使用特定的蒽醌染料配体结构来纯化抗体、抗体片段或其工程变体的方法

使用特定的蒽醌染料配体结构来纯化抗体、抗体片段或其工程变体的方法
【专利摘要】本发明涉及适用于分离或纯化抗体、抗体片段或其工程变体的方法的新的吸附剂，其包含蒽醌染料配体；涉及对应的纯化方法；以及对应的分析型或制备型分离试剂盒。
【专利说明】使用特定的蒽醌染料配体结构来纯化抗体、抗体片段或其工 程变体的方法
[0001] 本发明涉及适用于分离或纯化抗体、抗体片段或其工程变体的方法的新的吸附 剂，其包含蒽醌染料配体;涉及对应的纯化方法；以及对应的分析或制备型分离试剂盒。
[0002] 发明背景:
[0003] 活性染料是公知的产品，其广泛应用于纤维纺织品例如棉花或纤维胶染色的纺织 工业。所述活性染料的分子被看作是由两个互相连接的单元组成，各单元具有不同的功能。 一个单元是生色团，其功能是向纺织品提供所需的颜色和其它染色特性。另一个单元是纤 维反应性基团，其在公认的应用条件下与纤维素进行化学反应，将染料分子与纺织品共价 结合，以产生对洗涤过程抵抗力高的染色物质。
[0004] 尽管最初开发活性染料是为了解决在纤维纺织品材料染色和印刷中遇到的某些 问题，但经过多年后还发现它们具有使其能够用于纺织品染色领域以外的性质。
[0005] 已知例如从美国专利号4,016,149和4,546,161中，这些染料可以通过类似的技术 与碳水化合物底物连接，所述底物例如来自琼脂糖、葡萄糖、葡聚糖等的聚合物和共聚物。 所述碳水化合物底物与某些市场可获得的活性染料的反应产物已经用作某些蛋白质类物 质的色谱分离或纯化的吸附剂。在市售的纺织品染料中，已经用作蛋白质或酶分离的配体 的是某些包含单氯三嗪部分的蓝色蒽醌染料，例如C.I.活性蓝2(Cibacron Blue 3GA)、 C. I.活性蓝5和C. I.活性蓝49。一般而言，这些吸附剂包含不止一个官能团，例如疏水性和 离子的或亲水性的相互作用，通常称为混合式层析(MMC)吸附剂。与利用蛋白质和配体的一 种确定的相互作用模式的离子交换（IEX)或疏水性相互作用(HIC)的色谱(分别利用蛋白质 的电荷和疏水性)相反，蛋白质与混合型配体的相互作用是一种复杂的多因素相互作用，取 决于在给定的pH和溶剂和配体的官能团结构排列的条件下蛋白质的电荷和疏水性分布。
[0006] 亲和色谱是基于蛋白质或酶类对于吸附剂的固定相上配体的不同强度的亲和性， 且日益证实了在例如生物药剂学和诊断学的高端应用领域中非常关键，例如W0 2004/ 052870中所述。该相互作用的本质是氢键合、静电力、由于有利的几何学而堆叠或者促进配 体-靶点关系的任何其它方面。配体-靶点相互作用应当足够强以允许从混合物中除去其它 污染物分子，同时保持配体-靶点复合物完整，即，与配体具有亲和性的蛋白质结合在基质 上，而其它无亲和性的物质被洗掉。结合的蛋白质可以选择性地在不同pH、离子强度和缓冲 剂条件下洗脱，例如P.D.G.Dean，W.S.Johnson和F.A.Middle(编辑），Affinity Chromatography:A Practical Approach，1982中所述。蛋白质混合物可以经振摇或通过吸 附剂柱进行分离。
[0007] 免疫球蛋白类是包含至少一个具有两个相同轻链(~25kDa分子量)和两个相同的 重链(~50kDa分子量)的Y形结构单元的糖蛋白类。每个链都是由可以划分为独立结构域的 恒定区和可变区组成。在高等哺乳动物中观察到免疫球蛋白的五个不同分类(对应于特定 的重链同种型α(IgA)、δ(IgD)、 ε(IgE)、μ(IgM)和γ(IgG))。这些分子的大小、电荷、生物特 性、氨基酸组成和碳水化合物含量不同。轻链可以以两种同种型(称为κ和λ)之一存在。
