优先竞争纳米颗粒表面的结 合位点，由此终止功能性分子与纳米颗粒的结合反应。同时，阻化剂不会明显取代纳米颗粒 上已结合的功能性分子，其已被Thiol-T30修饰的金纳米颗粒与巯基化低聚乙二醇在混合 不同时间(10到60分钟)后的凝胶电泳测试所证明。修饰的金纳米颗粒的电泳迁移距离 不会随着与巯基化低聚乙二醇混合时间的延长而增加。本发明所适用的核苷酸包括但不局限于单核苷酸和寡聚核苷酸，其可结合在纳 米颗粒表面从而形成核苷酸包被的纳米颗粒。核苷酸可以保护纳米颗粒以避免其在盐溶 液中发生不可逆聚集，因此，在纳米颗粒与功能性分子的结合反应体系中，可以加入盐来 中和二者间的静电排斥。核苷酸可以是RNA或DNA。在具体方案中，核苷酸实例可以是腺 苷(如ATP)或富含腺苷的核苷酸，甚至是由腺苷组成的核苷酸(如寡聚核苷酸polyA5， 5’ -AAAAA-3’)。核苷酸可以是单一种类或两种及以上的混合物。在不影响功能性分子在纳米颗粒表面的结合率的前提下，其他添加剂也可在本发 明方法中使用。这些添加剂的实例包括但不局限于SDS，Tween 20和Carbowax。本发明所适用的缓冲液包括但不局限于磷酸盐缓冲液，Tris缓冲液，及其他类 似缓冲液。缓冲液的作用是确保溶液PH的稳定，使得功能化分子带电量在结合反应过程中 相对稳定。不同种类的缓冲液可能对制备功能化分子修饰的纳米颗粒有轻微影响，但不会 妨碍其结合反应过程。此外，本发明对盐的种类没有特别限制，只要其能够有效地改变离子 强度即可，例如，所适用的盐包括但不局限于氯化钠，氯化钾，以及其他类似的强解离度的 盐，以便有效调节溶液的离子强度。
制备功能性分子修饰的纳米颗粒的方法包括以下步骤先将纳米颗粒、核苷酸和 功能性分子在适当条件下混合，以形成纳米颗粒和功能性分子的结合体。其中适当条件是 指对缓冲液、盐和可停止结合反应的阻化剂等的使用，以及通过调节盐浓度和阻化剂引入 时间而对功能性分子表面密度的操控。具体而言，本发明方法包括以下几个步骤孵育纳米 颗粒与核苷酸以形成核苷酸包被的纳米颗粒；调节结合反应体系的缓冲液和盐的浓度；在 结合反应体系中加入功能化分子与核苷酸包被的纳米颗粒孵育；在结合反应体系中引入阻 化剂以终止功能化分子与纳米颗粒间的结合反应。通过控制反应条件，尤其是盐浓度、阻化剂的引入时间、以及核苷酸的使用，巯基 化DNA在金纳米颗粒表面的修饰可以在短时间(如1小时内)形成高密度(每颗粒数十条 链)或低密度(每颗粒一条链)的修饰效果。 为了快捷地制备DNA表面密度可控的功能化纳米颗粒如DNA/金纳米颗粒，需要对 纳米颗粒分散(即稳定性)和DNA结合动力学过程有所控制。为了保证良好的稳定性，金 纳米颗粒与单核苷酸(如ATP)混合孵育，以便ATP可以吸附在颗粒表面形成保护层，防止 金纳米颗粒在盐溶液中发生不可逆聚集。同时，这一 ATP保护层还可通过加热去除并为巯 基化DNA所替代。除了采用单核苷酸包被技术提高金纳米颗粒对盐的耐受性之外，本发明方法还运 用盐浓度的改变与巯基化低聚乙二醇的引入这两个因素，来操控DNA在金纳米颗粒表面的 附着。盐浓度的改变可用以调节DNA与金纳米颗粒表面之间的静电排斥，从而产生调节二 者结合速度的效果。另一方面，巯基化低聚乙二醇可作为阻化剂同时引入反应体系。与DNA 相比，巯基化低聚乙二醇分子比较小且为电中性，因此其与金纳米颗粒作用快且静电排斥 较小。故低聚乙二醇可有效地与DNA分子竞争纳米颗粒表面的结合位点，以达到抑制结合 反应的效果。附图1中(a)为用本发明方法控制功能性分子在纳米颗粒表面修饰密度的示意 图，纳米颗粒⑴先与核苷酸⑵混合并孵育足够时间(例如15分钟)以形成核苷酸包被 的纳米颗粒(3)。其后加入相应缓冲液，并将其中的盐浓度调节至适当水平。之后将巯基 化分子(4)引入反应溶液中并孵育一定时间。在这过程中，巯基化分子(4)在核苷酸包被 的纳米颗粒(3)表面的密度可以通过调节盐浓度(5)和阻化剂的引入时间点(12)加以控 制。盐浓度的低(6)、中(7)、高(8)，或者阻化剂加入时间的早(13)、中(14)、晚(15)将分 别相应得到低密度(9)、中密度(10)、高密度(11)的修饰纳米颗粒(核苷酸包被的纳米颗 粒(3)上具有巯基化分子(4))。在图1(a)中，核苷酸(2)可以在几分钟内吸附于纳米颗粒⑴表面而形成一保护 层，以保护纳米颗粒在盐溶液中的稳定性。