含萘酰亚胺的小分子作为荧光探针在RNA检测和成像方面的应用的制作方法

本发明属于荧光探针技术领域，具体涉及一种含萘酰亚胺的荧光探针在rna检测和成像方面的应用。该探针在磷酸缓冲液和细胞中均可排除dna干扰选择性识别rna；在活细胞中，化合物可以快速穿过细胞膜和核膜实现对细胞质和细胞核内所有rna的荧光成像。

背景技术

rna是以dna的一条链为模版，以碱基互补配对为原则，转录而形成的一条单链，主要功能是实现遗传信息在蛋白质上的表达，是遗传信息向表达转化的桥梁，另外rna也参与细胞内化学反应的调节与催化。rna表达量的变化与表达位置的改变是生物体发生代谢异常的重要标志。因此在活细胞内成像rna不仅有助于了解生命活动的本质而且可提高疾病检测的准确性。

目前，成像细胞内源性rna的探针主要可以分为四类：(1)荧光标记的原位杂交探针（fish），是带有荧光团标记的一段核酸序列，其序列与靶向rna的不同部分互补。它们是一种发展成熟的成像技术，但是该方法背景较高，且只能在固定细胞中成像。(2)分子信标（mbs），分子信标在未识别rna时，不具有荧光；结合rna后，荧光恢复。它们解决了原位杂交探针背景信号高的问题，但是该类材料很难进入活细胞。(3)纳米分子信标，是指加载纳米颗粒的分子信标。纳米颗粒同时作为淬灭剂和载体可降低合成成本。(4)小分子荧光探针，有机小分子类化合物。其优点是合成简单，荧光光谱性质可调，具有很大的发展潜力。

现存的小分子rna荧光探针主要包括菁类染料和有机金属配合物两大类。在成像活细胞内rna时，普遍存在两个问题：（1）选择性不高，尤其是针对与rna结构类似的dna来说。很难找到一类荧光探针能很好的区分两者；（2）透膜性较差，即这些探针很难穿过细胞膜和核膜进行快速rna成像，在成像时需要较长的培养时间，这就限制了对rna动力学的追踪。同时菁类染料由于其本身的结构特点，存在斯托克位移较小和易光漂白等特点。有机金属配合物因为本身带有正电荷的结构特点，很难区分带负电的rna和dna。因此发展其他类别的有机小分子rna探针是非常需要的。

萘酰亚胺类化合物由于光稳定性好，斯托克位移较大，一直是一类不错的荧光探针。但现存的萘酰亚胺类化合物还没有对rna响应的报道。我们发现了一类rna荧光探针，这一探针可以与rna有荧光增强的响应，而与dna的响应较弱。同时，这一探针可快速进入活细胞，实现对细胞内rna的荧光成像。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种含萘酰亚胺的小分子化合物，作为荧光探针在rna检测和成像方面的应用。

本发明涉及的含萘酰亚胺的小分子化合物，以萘酰亚胺为荧光母体，其4位进行胺基修饰，萘酰亚胺母体上的氮原子与游离的氨基化合物共价连接；其结构式为：

分子通式为：[r1r2n-c12no2-r3-nh2]；式中，r1，r2,r3为含1-8个碳的烷基链、卤素取代的烷基链或者醚氧链。

实验表明，所述含萘酰亚胺的小分子化合物，与rna结合有荧光增强的响应，但在相同条件下对dna的响应很弱，表明其在溶液状态具有很好的选择性，可作为分辨rna与dna的探针，在溶液状态下和活体细胞中排除dna干扰选择性识别rna。

实验表明，所述含萘酰亚胺的小分子化合物，在活细胞中，能够在两分钟内快速穿过活体细胞的细胞膜和核膜，实现对细胞质和细胞核内rna的荧光成像，并具有良好的生物兼容性。