[0008] 免疫球蛋白在诊断或治疗领域或者制备型及分析型应用中的可用性是公认的。与 多克隆抗体相反，单克隆抗体(Mab)是具有针对单一抗原的相同特异性的抗体，且构成生物 药剂学工业中发展最迅速的领域。除了特异性单克隆抗体作为生物药的使用以外，对于源 自其的不同类型的抗体片段或工程蛋白变体的兴趣也日益增加，因为它们在化学和功能方 面可能与多克隆免疫球蛋白制品或单克隆抗体不同。
[0009] 片段抗体(fAb)包括从完整的、特别是单克隆抗体获得的片段，该片段保留了抗原 结合特性，同时避免了与完整的整个免疫球蛋白分子相关的缺点。具体而言，所述片段提供 了超越完整蛋白的在成像和治疗中的优点。由于没有Fc(重链)区域或者被患者免疫系统识 别为异物的分子部分，它们在患者中具有更少的副作用，且可以对它们进行修饰以包含治 疗性有效荷载。有几种类型的抗体片段。它们是由特定的内肽酶消化制备的或者经基因工 程操作并由对应的重组宿主细胞产生的免疫球蛋白片段。它们可能具有一个或多个、相同 或不同的抗原结合位点。fAb包括例如单价片段例如Fab'、Fab和scFv ;二价片段，例如F (ab'）2双特异抗体和微小抗体(minibodies);以及多价片段例如三特异性抗体、四特异性 抗体以及串联双抗体(TandAbs)。
[0010] 制备fAb的最重要的方法是通过重组技术。该技术使用宿主细胞表达所需fAb，随 后将其从生产介质中分离并纯化。纯化一般经色谱完成，且通常是个复杂、多步骤的过程。 该复杂性不可避免地限制了可获得的fAb的产率，并显著地减慢了生产过程。
[0011]许多完整的抗体是通过使用蛋白质A亲和色谱进行纯化。但是，认为蛋白质A具有 许多缺点，包括弱稳定性、变性、高成本和由于蛋白质A自身是生物物质的事实而引起监管 部门的关注。因此，已经开发了合成的亲和配体作为具有蛋白质A亲和性的抗体纯化的替代 物。fAb不是经蛋白质A亲和色谱纯化，因为fAb不具有对蛋白质A的亲和性，因此不能结合。
[0012] 本
【申请人】的W0 2006/108760描述了蒽醌染料配体及其用于分离生物物质的用途， 选自肽类、多肽、蛋白质、核苷酸、多核苷酸类、核酸类、留类、脂类、激素类，并且特别是酶 类、蛋白质和肽类。
[0013] 用于免疫球蛋白分子的亲和纯化的基于三嗪的染料在WO 97/10887、W0 2004/ 035199和W0 2007/099374中所公开。
[0014] W0 2007/004954提出了用于IgG及其片段亲和纯化的染料的某些[1，2,4]_三唑并 [1，5-A]嘧啶衍生物。
[0015] W0 2009/138714也提出了用于纯化fAb的某些三嗪染料的用途。
[0016] W0 2010/102114描述了用于纯化fAb的与有机聚合物组合的蓝色染料吸附剂的用 途。
[0017] 虽然已经建议用于分离抗体、抗体片段或其工程变体的方法，但是仍然存在相关 的缺点，因此需要用于抗体例如fAb分离的改良方法。此外，对于应用在药物纯化过程而言， 高特异性的结合能力是不可或缺的。
[0018] 发明简述
[0019] 发明人检测了多种蒽醌染料(蓝色-染料)配体作为吸附剂，其用于抗体、抗体片段 及其变体的改良的分离与纯化。令人惊讶地是，仅有包含如下文所定义的蒽醌染料衍生物 的蒽醌染料衍生物(与载体物质连接）的亚群提供了分离和纯化来自免疫球蛋白分子的片 段的改良方法。
[0020] 附图简述
[0021] 图1说明了 a)分析型尺寸排阻色谱法(SEC)的结果和b)用IgG单体及由其制备的聚 集物(如实验部分所述通过热处理制备)进行的SDS-PAGE。