另一方面，吸附于纳米颗粒(3)表面的核苷酸 (2)可以进一步被巯基化分子(4)所取代，以实现核苷酸包被的纳米颗粒(3)的功能化修 trfi (Zhao, et al. , Langmuir, 23, 7143-7147 (2007) and Zhao, et al. ,Bioconjugate Chem., 20，1218-1222(2009).)。在核苷酸(2)的保护下，核苷酸包被的纳米颗粒(3)对盐的耐受性大幅提高，所以 巯基化分子(4)与核苷酸包被的纳米颗粒(3)间的静电排斥力得以通过增加离子强度的 方式显著降低，而不会使核苷酸包被的纳米颗粒(3)产生聚集。由于静电排斥力是功能分 子与纳米颗粒结合的主要阻力，因此对盐浓度(图1(a)中(5))的调节将起到调节巯基化分子(4)在纳米颗粒表面结合速度的效果。因而当盐浓度由低到高变化时(图1(a)中6 到8)，核苷酸包被的纳米颗粒(3)表面结合的巯基化分子(4)的密度也相应的由低升到高 (图 1(a)中 9 到 11)。另一方面，在图1(a)中，鉴于电中性的小分子阻化剂(12)扩散快且与核苷酸包被 的纳米颗粒(3)的静电排斥小，其与核苷酸包被的纳米颗粒(3)的结合速度也因而比巯基 化分子(4)快很多。这使得在被核苷酸包被的纳米颗粒(3)上，巯基化分子(4)的结合可 以被阻化剂(12)竞争性抑制。故阻化剂(12)的引入可以被用来终止巯基化分子(4)与核 苷酸包被的纳米颗粒(3)的结合反应，且如果于巯基化分子(4)结合的不同阶段引入阻化 剂(12)则可以得到不同的表面密度，如在早(13)、中(14)、晚(15)期引入阻化剂(12)则 可相应得到以低密度(9)、中密度(10)、高密度(11)巯基化分子修饰的纳米颗粒。对于图1(a)及(b)，其核苷酸⑵可以是三磷酸腺苷(ATP)或富含腺苷的寡聚 核苷酸，这是因为腺苷与金属的吸附力强于其余种类的核苷(Zhao，et al.，Langmuir, 23, 7143-7147(2007).)。盐浓度(5)的调节可以通过加入如氯化钠等来实现；而阻化剂(12)可 采用巯基化低聚乙二醇，因其既可以钝化核苷酸包被的纳米颗粒(3)又可以在许多生物测 试中防止非特异性吸附。本发明的一种实施例可以是用巯基化DNA(thiolated T30 5'-TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT-C3-thiol-3，)作为功能性分子修饰 13nm 的金纳 米颗粒(Au-nps)。图2对比了在不加阻化剂巯基化低聚乙二醇的条件下，0、10、50、100mM等一系列
氯化钠浓度对巯基化DNA在金纳米颗粒表面结合密度的影响，其中在上述的氯化钠浓度下 保持30分钟可以合成一系列的巯基化DNA/金纳米颗粒结合物。本发明方法中的盐浓度可 根据功能性分子的带电量以及期望其在纳米颗粒表面的密度而决定。由于DNA分子的带电 量通常主要来自于其骨架中的磷酸根基团，故DNA链越长其带电量越高。长链DNA分子的 结合通常需要高的盐浓度以充分中和静电排斥力；否则将会产生低密度的修饰效果。例如， 对比103bp-dsDNA(实施例1)与thiol-T30(实施例2)跟同样的金纳米颗粒的结合可见， 在同样的盐浓度下(OmM氯化钠)，103bp-dsDNA很难在30分钟内结合到金纳米颗粒上(图 4(a))，而thiol-T30则在15分钟内已结合到可以成功进行DNA杂交的密度(图5中(6))。巯基化DNA在金纳米颗粒表面的结合密度可以通过3%琼脂糖凝胶电泳检测，因 其电泳迁移率会随着巯基化DNA结合数量的增加而滞后(Parak，et al.，Nano Lett.，3， 33-36(2003) ；Zanchet, et al.，Nano Lett.，1，32—35(2001) ·)。如图2(a)所示，当盐浓度由OmM上升至IOOmM时，纳米颗粒的电泳迁移率显著下 降，这反映出盐浓度越高则结合在纳米颗粒表面的巯基化DNA越多。不同盐浓度下形成的 DNA密度也可通过Demers等人在Anal. Chem.，72，5535-5541 (2000)和Hurst，et al. ,Anal. Chem.