首先，考察该小分子化合物在磷酸缓冲液中与贝克酵母菌rna滴定的荧光光谱，见图1。发现该化合物随着贝克酵母菌rna的加入，荧光强度有持续性增强，最终增强至原来的34倍，同时最大发射波长由545纳米蓝移至532纳米，说明此化合物对rna有荧光增强的响应，且最大发射波长蓝移。图2为相同条件下，该化合物与dna的荧光滴定光谱，图2显示荧光强度随着小牛胸腺dna的加入也有增强，但是最终只有5倍左右的增加，并且最大发射波长没有随dna的加入而发生位移。综合图1和图2说明：相对于dna，该化合物对rna具有更好的荧光响应特性，最大发射波长的不同表明，化合物与dna和rna以不同的结合方式相互作用。

然后，进行活细胞成像试验，参见图3。试验表明：该化合物在30秒内就可以穿过细胞膜和核孔，实现对核仁的染色，且核仁荧光在60秒内达到饱和，随着时间的推移，细胞质内点状的荧光逐渐增强，并且在120秒内达到饱和。这一实验说明，此化合物是一种快速成像的探针。

图4为rna酶验证探针在细胞内的选择性试验结果。图4上显示与rna酶共培养的细胞，细胞的整体荧光强度有更明显的降低；而与dna酶共培养的细胞，荧光强度降低较小。图4下显示rna活细胞商用探针syto与此探针具有相同的倾向性。这一结果可说明，探针更容易被rna酶降解。syto是商用的rna探针，在细胞中对rna的选择性较高。本发明的探针也在细胞中具有相似的选择性。

图5为用mtt法测试探针在宫颈癌细胞中的细胞毒性试验结果。细胞在实验浓度内与宫颈癌细胞共孵育6小时，细胞的存活率都在90%以上。这说明探针对宫颈癌细胞基本没有毒性，证实了探针的生物兼容性。

本发明的优点是：该小分子化合物具有rna特异响应的优势，能够区分rna和dna。探针在磷酸缓冲液中，可以选择性与rna响应，荧光增强至原来的34倍，而相同条件下对dna只有5倍的增强，可区分溶液中的rna和dna。在活细胞成像研究中，此探针可在2分钟内快速进入活细胞，实现活细胞内rna快速荧光成像。rna酶降解实验验证了探针不但在水溶液中具有较好的选择性，在细胞成像的时候依然具有较好的选择性。同时，此探针对hela细胞具有较高的细胞存活率，展示了此探针的生物兼容性。

附图说明

图1为探针分子c对rna的荧光滴定光谱。荧光光谱的激发波长为450nm，发射波长的收集范围为470至650nm，探针的浓度为10μm，测试条件为ph7.2的20mm磷酸缓冲液，rna的浓度以平均分子量25000道尔顿计量。

图2为探针分子c对rna的选择性。展示了探针在相同条件下与dna的荧光滴定光谱。荧光光谱的激发波长为450nm，发射波长的收集范围为470至650nm，探针c的浓度为10μm，测试条件为ph7.2的20mm磷酸缓冲液，dna的浓度以平均分子量25000道尔顿计量。

图3为探针c在hela细胞内的活细胞成像。探针浓度为5μm，加dmem高糖培养基溶解后与hela细胞在37℃共培养。选用488nm的激光器，收集波段为515至565nm。照片为加探针与hela细胞共培养0秒，30秒，60秒，90秒，120秒的荧光照片和明场照片。

图4为rna酶降解实验。将hela细胞铺于6孔板，加5μm探针c共培养5分钟后，用冰甲醇固定细胞，分别用rna酶或dna酶与细胞共培养4小时。分别拍摄未处理，加dna酶处理，加rna酶处理的荧光照片。选用488nm的激光器，收集波段为515至565nm。

图5为用mtt法测试探针分子c在宫颈癌细胞中的细胞毒性。分别验证了探针浓度为0，1，2.5，5，7.5，10，15，20和30μm与hela细胞共孵育6小时的细胞存活率。

图6为探针分子d（r1=r2=ch3，r3=ch2ch2ch2ch2ch2ch2）对rna的荧光滴定光谱。荧光光谱的激发波长为450nm，发射波长的收集范围为470至700nm，探针的浓度为10μm，测试条件为ph7.2的20mm磷酸缓冲液，rna的浓度以质量单位μg/ml计。