[0022] 图2说明了（a)现有技术的树脂BiueSepharose ?在分离人多克隆IgG抗体聚集 物(Mu)和单体(Mo)的试验中所观察到的色谱分离曲线，以及色谱分离的汇集流分A和B的 (b)SDS-PAGE和(c)SEC的结果。(mAU =在280nm的毫吸收单位;CV =柱体积）。
[0023]图3说明了观察到的在分离人多克隆IgG抗体聚集物(Mu)和单体(Mo)的试验中本 发明的BASF树脂BR36、BR37、BR45、BR46和BR47的色谱分离曲线。
[0024]图4说明了如图2a和图3所述的每种色谱分离的单个流分的SDS-PAGE结果。
[0025] 图5说明了通过分析型尺寸排阻色谱的图3的汇集物A和B(来自色谱分离）的分析 结果。
[0026] 图6说明了通过SDS PAGE的图3的汇集物A和B(来自色谱分离)的分析结果。
[0027] 详细描述
[0028] a)具体实施方案：
[0029]本发明涉及以下具体实施方案：
[0030] 1.用于免疫球蛋白分子的色谱分离的吸附剂，该吸附剂包含与染料配体共价连接 的载体基质（或载体），其中所述染料配体是选自蒽醌染料，且其中所述吸附剂的配体密度 是超过 150,例如 151-500或 160-500 或 170-400或 200-350 或 180-350或 190-330 或 220-330或 250-300ymol/g干燥的吸附剂，其中优选在160-500ymol/g干燥的吸附剂的配体密度，更加 优选在170-400μηιο 1 /g干燥的吸附剂的配体密度，最优选190-330μηιο 1 /g干燥的吸附剂的配 体密度。
[0031] 2.实施方案1的吸附剂，其中所述吸附剂包括所述载体基质（例如化学活化的；特 别是以现有技术本身已知的方式化学活化，例如试验部分中所述)和通式1的蒽醌化合物的 反应产物
[0033] 其中
[0034] X是卤素，特别是F、C1或Br;经该基团与载体通过化学反应形成所述共价连接；
[0035] k和m各自互相独立地是0或1，且k+m之和是1或2;特别是k是0且m是1;
[0036] B是芳香基团，其包含一个或多个稠合或非稠合的、特别是一个、任选的单-或多取 代的芳香环；
[0037] V是下式的取代基
[0042] 其中
[0043] η各自是0或1;条件是两个η不同时是0;
[0044] R是相同或不同的，选自Η、烷基、ΝΗ2、ΝΗ-烷基、ΝΗ-芳基、Ν(烷基)2、勵2、0!1、0-烷基、 CN、C(0)烷基、C(0)芳基、C(0)NH2、C(0)N(H)烷基、C(0)N(烷基)2、C(0)N(H)芳基、或卤素； [0045]特别地，R是氢;在任何上述含义中的烷基特别是&-C4烷基;且芳基特别是苯基； [0046] Ri是氢或任选被取代的C1-C4烷基，特别是Ri是氢；
[0047] Z选自化学键，
[0048] -(CH2)nl_，nl 是 1-4 的整数，
[0049] 亚芳基、
[0050] -CH2-亚芳基 _、
[0051] -S02-亚芳基 _、
[0052] -C(0)N(H)亚芳基 _、
[0053] -S02N(H)亚芳基 _、
[0054] -CH=CH_、
[0055] -S02_CH2_CH2_；
[0056] -C(0)NH-(CH2)n2-，n2 是 1-4 的整数；
[0057] 特别地，Z是化学键或-S02-CH2-CH2-基团；在任何上述含义中的亚芳基特别是亚苯 基；
[0058]且
[0059] Y是相同或不同的极性官能团，选自-s〇3h、-os〇3h、-⑶ 2h、-p(o)(oh)2、-op(o) (0H)2、0H 和 SH;
[0060] 特别地，Y选自-s〇3h、-os〇3h和-c〇2h ;
[0061] 以及任选的连接体分子，其在载体基质和蒽醌化合物之间形成连接基团，优选共 价连接基团。