，78，8313-8318 (2006)中报道的荧光方法定量测定，其中thiol_T30被含有荧光基团 标记的巯基化DNA(5，-TET-T30-thiol-3，)代替。如图2(b)所示，在OmM到IOOmM的氯化 钠浓度范围内，巯基化DNA在每个纳米颗粒表面的结合量为13到40条链。 若将盐浓度提高到金纳米颗粒的耐受极限(如ATP包被的IOnm金颗粒为0. 7M氯 化钠)，或是将结合反应时间延长至3个小时以上，则可得到与前人工作相似的高密度DNA。 然而，若未对结合反应时间加以精确控制，其反应生成的DNA密度将可能有着比较大的分 布。如同像图2(a)中所示，当反应只是通过20分钟的离心处理以去除未反应物质(过量的DNA)来缓慢停止的时候(期间仍可能发生结合反应)，纳米颗粒在凝胶电泳中会形成宽 度较大的电泳条带。为了能够比较精确的控制反应时间，可以引入一些小分子作为终止反应的阻化 剂。这一类小分子可以包括像巯基化低聚乙二醇和thiol-T5(较短的寡聚DNA)等比目标 巯基化DNA分子更易与金纳米颗粒结合的物质。图3对比了用thiol-T5(a)和巯基化低聚 乙二醇(b)做阻化剂的效果。二者分别以三种方式(在三个时间点)加入到结合反应体系 (反应3小时)中，其相应在图3中标记为I、II和III。图3示出了阻化剂在操控功能性分子表面密度方面的效果。方式I为先将阻化剂 (巯基化低聚乙二醇或thiol-T5)与金纳米颗粒混合孵育1.5小时，之后加入目标功能分子 thiol-T30再孵育1. 5小时；方式II为先将目标功能分子thiol-T30与金纳米颗粒混合孵 育1.5小时，之后加入阻化剂(巯基化低聚乙二醇或thiol-T5)再孵育1.5小时；方式III 是将thiol-T30与阻化剂(巯基化低聚乙二醇或thiol-T5)预混合后与金纳米颗粒共同混 合孵育3小时整。同时，金纳米颗粒也分别与thiol_T30和阻化剂(巯基化低聚乙二醇或thiol_T5) 单独反应，以相应作为代表最高表面密度(阳性对照)和最低表面密度(阴性对照)的 对照。如图3所示(图3(a)表示thiol-T5的情况，图3 (b)表示巯基化低聚乙二醇的情 况)，用凝胶电泳检测各种方式下的结合反应产物可见，方式I和II中巯基化低聚乙二醇和 thiol-T5对反应有着类似的影响，即，若阻化剂先于thiol-T30与金纳米颗粒混合，则其会 妨碍之后的thiol-T30的结合，反之则不会。故方式I中金纳米颗粒结合的DNA比方式II 要少，且其电泳条带位置也相应超前。然而，如以方式III进行结合反应，则巯基化低聚乙 二醇和thiol-T5有着显著的区别。使用巯基化低聚乙二醇的样品与最低密度对照接近，而 使用thiol-T5的样品则介于最高和最低密度对照之间。这说明电中性的巯基化低聚乙二 醇比带负电的thiol-T5更适合做阻化剂。一旦加入巯基化低聚乙二醇，巯基化DNA与金纳 米颗粒的结合就显著延迟。图3中(c)的荧光检测也反映了相似效果(与图3(a)和(b) 的凝胶电泳结果相符)。因此，巯基化低聚乙二醇更适合用作阻化剂以精确控制结合反应的 时间。结合反应的速度可以通过改变盐浓度来控制，而某一时刻的DNA表面密度可以通 过引入巯基化低聚乙二醇结束反应来限定。两个因素结合起来，就有了如图1中(b)所示 的两种方案以实现对纳米颗粒表面DNA密度的有效操控。这两种表面密度操控方案可以在 长链DNA (如thiol-103bp)与金纳米颗粒的结合反应中得到演示。选择长链DNA进行演示 是因为其表面密度的变化可以显示为凝胶电泳中离散条带的变化。对于不同长度的DNA链，达到相同表面密度所需要的反应时间可能很不一样。长 链DNA到纳米颗粒表面的扩散速度比较慢，故需要较长结合反应时间。例如，同样是在50mM 氯化钠溶液中反应5分钟，thiol-T30得到的表面密度(图5中(12))就比103bp-dsDNA(图 4(b)中左起第二条带)要高。每个颗粒结合的多条thiol-T30使得纳米颗粒可以形成复杂 的纳米组装结构，而平均每个颗粒结合的103bp-dsDNA只有一条或更低。使用图1中(b)所示的右侧合成路线，在同样反应时间下，多条低迁移率的离散 条带随着盐浓度的升高而逐渐出现在凝胶电泳的结果中(图4中(a))。同样的，用图1中 (b)左侧的合成路线，在固定盐浓度的前提下，相似结果也随着巯基化低聚乙二醇引入时间的推迟而出现(图4中(b))。