一种具有核壳结构的免疫磁性纳米上转换发光材料的复合制备方法与流程

本发明属于发光材料应用技术领域。

背景技术：

上转换荧光材料作为标记物在生物领域中已得到一定程度的应用，其独特的上转换发光特性使得生物检测技术具有稳定性好、灵敏度高、操作简便快速、可定性定量等优点。但这种传统的直接激发发射模式，使得检测过程必需依赖固相材料等手段实现未与检测物结合的游离标记物的彻底分离，否则任何残留的游离标记物均会成为假阳性信号的来源。专利200410034105.5，200410034104.0，200420049580.5对生物领域中上转换荧光材料应用方法已有充分的介绍。

免疫磁珠(Immunomagneticbeads，IMB)，是由载体微球和免疫配基结合而成的一种纳米级材料。免疫磁珠分离技术是以高均一性的磁性微球为固相支持物，将免疫配基(如抗体，抗原等)通过功能基团结合到磁性载体上形成免疫磁性微球，利用特异性的免疫学反应，在磁力作用下，发生力学移动，从混合溶液中分离出特异性的靶物质。具有分离速度快，效率高，可重复性好，操作简单，不需要昂贵的仪器设备。

本发明的一种具有核壳结构的免疫磁性纳米上转换发光材料，是一种发蓝光的红外上转换纳米材料与具有免疫性能的磁珠材料的复合结构，由近红外激光激发产生蓝色发光。在待检样品的溶液中加入具有核壳结构的免疫磁性纳米上转换发光材料，免疫配基(如抗体，抗原等)通过功能基团结合到磁性载体上形成免疫磁性微球，利用特异性的免疫学反应，在磁力作用下，发生力学移动，从混合溶液中分离检测靶物质，并通过红外荧光量子点加入，实现检测自我认证，逆向校验。在实际应用中无需后续的任何分离操作，只需将待检样品与复合材料混合即可实现简便快捷的定性定量检测。同时，在反应过程中可随时对可见光进行检测，以监测生物反应进行的速度与程度，满足应用研究与基础研究的不同需求。

技术实现要素：

一种具有核壳结构的免疫磁性纳米上转换发光材料的复合制备方法；它包括：发蓝光的红外上转换纳米材料与具有免疫性能的磁珠组成的核壳结构；上述材料表面分别使用溶胶-凝胶法修饰处理可在颗粒表面形成不同的基团，有利于共价结合不同的免疫配基(如酶、细胞、抗体、抗原、DNA、RNA) 等物活性物质；以红外上转换纳米材料为复合材料的核结构，以免疫磁珠为复合材料的壳层结构，以去离子水为分散液配置15%-30%的上转换纳米材料的溶液，然后加入1%-15%的免疫磁珠，在室温条件下通过化学水热反应合成具有核壳结构的免疫磁性纳米上转换发光材料，用于生物检测。

本发明中的发蓝光的红外上转换荧光材料制备方法为，含有Y、Gd、La的氟化物材料中的一种或一种以上混合物为基质材料，在基质材料中加入45-50%重量比的YbF₃，同时在基质材料中加入12-25%重量比TmF₃，均匀混合后，在氩气中于300-450度烧结1-6小时，制备出有蓝色发光的红外上转换荧光颗粒材料，其在980nm激光激发，可产生440-480nm蓝色发光，颗粒度在70-800nm。制备过程中氩气可以有效阻止材料被氧化，改善发光效率与控制色纯度；低温度可以抑制颗粒的生长。以3-氨丙基三甲氧基硅烷为表面硅烷化材料，以戊二醛为表面醛基化材料，在红外上转换纳米材料表面使用溶胶-凝胶法修饰处理，使材料表面经过硅烷化和醛基化处理后其表面适合连接不同的生物活性物质，有利于在颗粒表面链接其他不同基团有利于免疫磁珠颗粒在表面的吸附。

本发明中的具有免疫性能的磁珠材料制备方法是 ：以硫代乙醇为稳定剂，配置浓度为15%的稳定液然后在60⁰C下恒温搅拌，将Fe²⁺与Fe³⁺按2：3的摩尔比加入稳定液中，然后加入NaOH溶液调节反应体系为碱性，恒温搅拌反应1小时，制备黑色的四氧化三铁纳米磁性颗粒。以油酸为表面羧基化原料，以高锰酸钾催化剂，使用溶胶-凝胶法修饰处理具有免疫性能的磁珠材料表面，在合成的纳米磁珠表面进行羧基化处理后可在颗粒表面形成羧基，可共价结合不同的免疫配基(如酶、细胞、抗体、抗原、DNA、RNA) 等物活性物质，可用于生物检测。量子点荧光材料颗粒通常为1-10纳米，其可以在磁珠材料制备阶段加入，或者在磁珠材料与上转换发光材料成壳阶段加入混合。