[0062] 具体的实例是式（1)化合物，其中B是任选被取代的亚苯基桥，其中所述N-基团是 连接在芳香环B的间位或对位。
[0063] 其它具体实例是式(1)化合物，其中V是式(2a)的取代基，特别是下式
[0067]优选的吸附剂包含载体基质，其共价连接至少一个上文所述的本实施方案的具体 染料，其中优选的配体密度是160-500ymol/g干燥的吸附剂，更优选的配体密度是170-400μ mo 1 /g干燥的吸附剂，最优选190-330μηιο 1 /g干燥的吸附剂。
[0068] 3.上述实施方案中任一项所述的吸附剂，其中 [0069] B是下式的取代基
[0071] 其中
[0072] Y如上文所定义，
[0073] η是 0是 1
[0074] η3是0、1、2、3或4;
[0075] Yi相同或不同，选自：卤素，特别是C1;烷基，特别是&_〇4烷基;烷氧基，特别是&_〇4 烷氧基;N0 2或Y，其中Y如上文所定义；
[0076] W 是化学键，或选自-C(0)N(H)-、-S02N(H)-、-S02-或-N(H)- ;且
[0077] R2选自Η或烷基，特别是&心烷基。
[0078]具体实例是式（1)化合物，其中Β是任选被取代的式3a的亚苯基桥，在其间位或对 位与所述的N-基团连接。
[0079]其它具体实例是式（1)化合物，其中B是式3a的亚苯基桥，在其间位或对位与所述 N-基团连接，且其中n3是1、2、3或4,且其中至少一fYi基团是Y，特别是-S03H、-0S03H或-C0 2H。例如，n3是0或1，且或n3是4,且其中一个￥1是-30出，其它三个基团是相同或 不同的&-C4烷基，例如甲基。
[0080] 进一步优选的吸附剂包含载体基质，其共价连接至少一个上文所述的本实施方案 的特定染料，其中优选的配体密度是160-500μηιο 1 /g干燥的吸附剂，更优选的配体密度是 170-400μηιο 1 /g干燥的吸附剂，最优选190-330μηιο 1 /g干燥的吸附剂。
[0081] 4.上述实施方案中任一项所述的吸附剂，其中B是式3a的芳香基团。
[0082] 进一步优选的吸附剂包含载体基质，其共价连接至少一个上文所述的本实施方案 的特定染料，其中优选的配体密度是160-500μηιο 1 /g干燥的吸附剂，更优选的配体密度是 170-400μηιο 1 /g干燥的吸附剂，最优选190-330μηιο 1 /g干燥的吸附剂。
[0083] 5.上述实施方案中任一项所述的吸附剂，其中V是式2a的取代基，例如2a'或2a"。
[0084]进一步优选的吸附剂包含载体基质，其共价连接至少一个上文所述的本实施方案 的特定染料，其中优选的配体密度是160-500μηιο 1 /g干燥的吸附剂，更优选的配体密度是 170-400μηιο 1 /g干燥的吸附剂，最优选190-330μηιο 1 /g干燥的吸附剂。
[0085] 6.实施方案4的吸附剂，其中B是式3a的芳香基团，其中n3是0、1、2、3或4，且￥1是烷 基例如Q-C4烷基，或Y，例如_S03H。例如，B可以是1，3-亚苯基基团，其在2、4和5位带有Q-C4 烷基基团，特别是甲基基团，且在5位是基团Y，例如-S03H。
[0086] 进一步优选的吸附剂包含载体基质，其共价连接至少一个上文所述的本实施方案 的特定染料，其中优选的配体密度是160-500μηιο 1 /g干燥的吸附剂，更优选的配体密度是 170-400μηιο 1 /g干燥的吸附剂，最优选190-330μηιο 1 /g干燥的吸附剂。
[0087] 7.实施方案5的吸附剂，其中V是式2a的取代基，其中R是H，且Z是选自化学键或-S02-CH 2-CH2-;特别地，Z是化学键，且Y是-S03H、-0S03H或-C0 2H，例如-S03H;特别是式2a '或 2a"的取代基。