同时，对于代表没有DNA结合的纳米颗粒的最高迁移率条带， 其条带强度也相应逐步降低，说明本发明方法可以实现对DNA在纳米颗粒表面结合密度的 细致调控，以适应不同应用领域的要求。对纳米颗粒表面DNA结合密度的灵活而快速的控制有着广泛的应用前景。以目前 流行的DNA介导金纳米组装为例，其基本组装单元需要极低密度DNA修饰的稳定纳米颗粒。 与传统BSPP法相比，本发明方法可以使得其基本组装单元的合成过程由传统的10个小时 缩短到几分钟，因为本方法中DNA与纳米颗粒的链接速度比BSPP法快，这可以通过对比本 发明方法与BSPP法在不同结合时间后的凝胶电泳结果证明，如图8所示。在这方面，图8 示出ATP介导的方法(带6至9)与BSPP法(带1至4)在不同时间进行凝胶电泳的比较 图(在各方法中从左到右分别为0分钟、5分钟、10分钟、20分钟)。其中本发明方法(ATP 法)所用的氯化钠浓度为50mM ；BSPP单独包被(没有与thiol_DNA混合)的金纳米颗粒用 作阴性对照，标记为“_” ；而阳性对照为在IOOmM氯化钠中结合20分钟的thiol-T30修饰 的金纳米颗粒，标记为“ + ”。如图5所示，应用本发明方法，在OmM氯化钠中反应30分钟后(7)或者50mM氯化 钠中反应仅5分钟后(12)，所得结合了 DNA的纳米颗粒(thiol-T30/Au-nps和thiol_A30/ Au-nps)已经可以通过DNA杂交而组装，并在凝胶电泳中显示出离散的条带。鉴于短链DNA 修饰的纳米颗粒在电泳中的离散主要取决于纳米颗粒的大小及数量，因此这里离散的各条 带分别代表不同的纳米结构。金纳米颗粒二聚体和三聚体等纳米结构，可成功用本发明方 法所制备的低密度DNA修饰的纳米颗粒在短时间内获得，其结构可通过透射电镜(TEM)验 证，分别如图5中(d)和(e)所示。本发明方法还可用于制备由一种或多种功能性分子修饰的金纳米颗粒，其可以是 由如DNA、肽、抗体等一种功能性生物分子修饰的金纳米颗粒，也可以是由它们的混合物，如 寡聚核苷酸和抗体、DNA和肽、聚乙二醇和肽，等等共修饰的金纳米颗粒。图6为用本发明 方法制备的由不同DNA或DNA/肽共修饰的金纳米颗粒的凝胶电泳图。图6中(a)为两种 不同DNA共修饰的颗粒颗粒1修饰有高密度thio-T5和低密度thiol-T30(l和2)；颗粒2 修饰有高密度thiol-T30和低密度biotin-thiol-DNA(5和6) ；二者的混合液(3和4)；以 及各自与链亲和素包被的磁珠作用前(1、3和5)和作用后的样品(2、4和6)。图6中(b) 为两种DNA/肽共修饰的颗粒颗粒3修饰有thio-T5和P印tidel (CALNNAAGFPRGGG {bioti n-Lys}) (9 和 10)；颗粒 4 修饰有 thiol_T30 和 Peptide2 (CALNNAALRRASLG) (11 和 12) ；二 者的混合液(13禾Π 14)；以及各自与链亲和素包被的磁珠作用前(9、10和11)和作用后的 样品(10、12 和 14)。运用本方法所得到的DNA/肽共修饰的金纳米颗粒，可用于鉴别如胰蛋白酶和脱 氧核糖核酸酶I等多种生物分子。如图7所示，胰蛋白酶、脱氧核糖核酸酶I或二者的混合 物可以通过其与thiol-T30/P印tidel共修饰的金纳米颗粒5在适当的缓冲液中孵育反应， 并与链亲和素包被的磁珠作用后用凝胶电泳鉴别(详见实施例4)。在图7中，条带1和7 表示仅包被巯基化低聚乙二醇的金纳米颗粒(其用作参照)；条带2和8为在水中的共修饰 的纳米颗粒5 (其用作参照)；条带3和9为在缓冲液1(即50mM Tris-HCl，pH 8，包含IOmM CaCl2)中的、与牛血清蛋白混合的共修饰的纳米颗粒5(其用作参照)；条带4和10为在缓 冲液1中与胰蛋白酶一起孵育的共修饰的纳米颗粒5 ；条带5和11为在缓冲液2(即50mMTris-HCl，pH7. 5，包含IOmM MgCl2和0. ImM DTT)中与脱氧核糖核酸酶I 一起孵育的共修 饰的纳米颗粒5 ；条带6和12为在缓冲液3(即50mM Tris-HCl，ρΗ7· 5，包含IOmM MgCl2, IOmM CaCl2和0. ImM DTT)中与胰蛋白酶和脱氧核糖核酸酶I 一起孵育的共修饰的纳米颗 粒5。