本发明中的发蓝光的红外上转换纳米材料与具有免疫性能的磁珠组成的核壳结构材料表面加入硫化铅红外荧光量子点，硫化铅红外荧光量子点吸收可见光，发射近红外光，并被上转换纳米材料吸收。或者由可见光激发，由上转换发光材料发射出另一波段可见光。本发明实现了可见光、红外光相互激发转换，使得用于生物多样性检测时更加准确快捷唯一，并达到试剂检测自我认证，逆向校验，并可以在混合中被磁珠分离。

具体实施方式

本发明中的发蓝光的红外上转换荧光材料制备方法为：含有Y、Gd、La的氟化物材料中的一种或一种以上混合物是基质材料，在基质材料中加入45-50%重量比的YbF₃，同时加入12-25%重量比TmF₃，在氩气中于300-450度烧结1-6小时，制备出蓝色发光的红外上转换荧光微颗粒材料，其由980nm激光激发，可发出440-480nm蓝色发光，颗粒在70-800nm。当烧结温度低于350度，时间低于2小时，可以制备出直径平均在100 nm以下的颗粒，其发光强度较弱；当烧结温度大于400度，时间大于4小时，材料成为块状，经粉碎后可以制备出直径平均在700 nm以上的颗粒，其发光强度较强；烧结过程应在氩气保护气氛中进行，制备过程中氩气可以有效阻止材料被氧化，改善发光效率与控制色纯度；低温度可以抑制颗粒的生长。

本发明中的具有免疫性能的磁珠材料制备方法是 ：以硫代乙醇为稳定剂，配置浓度为15%的稳定液然后在60⁰C下恒温搅拌，将Fe²⁺与Fe³⁺按2：3的摩尔比加入稳定液中，然后加入NaOH溶液调节反应体系为碱性，室温下恒温搅拌反应1小时，制备出粒度在30nm—50nm的黑色的四氧化三铁纳米磁性颗粒。

本发明中的红外上转换纳米材料表面使用溶胶-凝胶法修饰处理，以乙二醇为分散剂，配制成30%的的上转换纳米材料分散体系，然后加入1%-3%的3-氨丙基三甲氧基硅烷为表面硅烷化材料，在氮气的保护下在60⁰C下恒温搅拌反应10小时，反应完成后用无水乙醇清洗至中性，然后加入0.5%——1%的戊二醛为表面醛基化材料，通氮气保护，在室温下搅拌反应6小时，然后用去离子水洗至中性，在室温下晾干备用；使材料表面经过硅烷化和醛基化处理后其表面适合连接不同的生物活性物质，有利于在颗粒表面链接其他不同基团有利于免疫磁珠颗粒在表面的吸附。

本发明中的具有免疫性能的磁珠材料表面使用溶胶-凝胶法修饰处理，以去离子水为分散剂，配制成10%—25%的分散体系，然后加入2%—4%的油酸为表面羧基化原料，在70⁰C下持续搅拌1小时，然后用无水乙醇清洗2遍以清洗多余的油酸，最后用去离子水洗涤至中性，最后加入0.5%的高锰酸钾催化剂，在超声清洗仪中超声震荡8小时，完成后水洗3遍，然后在室温下自然晾干。在合成的纳米磁珠表面进行羧基化处理后可在颗粒表面形成羧基，可共价结合不同的免疫配基(如酶、细胞、抗体、抗原、DNA、RNA) 等物活性物质，可用于生物检测。

本发明中的上述材料表面分别使用溶胶-凝胶法修饰处理可在颗粒表面形成不同的基团，有利于共价结合不同的免疫配基(如酶、细胞、抗体、抗原、DNA、RNA) 等物活性物质；以红外上转换纳米材料为复合材料的核结构，以免疫磁珠为复合材料的壳层结构，以去离子水为分散液配置15%-30%的上转换纳米材料的溶液，然后加入1%-15%的免疫磁珠，在室温条件下通过化学水热反应合成具有核壳结构的免疫磁性纳米上转换发光材料，用于生物检测。

本发明中的硫化铅红外荧光量子点使用水热法制备，颗粒度2-10纳米，发射光900-1500纳米，吸收光紫外与可见光，发射出大于吸收光的近红外光，并被上转换纳米材料吸收。或者由可见光激发，由上转换发光材料发射出另一波段可见光。本发明实现了可见光、红外光相互激发转换，使得用于生物多样性检测时更加准确快捷唯一，并达到试剂检测自我认证，逆向校验。如使用绿光激发红外量子点材料，其发射出900-1000纳米红外光，并被发蓝光的红外上转换纳米材料吸收，发射出蓝光，则形成绿光、红外光、蓝光相互转换。

本发明优点

利用特异性的免疫学反应，在磁力作用下，发生力学移动，从混合溶液中分离检测靶物质。简化了现场检测的操作流程，并缩短的检测时间。

在实际应用中无需后续的任何分离操作，只需将待检样品与复合材料混合即可实现简便快捷的定性定量检测。同时，在反应过程中可随时对可见光进行检测，以监测生物反应进行的速度与程度。