[0088] 进一步优选的吸附剂包含载体基质，其共价连接至少一个上文所述的本实施方案 的特定染料，其中优选的配体密度是160-500μηιο 1 /g干燥的吸附剂，更优选的配体密度是 170-400μηιο 1 /g干燥的吸附剂，最优选190-330μηιο 1 /g干燥的吸附剂。
[0089] 8.上述实施方案中任一项所述的吸附剂，其中k是0且m是1。
[0090] 进一步优选的吸附剂包含载体基质，其共价连接至少一个上文所述的本实施方案 的特定染料，其中优选的配体密度是160-500μηιο 1 /g干燥的吸附剂，更优选的配体密度是 170-400μηιο 1 /g干燥的吸附剂，最优选190-330μηιο 1 /g干燥的吸附剂。
[0091] 9.上述实施方案中任一项所述的吸附剂，其中所述吸附剂包含所述蒽醌化合物， 其与所述载体基质经连接体连接，其中所述连接体是选自6-二氨基己烷(DAH)、1，4_二氨基 丁烷(DAB)、1，2-二氨基乙烷(DAE)、1，8-二氨基辛烷(DAO)、1，10-二氨基癸烷，以及特别是 三-2'-氨基乙基胺(TREN)。
[0092] 本实施方案的进一步优选的吸附剂是那些吸附剂，其中优选的配体密度是160-500ymol/g干燥的吸附剂，更优选的配体密度是170-400ymol/g干燥的吸附剂，最优选190-330ymol/g干燥的吸附剂。
[0093] 10.实施方案1-9中任一项所述的吸附剂，其具有10-200,例如20-180或45-165或 80-120或90-110μπι的平均粒径，测定为D(0,5)或D(4,3)，特别是D(4,3)。
[0094] 本实施方案的进一步优选的吸附剂是那些吸附剂，其中优选的配体密度是160-500ymol/g干燥的吸附剂，更优选的配体密度是170-400ymol/g干燥的吸附剂，最优选190-330ymol/g干燥的吸附剂。
[0095] 11.免疫球蛋白分子的色谱纯化方法，该方法包括将包含混有污染的无机和/或有 机物质的免疫球蛋白分子的至少一种所需类型的样品与实施方案1-10任一项所述的吸附 剂接触，将免疫球蛋白分子的所需类型吸附在所述吸附剂上，任选地用洗涤液洗涤所述吸 附剂，并随后洗脱该被吸附的物质，以获得包含富集（即更加纯的）形式的所述所需免疫球 蛋白分子的洗脱物。
[0096] 12.免疫球蛋白分子的色谱纯化方法，该方法包括将包含混有污染的无机和/或有 机物质的免疫球蛋白分子的至少一种所需类型的样品与实施方案1-10任一项所述的吸附 剂接触，吸附(任选在选择的条件下)所述污染的无机和/或有机物质，并获得包含更加纯的 形式的所述所需免疫球蛋白分子的流分。
[0097] 实施方案11和12的方法还可以重复进行，它们还可以以任何次序组合，且该组合 的方法可以以任何次序重复。
[0098] 13.实施方案11或12的方法，其中所述免疫球蛋白分子的所需类型是功能抗体 (Ab)或片段抗体(fAb)。
[0099] 14.实施方案11-13中之一的方法，其中Ab和fAb是选自通过化学、酶或重组产生的 Ab 或fAb。
[0100] 15.实施方案 14的方法，其中所述fAb选自Fab、F(ab'M或Fab2)、Fab3、scFv、：-scFv、微小抗体、双特异抗体、三特异性抗体、四特异性抗体、串联双抗体;和单个抗体结构 域及其片段;其中其多价片段可以具有相同或不同的抗原特异性。
[0101] 16.实施方案15的方法，其中所述抗体结构域是选自VH、VL、VhH和ν-NAR结构域。
[0102] 17.实施方案16的方法，其中所述结构域片段包含至少一个⑶R，特别是至少⑶R1、 CDR2 和 CDR3 中之一。