综上所述，本发明提出了一种灵活快捷的方法以操控金纳米颗粒表面DNA的结合 密度。在核苷酸(如单核苷酸)的包被下，金纳米颗粒与DNA的结合速度可以通过改变盐 浓度而大范围调节；同时可以在结合反应过程的特定时间点引入巯基化低聚乙二醇来终止 反应，以便将DNA在纳米颗粒表面的结合密度控制在很窄的范围内。这一操控策略对于需 要高密度或低密度DNA修饰的应用领域都能适用。本发明的优势包括但不局限于以下几点通过核苷酸包被提高了纳米颗粒在盐溶 液中的稳定性；在巯基化分子与纳米颗粒结合过程中，通过改变盐浓度实现了对结合反应 速度的调节；通过引入巯基化低聚乙二醇，达到了对结合反应时间的精确控制；并能对功 能性分子在纳米颗粒表面上的密度进行大范围的调节。同时，本发明方法操作简便，不需要 特殊的或复杂的仪器，并且根据需要的表面密度可在几个小时或更短时间之内完成。广义来讲，本发明是一种在反应速度、操作时间、纳米颗粒稳定性和功能性分子表 面结合密度等方面进行调节的方法，用以制备巯基化物质修饰的纳米颗粒。本发明也可以 整合到任何纳米材料的功能化修饰或生物检测的过程中，或是任何可以利用到上述优势的 设计应用中。实施例可以通过以下的实施例对本发明进行更详细的描述。然而，应当注意，本发明的范 围并不局限于这些实施例。这些实施例仅应认为是示例性的，并且是本发明的代表。实施例1操控103bp巯基化双链DNA (103bp-dsDNA)在13nm金纳米颗粒表面的结合密度103bp_dsDNA是通过用巯基化引物(巯基化反向引物5，-thiol-C6_CAG GAA ACA GCTATG AC-3，和正向引物5，-GTA AAA CGA CGG CCA G-3，)对 Ml3 噬菌体载体进行 聚合酶链式反应(PCR)扩增而得到的，其PCR产物进一步用试剂盒(PCRquick-spin PCR ProductPurification Kit)纯化。103bp_dsDNA的终浓度可通过测量样品在260nm波长下 的吸光度而得到。与此同时，1100 μ L柠檬酸稳定的13nm金纳米颗粒与ATP以1 1000的摩尔比混 合孵育15分钟，之后加入pH 8.0的IOmM磷酸钠缓冲液再孵育15分钟。将孵育好的混合 液分成11等份，再将其中5份的氯化钠浓度分别调整为OmM，IOmM, 20mM, 30mM, 40mM,其余6 份的氯化钠浓度全部为50mM(如图4所示)。每一等份均含有100 μ L IOnM的金纳米颗粒。混合液稍加震荡混勻后，以3倍于金纳米颗粒浓度的摩尔比向其中加入纯化过 的103bp-dsDNA开始结合反应。在反应过程中的O、5、10、20、30分钟等时间点，分别向各 个50mM氯化钠的反应体系中加入1000倍(摩尔比)于金纳米颗粒浓度的巯基化低聚 乙 二酉享(O-(2-Carboxyethyl)-ο ‘ -(2-mercaptoethyl)heptaethylene glycol,672688 Aldrich)；对于不同盐浓度体系的样品，巯基化低聚乙二醇的加入时间点统一为30分钟 (如图4所示)。巯基化低聚乙二醇加入后孵育15分钟，结合反应终止。在这里需要注意 的是，对于低密度修饰的结合反应，巯基化DNA与金纳米颗粒的混合摩尔比可相应降低。反应后的混合液进行离心处理(13，200转每分钟，20分钟)以去除过量的物质，之后用等体积 的IOmM磷酸钠缓冲液(pH 8. 0)重悬并反复离心清洗2次。最终的结合反应产物用10 μ L 凝胶上样缓冲液(含5%甘油的IX Tris-Borate-EDTA缓冲液)重悬，以直接用于后面的凝 胶电泳。3%的琼脂糖凝胶电泳用以检测样品(带有不同数量的103bp-dsDNA的金纳米颗 粒，即未结合任何DNA、每个纳米颗粒结合一个DNA和每个纳米颗粒结合两个DNA的纳米颗 粒)，其电泳条件为=IX Tris-Borate-EDTA的电泳缓冲液，5V/cm的电压，120分钟。如图 4所示，金纳米颗粒按照其结合的DNA链数量不同而分离成不同的电泳条带，因此凝胶电泳 中离散条带的第次显现，使得DNA在纳米颗粒表面密度的增加清晰可见。