图7为探针分子d对rna的选择性。展示了探针d在相同条件下与rna或者dna滴定的荧光改变倍数。荧光光谱的激发波长为450nm，发射波长的收集范围为470至650nm，探针d的浓度为10μm，测试条件为ph7.2的20mm磷酸缓冲液。

图8为探针d在hela细胞内的活细胞成像。探针浓度为5μm，加dmem高糖培养基溶解后与hela细胞在37℃共培养。选用488nm的激光器，收集波段为515至565nm。照片为加探针d与hela细胞共培养5分钟后的荧光照片（左），明场照片（中）和荧光与明场叠加的照片（右）。

图9为用mtt法测试探针d在宫颈癌细胞中的细胞毒性。分别验证了探针浓度为0，1，2.5，5，7.5，10，15，20和30μm与hela细胞共孵育6小时的细胞存活率。

图10为探针分子e（r1=r2=ch3，r3=ch2ch2ch2ch2ch2ch2）对rna的荧光滴定光谱。荧光光谱的激发波长为450nm，发射波长的收集范围为470至700nm，探针的浓度为10μm，测试条件为ph7.2的20mm磷酸缓冲液，rna的浓度以质量单位μg/ml计。

图11为探针分子e对rna的选择性。展示了探针e在相同条件下与rna或者dna滴定的荧光改变倍数。荧光光谱的激发波长为450nm，发射波长的收集范围为470至650nm，探针e的浓度为10μm，测试条件为ph7.2的20mm磷酸缓冲液。

图12为探针e在hela细胞内的活细胞成像。探针e浓度为5μm，加dmem高糖培养基溶解后与hela细胞在37℃共培养。选用488nm的激光器，收集波段为515至565nm。照片为加探针e与hela细胞共培养5分钟后的荧光照片（左），明场照片（中）和荧光与明场叠加的照片（右）。

图13为用mtt法测试探针e在宫颈癌细胞中的细胞毒性。分别验证了探针浓度为0，1，2.5，5，7.5，10，15，20和30μm与hela细胞共孵育6小时的细胞存活率。

具体实施方式

下面通过实例对本发明做进一步的说明。

实施例1：含萘酰亚胺的小分子化合物，其中，r1=r2=ch3，r3=ch2ch2，记为探针分子c。考察其在溶液中对rna的响应。

探针分子c用20mm的磷酸缓冲液溶解至10μm，逐渐滴加贝克酵母菌rna溶液，观察荧光光谱随rna滴加后的改变。实验时，荧光光谱的激发波长为450nm，发射波长的收集范围为470至650nm。

实施例2：探针分子c在溶液中对rna的选择性

探针分子c用20mm的磷酸缓冲液溶解至10μm，逐渐滴加小牛胸腺dna溶液，观察荧光光谱随dna逐渐滴加后的改变。测试时，荧光光谱的激发波长为450nm，发射波长的收集范围为470至650nm。

实施例3：探针分子c在hela活细胞的细胞成像

hela细胞接种于6孔板，过夜培养，使其完全贴壁。用无血清的dmem高糖培养基溶解探针配置最终浓度为5µm的溶液，然后加入6孔板与hela细胞在37度共培养，用激光共聚焦显微镜观察探针分子c对hela细胞在不同时间的染色情况。实验时，选用488nm的激光器。收集的波段为515-565nm。

实施例4：rna酶降解实验验证探针分子c在细胞中的选择性

rna酶是能够特异降解rna而不降解dna的蛋白酶，相反dna酶只能降解dna而不能降解rna。本实验中，我们首先将hela细胞接种于6孔板，培养过夜，致使细胞完全贴壁。然后将2ml冰甲醇加入6孔板共孵育5分钟，使细胞固定。再将探针5µm或syto1µm分别加入不同的孔培养。激光共聚焦拍摄染色荧光探针和syto的细胞。然后用无血清培养基将rna酶或dna酶稀释到100µg/ml，分别加入不同的6孔板内，在37度培养箱内孵育4小时。再次激光共聚焦拍摄经rna酶降解与dna酶降解后的荧光成像照片。结果证明：我们的荧光探针与商用的rna活细胞染料syto有类似的现象。即hela细胞内的荧光信号经过rna酶孵育后，比经过dna酶孵育有更明显的荧光降低。这证明两种探针在细胞中都具有较好的选择性。