[0103 ] 18.实施方案11 -17中之一的方法，其中需纯化的包含样品的免疫球蛋白是被变性 的和/或聚集的/多聚化的(mulitimerized)免疫球蛋白、免疫球蛋白或抗体降解产物、抗体 的游离轻链或重链、其它生物分子如DNA或宿主细胞蛋白所污染。
[0104] 19.上述实施方案11-18中任一项所述的方法，其中所述Ab或fAb在pH4-8下与吸附 剂结合。
[0105] 20.实施方案11-19中之一的方法，其中所述样品反复地与实施方案1-10中之一所 定义的相同或不同的吸附剂接触。
[0106] 21.如实施方案1-9中任一项所定义的化合物用于分离免疫球蛋白分子、特别是Ab 和fAb的用途。
[0107] 22.实施方案21的用途，其中进行所述分离的目的是为了至少一种Ab或fAb的去除 或者定性或定量分离、定性或定量检测、或鉴定。
[0108] 23.制备型或分析型试剂盒，其包含至少一种如实施方案1-10中任一项所定义的 带有蒽醌化合物的吸附剂，以及用于鉴别至少一种分离的fAb的其它物质。
[0109] 24.制备实施方案1 -10中之一的吸附剂的方法，该方法包括将任选活化的载体与 适合的连接体例如三_2'_氨基乙基胺(TREN)反应，随后将由此获得的官能化的吸附剂与实 施方案1-9的蒽醌化合物反应。
[0110] b)具体定义
[0111]术语"分离"和"纯化"在本发明全文中具有相同含义，用于描述对包含复杂混合物 的蛋白质物质和/或其它不同分子量和类型的生物物质(例如通常形成细胞成分的物质）的 组合物进行处理，所述物质包含至少一种目标fAb分子作为一种成分，且该纯化/分离获得 包含富集形式的所述目标分子的产物。
[0112] 术语"富集"的含义是将除所述目标分子以外的其它物质部分或全部地从所述复 杂混合物中除去，特别是除去如上文所述的蛋白质物质和/或其它生物物质。
[0113] 术语"配体密度"定义了每干燥重量的吸附剂（载体和直接或共价连接的染料配 体）中的蒽醌染料分子(如式（1)的那些）的摩尔含量(例如μ mol/g)。所述配体密度是在标准 条件下通过干燥该吸附剂，特别是经冷冻干燥以除去来自物质中残余的液体而测定。得到 干燥粉末。基于吸附剂的总重量，可以剩余低于1重量％或更特别是低于0.1重量％的比例 的残余液体。随后，将所述干燥的吸附剂物质的预定的量溶于酸如HC1 (例如6N HC1)中，然 后在升高温度下孵育，如lh/400C或lh/600C。因此，通过水解裂解释放染料。然后进行光谱 测定染料含量(在特定染料的A max下）。整体方法在下文实验部分中进一步描述。鉴于吸附剂 的液体含量相对较高的事实(根据样品的制备方法，观察到市售的Blue Sepharose产品的 液体含量在约60-90重量％范围内），认为表示为每干燥重量的所述吸附剂的配体密度值最 适合表征吸附剂的配体含量。
[0114] 术语"粒径"定义为平均粒径。优选地，本发明的颗粒是通过狭窄的、特别是基本上 单峰或单峰的粒径分布来表征。粒径测定可以通过本身已知的方式进行，例如通过在 Malvern Mastersizer仪器上应用粒径分布检测。通常情况下，该检测可以在0，1M NaOH中 进行。本文所述的平均粒径值是D(0.5)或D(4.3)值，其可以稍微不同，但是其仍在指定参数 范围内，D(0.5)代表了以μπι计的平均粒径，在此点处50 %的粒径分布更小且50%的粒径分 布更大。D(4,3)代表体积平均直径。
[0115] 对于基团B或V中的"Q-C4烷基"，可考虑例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、 仲丁基、叔丁基或异丁基，特别是甲基或乙基，尤其是甲基。