实施例2制备低密度DNA修饰的金纳米颗粒以组装金纳米颗粒二聚体或三聚体纳米结构将两条互补巯基化DNA 链(thiol-T30，5，-TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTTTTT-C3-thiol-3，；禾口 thiol_A30，5，-AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAAAAA-C3-thiol-3’ )分别按照类似实施例1中所述的步骤与金纳米颗粒结合，不同之处 在于巯基化DNA与金纳米颗粒的摩尔比调整为120 1，同时巯基化低聚乙二醇的引入时间 点为5分钟(图5中(4和12))、10分钟(图5中(5和13))、15分钟(图5中(6和14))、 30分钟(图5中(7和15))和过夜(图5中(8和16))，两组平行盐浓度分别为0mM(图5 中(b))和 50mM(图 5 中(c))。修饰有互补DNA链的两种金纳米颗粒在含0. IM氯化钠的IOmM磷酸钠缓冲液(pH 8.0)中杂交过夜，以形成二聚体(图5中(2))和三聚体(图5中(3))等各种纳米组装 结构。各种纳米组装结构的混合液通过3%的琼脂糖凝胶电泳加以分离，其电泳条件为 IXTris-Borate-EDTA的电泳缓冲液，5V/cm的电压，60分钟。各种纳米结构根据所含纳米颗 粒的数目分成不同的电泳条带，其中单颗粒(图5中(1))位于凝胶最前沿(图5中(9和 17))，二聚体(图5中(2))在其之上的位置(图5中(10和18))而三聚体(图5中(3)) 紧随二聚体之上(图5中(11和19)。二聚体和三聚体结构可以通过透射电镜(TEM)加以 确认，如图5中(d)和(e)所示。TEM样品的准备步骤如下先用锋利的刀片在凝胶中对应 条带的前沿切开一条线，再把0.01%聚赖氨酸溶液预处理过的铜网(SPrSupplies Inc., 400目)沿切口处插入凝胶中，继续电泳10分钟后取出铜网(金纳米颗粒组装体转移到铜 网上)，干燥后用TEM检测。实施例3制备DNA/DNA或DNA/肽共修饰的金纳米颗粒DNA/DNA共修饰金纳米颗粒的制备方法采用与实施例1中类似的步骤，将两种DNA链(thiol-T5，5，-TTT TT-C3_thiol-3 ； 和 thiol-T30，5，-TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT-C3-thiol_3，)先后以不 同密度结合到金纳米颗粒上得到结合体1(图6中(1和2))。其中，低密度thiol-T30先与 金纳米颗粒以50 1的摩尔比在含OmM氯化钠的缓冲液中孵育15分钟，然后通过离心处 理(13，200转每分钟，20分钟)去除未反应的物质；之后，高密度thiol-T5再与金纳米颗 粒以250 1的摩尔比在含0. IM氯化钠的缓冲液中孵育30分钟，最后加入巯基化低聚乙 二醇再孵育15分钟结束反应。另一 DNA/DNA共修饰的金纳米颗粒结合体2用同样方法制备(图6中(5和6))，其结合的两种DNA链为低密度biotin-thiol-DNA(5，-thiol-C6_GT C TTCTTC TTC TTT CTT TCT CGG AAT TCC GTT GTT TCT TTT CTT T-biotin-3，)和高密度 thiol-T30。DNA/肽共修饰金纳米颗粒的制备方法采用与实施例1中类似的步骤，thiol_T5先与金纳米颗粒以50 1的摩尔比在含 0. IM氯化钠的缓冲液中孵育30分钟，之后再以100倍于金纳米颗粒的摩尔比加入P印tide 1 (CALNNAAGFPRGGG{biotin-Lys})孵育30分钟，形成DNA/肽共修饰金纳米颗粒结合体 3(图6中(9和10))。最后加入巯基化低聚乙二醇再孵育30分钟结束反应。另一 DNA/肽共 修饰金纳米颗粒结合体4(图6中(11和12))用thiol-T30和P印tide 2 (CALNNAALRRASLG) 以同样步骤制备。将各种共修饰结合体分别与盐水_柠檬酸钠(SSC)缓冲液预清洗过两次的链亲和 素包被的强磁性磁珠(SA-MP) (Spherotech Inc.)在盐水-柠檬酸钠(SSC)缓冲液中混合 孵育2个小时以上，再用与实施例1中类似的凝胶电泳方法检测，不同之处在于这里使用的 是琼脂糖凝胶，电泳时间为60分钟。图6中，未与磁珠孵育的样品为图6中的1、3、5、 9、11和13 ；而与磁珠孵育后的样品为2、4、6、10、12和14。