生产简单，容易批量生产，产业化。

具体实施例

实施例1

制备发蓝光的红外上转换荧光材料：取YF₃90g，GdF₃10g，加入YbF₃45g，TmF₃13g，在氩气保护中于400⁰C烧结2小时，制备出的红外上转换荧光材料在980nm激光激发，可发出450nm蓝色发光，颗粒在100nm。

取出以上红外上转换荧光材料30g加入三口烧瓶内，然后加入100ml乙二醇搅拌分散均匀，然后加入0.5g的3-氨丙基三甲氧基硅烷为表面硅烷化材料，在氮气的保护下在60⁰C下恒温搅拌反应10小时，反应完成后用无水乙醇清洗至中性，然后用去离子水稀释至100ml，然后加入0.2g的戊二醛为表面醛基化材料，通氮气保护，在室温下搅拌反应6小时，然后用去离子水洗至中性，在室温下晾干备用，得到表面醛基化的上转换纳米材料。

制备具有免疫性能的磁珠的制备：取15g硫代乙醇然后加入100ml去离子水，在烧杯中配制成稳定液，然后分别加入0.8mol/L的Fe³⁺溶液90ml和0.8mol/L的Fe²⁺溶液60ml，搅拌30min，混合均匀；最后加入1mol/L的NaOH溶液300ml，在室温下搅拌反应1小时，最后用去离子水清洗至中性，得到30nm的磁珠颗粒。

取制得的磁珠颗粒15g，然后加入100ml离子水配制成分散体溶液，然后缓慢加入0.5g的油酸，在70⁰C下持续搅拌1小时，然后用无水乙醇清洗2遍以清洗多余的油酸，最后用去离子水洗涤至中性，然后用去离子水配制成100ml的溶液，最后加入0.1g的高锰酸钾，在超声清洗仪中超声震荡8小时，超声完成后水洗3遍，然后在室温下自然晾干，得到表面羧基化的纳米磁珠颗粒。

制备核壳结构的免疫磁性纳米上转换材料：首先取30g表面醛基化的上转换纳米材料，然后加入150ml去离子水配制成分散体系，然后加入3.0g表面羧基化的纳米磁珠颗粒，在室温条件下通过化学水热反应合成具有核壳结构的免疫磁性纳米上转换发光材料。然后在用去离子水清洗至中性，最后在0⁰C—10⁰C下冷藏保存。

实施例2

制备发蓝光的红外上转换荧光材料：取YF₃ 100克，加入YbF₃ 50克， TmF₃ 20克，在氩气中于450度烧结5小时，制备出的红外上转换荧光材料研磨分碎， 在980nm激光激发下，可产生470nm蓝色发光，颗粒在800nm。

取出以上红外上转换荧光材料15g加入三口烧瓶内，然后加入100ml乙二醇搅拌分散均匀，然后加入0.2g的3-氨丙基三甲氧基硅烷为表面硅烷化材料，在氮气的保护下在60⁰C下恒温搅拌反应10小时，反应完成后用无水乙醇清洗至中性，然后用去离子水稀释至100ml，然后加入0.15g的戊二醛为表面醛基化材料，通氮气保护，在室温下搅拌反应6小时，然后用去离子水洗至中性，在室温下晾干备用，得到表面醛基化的上转换纳米材料。

制备具有免疫性能的磁珠的制备：取30g硫代乙醇然后加入200ml去离子水，在烧杯中配制成稳定液，然后分别加入0.8mol/L的Fe³⁺溶液150ml和0.8mol/L的Fe²⁺溶液100ml，搅拌30min，混合均匀；最后加入1mol/L的NaOH溶液500ml，在室温下搅拌反应2小时，最后用去离子水清洗至中性，得到50nm的磁珠颗粒。

取制得的磁珠颗粒30g，然后加入200ml离子水配制成分散体溶液，然后缓慢加入1.2g的油酸，在70⁰C下持续搅拌2小时，然后用无水乙醇清洗2遍以清洗多余的油酸，最后用去离子水洗涤至中性，然后用去离子水配制成200ml的溶液，最后加入0.3g的高锰酸钾，在超声清洗仪中超声震荡10小时，超声完成后水洗3遍，然后在室温下自然晾干，得到表面羧基化的纳米磁珠颗粒。

制备核壳结构的免疫磁性纳米上转换材料：首先取50g表面醛基化的上转换纳米材料，然后加入150ml去离子水配制成分散体系，然后加入6.0g表面羧基化的纳米磁珠颗粒，在室温条件下通过化学水热反应合成具有核壳结构的免疫磁性纳米上转换发光材料。然后在用去离子水清洗至中性，最后在0⁰C—10⁰C下冷藏保存。

在上面针对本发明较好的实施方式作了举例说明后，对本领域的技术人员来说应明白的是，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，对本发明所作的任何改变和改进都在本发明的范围内。