[0116] 对于基团B或V中的"&-C4烷氧基"或"-0?4烷基"，可考虑例如甲氧基、乙氧基、 正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基或异丁氧基，特别是甲氧基或乙氧基， 尤其是甲氧基。
[0117] 对于基团B或V中的"卤素"，可考虑例如氟、氯和溴，特别是氯或溴，尤其是氯。
[0118] 对于基团B或V中的"亚芳基"，可考虑亚萘基、亚联苯基或亚苯基，特别是亚苯基， 且更加特别是邻 _、间-和尤其是对-亚苯基。
[0119] c)具体的B和V基团
[0120] 在随后的表1和2中列出了式1的基团B和V的非限定性的实例。
[0121] 表1:基团B的实例(表中的"No指编号，"Formula"指化学式）
[0126] 表2:基团V的实例(表中的"No ·"指编号，"Formula"指化学式）
[0130] d)具体的染料配体
[0131 ]在本发明的具体实施方案中，式(1)化合物对应于下式的化合物
[0133] 其中
[0134] B是亚苯基基团，其未被取代或被磺基(_S03H)取代且任选地进一步被&-〇4烷基取 代;例如下式的基团
[0136] V是苯基氛基或N-C1-C4烷基-N-苯基氛基，其在苯环上被横基或-S〇2-CH2-CH2-〇_ s〇2〇h取代，例如苯基氨基，其在间-或对-位被-so2oh取代；
[0137] 式(1)化合物的结构变化可能解决具体的分离或纯化问题。
[0138] 具体的式1 a化合物的非限定性实例如下表3中所提供；
[0143] e)基质物质(底物和间隔物）
[0144] 用于制备本发明所用吸附剂的底物、载体或基质基本上可以是水溶性的。作为所 述底物的实例可以提到的是丙烯酸聚合物，例如聚丙烯酰胺或羟基烷基甲基丙烯酸酯，以 及这些物质的共聚物，金属氧化物，例如锆、钛或铝，硅石或多孔玻璃，但优选的水溶性固体 载体是具有多个羟基基团的聚合物底物，式(1)化合物可以通过该反应基团与其连接。尤其 适合的底物是碳水化合物和修饰的碳水化合物。适合的碳水化合物底物的实例是琼脂糖、 交联的琼脂糖、葡萄糖、葡聚糖，及其修饰的版本，例如以"琼脂糖(Sepharose)"和"葡聚糖 (Sephadex)〃凝胶（〃Sepharose〃和〃Sephadex〃是GE Healthcare的商标)提供，以及如GB 1， 540,165中所述。其它聚合物底物是聚酰胺。特别感兴趣的底物是例如琼脂糖和交联琼脂 糖。
[0145] 应用于本发明中的吸附剂可以通过标准技术制备，例如，通过将式（1)化合物与底 物(例如碳水化合物底物)在酸结合试剂(例如碱金属氢氧化物或碳酸盐，如氢氧化钠或碳 酸钠)的存在下反应以形成共价键，所述底物具有能够与所述式（1)化合物中的反应性基团 发生反应的基团，其中变量如上文所定义和优选。
[0146] 此类吸附剂及包含其的色谱柱的制备方法是有据可查的，例如美国专利号4,016， 149和4，546，161。因此，这些文献将引入本文作为参考。
[0147] 正如已经指出的，底物或基质，例如琼脂糖、交联琼脂糖、葡萄糖或葡聚糖，可以进 一步通过引入不同长度的间隔物进行修饰，有利地是，随后再将式(1)化合物与该间隔物共 价结合。间隔物可以使得染料配体与待纯化的蛋白质物质的相互作用增强，因为提高了染 料配体的易进入性，从而提高了吸附剂的选择性和效能。在特定的实施方案中，基质是被间 隔物修饰的。
[0148] 例如，通过将底物用表氯环氧丙烷在酸结合试剂(例如碱金属氢氧化物或碳酸盐， 如氢氧化钠或碳酸钠）的存在下处理，并随后用聚胺在适合的温度下例如20_80°C、特别是 20-60 °C处理，从而实施间隔物的引入。