通过选择性控制特定分子在共 修饰金纳米颗粒表面上的密度，不同的共修饰纳米颗粒结合体可以很容易在凝胶中彼此区 分开(图6中(7和8)与(15和16))。通过比较凝胶中两种DNA/DNA共修饰的金纳米颗 粒(图6中(3和4))，可以明显见到，带有高密度thiol-T5的结合体2(图6中(8))在电 泳中的迁移比带有高密度thiol-T30的结合体1(图6中(7))快的多。同样的，对比两种 DNA/肽共修饰金纳米颗粒(图6中(13和14))，带有thiol_T5的结合体3 (图6中(16)) 在电泳中的迁移比带有高密度thiol-T30的结合体4(图6中(15))快的多。实施例4用基于DNA/肽共修饰金纳米颗粒的凝胶电泳实现多重酶鉴定对于DNA/肽共修饰的金纳米颗粒结合体的制备，先用与实施例3中描述的相同的 步骤制备thiol-T30与P印tide 1共修饰的金纳米颗粒(以下称结合体5)。结合体5与不同的反应缓冲液混合，用以鉴定不同的酶反应对胰蛋白酶 (Trypsin)的鉴定(图7中(4和10))用缓冲液1 (50mM的Tris-HCl缓冲液，pH 8，其中含 有IOmM CaCl2)；对脱氧核糖核酸酶I (DNaseI)的鉴定(图7中(5和11))，用缓冲液2 (50mM 的 Tris-HCl 缓冲液，pH 7.5，其中含有 IOmM MgCl2 和 0. ImM DTT)；对 Trypsin 和 DNaseI 共 存的鉴定(图7中(6和12))用缓冲液3 (50mM的Tris-HCl缓冲液，pH 7. 5，其中含有IOmM MgCl2, IOmM CaCl2和0. ImM DTT)。同时，无酶反应的参比对照组为结合体5与牛血清蛋白 (BSA)在缓冲液1中的混合液(图7中(3和9))，另一无缓冲液或蛋白的对照组为结合体 5在双蒸水中重悬的样品(图7中(2和8))。上述缓冲液混合体系中在加入相应的酶样品后于37°C孵育12小时，之后离心 (13，200转每分钟，20分钟)以去除剩余反应物，并用等体积的双蒸水重复离心清洗两次， 最后在SSC缓冲液中与SA-MP混合并室温孵育2小时以上。处理好的样品用实施例3中描 述的琼脂糖凝胶电泳检测，其结果如图7所示。未与SA-MP孵育的样品为图7(a)中(2至 6)，而与SA-MP孵育后的样品为图7(b)中(8至12)。图7中(1和7)为仅有巯基化低聚乙 二醇结合的金纳米颗粒(无任何DNA或肽结合体)，作为无修饰纳米颗粒在凝胶电泳中位置的参照组。图7中可明显见到，仅当酶样品中有Trypsin存在时，与SA-MP孵育后的反应体 系才会在凝胶中有条带出现(图7中(10和12))；当酶样品中有DNaseI存在时，凝胶中条 带的迁移位置显著前移(图7中(5、6和12))；而仅当Trypsin与DNaseI同时存在时，与 SA-MP孵育后的反应体系才会出现迁移位置显著前移的条带(图7中(12))。虽然本发明的上述书面描述能够使得本领域内的普通技术人员实施目前认为最 优的实施方式，但是本领域的普通技术人员将会理解和认识到，本文所述的具体实施方案、 方法和例子存在各种变型、组合以及等同方式。因此，本发明不应由上文所述的具体实施方 案、方法和例子限制，而是涵盖在本发明范围和精神范围内的所有实施方案和方法。
权利要求
一种用于制备有功能分子修饰的纳米颗粒的方法，该方法包括在适当条件下混合纳米颗粒、核苷酸和功能分子，以形成所述纳米颗粒和所述功能分子的结合物；其中该适当条件包括缓冲液、盐以及用于停止结合反应的阻化剂的使用；以及通过调节盐浓度和所述阻化剂的引入时间以实现对所述功能分子在纳米颗粒表面的结合密度的操控。
2.根据权利要求1所述的方法，该方法包括用核苷酸孵育纳米颗粒以形成核苷酸包被的纳米颗粒；调节结合反应体系中的缓冲液和盐的浓度，以达到稳定该结合反应体系PH且使盐浓 度适合所述结合密度的需要；在所述结合反应体系中加入所述功能分子以孵育所述核苷酸包被的纳米颗粒；在所述结合反应体系中加入所述阻化剂以停止所述功能分子与所述纳米颗粒的结合 过程。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在每个所述纳米颗粒上修饰有从一个到 几十个所述功能分子的范围内，无论低密度或高密度功能分子修饰的纳米颗粒都是在一个 小时内得到的。