实施例5：探针分子c在宫颈癌细胞中的细胞毒性

用mtt法测试探针分子c与hela细胞共孵育中6小时的细胞毒性。分别测试了探针浓度为0，1，2.5，5，7.5，10，15，20和30μm的细胞存活率。

实施例6：含萘酰亚胺的小分子化合物，其中，r1=r2=ch3，r3=ch2ch2ch2ch2ch2ch2，记为探针分子d。考察其在溶液中对rna的响应。

探针分子d用20mm的磷酸缓冲液溶解至10μm，逐渐滴加贝克酵母菌rna溶液，观察荧光光谱随rna滴加后的改变。实验时，荧光光谱的激发波长为450nm，发射波长的收集范围为470至650nm。

实施例7：探针分子d在溶液中对rna的选择性

探针分子d用20mm的磷酸缓冲液溶解至10μm，逐渐滴加小牛胸腺dna溶液，观察荧光光谱随dna逐渐滴加后的改变。测试时，荧光光谱的激发波长为450nm，发射波长的收集范围为470至650nm。

实施例8：探针分子d在hela活细胞的细胞成像

hela细胞接种于6孔板，过夜培养，使其完全贴壁。用无血清的dmem高糖培养基溶解探针配置最终浓度为5µm的溶液，然后加入6孔板与hela细胞在37度共培养，用激光共聚焦显微镜观察探针分子d对hela细胞在5分钟后的染色情况。实验时，选用488nm的激光器。收集的波段为515-565nm。

实施例9：探针分子d在宫颈癌细胞中的细胞毒性

用mtt法测试探针分子d与hela细胞共孵育中6小时的细胞毒性。分别测试了探针浓度为0，1，2.5，5，7.5，10，15，20和30μm的细胞存活率。

实施例10：含萘酰亚胺的小分子化合物，其中，r1=r2=ch2ch3，r3=ch2ch2，记为探针分子e。考察其在溶液中对rna的响应。

探针分子e用20mm的磷酸缓冲液溶解至10μm，逐渐滴加贝克酵母菌rna溶液，观察荧光光谱随rna滴加后的改变。实验时，荧光光谱的激发波长为450nm，发射波长的收集范围为470至650nm。

实施例11：探针分子e在溶液中对rna的选择性

探针分子e用20mm的磷酸缓冲液溶解至10μm，逐渐滴加小牛胸腺dna溶液，观察荧光光谱随dna逐渐滴加后的改变。测试时，荧光光谱的激发波长为450nm，发射波长的收集范围为470至650nm。

实施例12：探针分子e在hela活细胞的细胞成像

hela细胞接种于6孔板，过夜培养，使其完全贴壁。用无血清的dmem高糖培养基溶解探针配置最终浓度为5µm的溶液，然后加入6孔板与hela细胞在37度共培养，用激光共聚焦显微镜观察探针分子e对hela细胞在5分钟后的染色情况。实验时，选用488nm的激光器。收集的波段为515-565nm。

实施例13：探针分子e在宫颈癌细胞中的细胞毒性

用mtt法测试探针分子e与hela细胞共孵育中6小时的细胞毒性。分别测试了探针e浓度为0，1，2.5，5，7.5，10，15，20和30μm的细胞存活率。

由实施例合成出的荧光探针具有rna特异响应性。探针在磷酸缓冲液中，可以选择性与rna响应。但在相同条件下对dna仅有较低的荧光增强。并且这一探针可在2分钟内快速穿过细胞膜和核孔染色细胞核仁和细胞质内rna，实现对活细胞内rna的快速荧光成像，rna酶降解实验验证这一探针在细胞内有选择性染色rna的特点。同时，这一荧光探针具有较好的生物兼容性。

上述实施例为本发明的优选例，并不用来限制本发明，凡在本发明的原则之内，所做的任何修改、变化、变通或替换方案，均在本发明的保护范围之内。