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述阻化剂为巯基化的低聚乙二醇。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于该功能分子为天然的或者合成的物质，其 结构中可任选地含有修饰成分。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于该功能分子是单一组分或是两种或两种以 上组分的混合物。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于该混合物是两种DNA的混合物或者是DNA 与肽的混合物。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于该功能分子是巯基化的分子。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于该巯基化的分子是巯基化的核酸或含有半 胱氨酸的肽。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于该核苷酸是单核苷酸或寡核苷酸。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于该核苷酸是RNA或DNA。
12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于该核苷酸是ATP或富含腺苷的寡核苷酸。
13.根据权利要求1所述的方法，其特征在于该核苷酸是单独一种核苷酸或是两种或 两种以上核苷酸的混合物。
14.根据权利要求1所述的方法，其特征在于该纳米颗粒是金属或者半导体纳米颗粒。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于该纳米颗粒是金纳米颗粒、银纳米颗粒、 或量子点。
16.根据权利要求1所述的方法，其特征在于该盐是氯化钠。
17.根据权利要求8所述的方法，其特征在于在调节所述盐浓度之前或者之后加入所 述巯基化的分子。
18.根据权利要求1所述的方法，其特征在于该盐浓度涵盖从OmM到IM的范围。
19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于该盐浓度是由所述功能分子的带电量和该功能分子在所述纳米颗粒表面的目标密度所决定的。
20.根据权利要求1所述的方法，其特征在于引入所述阻化剂前的孵育时间为从0分钟 到几个小时。
21.根据权利要求20所述的方法，其特征在于该孵育时间由所述功能分子的大小和该 功能分子在所述纳米颗粒表面的目标密度所决定。
22.一种用于操控功能分子在纳米颗粒表面的结合密度的方法，其特征在于该方法包括用核苷酸孵育纳米颗粒以形成核苷酸包被的纳米颗粒；调节结合反应体系中的缓冲液和盐的浓度，以达到稳定该结合反应体系PH且使盐浓 度适合一定的表面结合密度的需要；在所述结合反应体系中加入巯基化的功能分子以孵育所述核苷酸包被的纳米颗粒； 在所述结合反应体系中加入巯基化的低聚乙二醇以停止所述功能分子与所述纳米颗 粒的结合过程。
23.根据权利要求22所述的方法，其特征在于该盐浓度是由所述功能分子的带电量和 该功能分子在所述纳米颗粒表面的目标密度所决定的，并且所述盐浓度涵盖从OmM到IM的 范围。
24.根据权利要求22所述的方法，其特征在于该巯基化的功能分子的孵育时间是由所 述功能分子的大小和该功能分子在所述纳米颗粒表面的目标密度所决定的，并且该孵育时 间为从0分钟到几个小时。
全文摘要
本发明提供了一种在纳米颗粒表面控制功能分子密度的方法，其包括用核苷酸孵育纳米颗粒以形成核苷酸包被的纳米颗粒、调节反应体系的缓冲液和盐的浓度、用巯基化分子孵育核苷酸包被的纳米颗粒、引入巯基化低聚乙二醇以停止功能分子对纳米颗粒表面的修饰反应。本发明的方法简便、有效、廉价，可针对生物检测、分子诊断、纳米医药及纳米组装等各种应用而在较广的范围内快速调节功能分子的表面密度。
文档编号C09K11/02GK101993467SQ20101026426
公开日2011年3月30日 申请日期2010年8月20日 优先权日2009年8月24日
发明者赵文婷, 邢怡铭 申请人:香港科技大学