[0149] 适合间隔物引入的聚胺化合物是直链或支链的，特别是直链的间隔物基团。它们 可以选自芳香族聚胺、脂肪族聚胺和脂环聚胺。通常的实例包括聚乙烯基胺、聚乙烯基亚 胺、1,2-乙二胺、肼、肼-2-二-(3-氨基丙基)-胺、1,4-二氨基环己烧、3-氨基-1-甲基氨基丙 烧、N-羟基乙基乙二胺、N-甲基-二_(3_氨基丙基)-胺、四亚乙基二胺、1，4_二氨基丁烧、1， 6-六亚甲基二胺、1，8_二氨基辛烧、二-2 氨基乙基胺、1-氨基乙基-1，2-乙二胺、二亚乙基 三胺、四亚乙基五胺、五亚乙基六胺、亚苯基二胺、二苯乙烯二胺、2,4,6_三氨基甲苯-三盐 酸化物、1，3，6-三氨基萘、异佛尔酮二胺、苯二甲基二胺、氢化的苯二甲基二胺、4，4 二-二 氨基苯基甲烷、氢化的4,4'_二氨基二苯基甲烷，以及这些聚胺单体的衍生物；以及支链的 间隔物，例如二 _2'_氨基乙基胺。
[0150] 特别感兴趣的是脂肪族和/或脂环聚胺。特别感兴趣的是脂肪族和/或脂环二胺。 所提到的特别是1,4-二氨基丁烧、1，6-六亚甲基二胺、1，8-二氨基辛烧和1，10-二氨基癸 烷。
[0151] 所述聚胺可以单独使用或者作为至少两种聚胺的混合物使用。
[0152] 包含与固体载体结合的式（1)或（la)化合物的吸附剂可以是柱子的形式以达到色 谱分离目的，或者是薄膜的形式以便以膜分离模式进行分离。
[0153] f)用于分离的生物物质
[0154] 应用于吸附剂的生物物质包含或者有可能包含免疫球蛋白分子，例如抗体片段抗 体(fAb)物质。其可以是例如以粗的或预处理的细胞培养物上清、全细胞培养物、细胞匀浆， 或适合应用于吸附剂的其任何部分。获得合适蛋白质类样品物质的方法是本领域熟知，例 如Cooper，Biochemische Arbeitsweisen,Walter de Gruyter，1981 中所述。
[0155] 可以通过本发明方法纯化的fAb是包含免疫球蛋白结构域或免疫球蛋白结构域集 合的抗体的部分，其能够与抗原结合，且在许多实施方案中，其包含至少一个重链片段，通 常称为VH域，或其功能片段，和/或轻链片段，通常称为VL域，或其功能片段，它们任选地与 至少一个其它肽链一起，例如一个或多个恒定域。
[0156]来自轻链的恒定域通常指定为CL。
[0157] 来自重链的恒定域是例如：IgG分子的CHI、CH2和CH3; IgM分子的Cyl、Cy2、Cy3或Cy 4;IgA分子的Cαl、Cα2和Cα3;IgE分子的Cεl、Cε2、Cε3或Cε4 ;IgD分子的Cδl、Cδ2和Cδ3。
[0158] 在某些实施方案中，fAb包含重链衍生的片段和轻链衍生的片段，各个链片段是由 恒定域和可变域构成，该片段称为Fab片段。
[0159] 在其它实施方案中，该fAb包含两个或多个区域，通常是重链或轻链的可变和恒定 域的组合、来自两个重链可变域的组合、来自两个轻链的可变域的组合，或者来自轻链的可 变域和来自重链的可变域的组合。
[0160] 在某些实施方案中，fAb包含由防止解离的可弯曲的多肽连接体连接的VH和VL域 (称为单链Fv、ScFv)。
[0161] 而在其它实施方案中，fAb包含单个结构域或其片段，通常为可变的重链或其片 段，或者可变的轻链或其片段。
[0162] 在其它实施方案中，fAb是多聚体形式，例如双8〇?￥、？&匕2、？ &匕3、微抗体(如8〇卩￥_ Ch3)、双特异抗体、三特异性抗体、四特异性抗体（参见例如Hoi linger等人，Nature Biotechnology，2005，23，9，1126-1136)或 Tandab'?。
[0163] 可以通过本发明方法纯化的fAb的实例包括包含组合的重链和轻链的蛋白质或多 肽构建体，各个链是由恒定域和可变域构成，其中该免疫球蛋白的轻链和重链相互作用以 形成单一功能的抗原结合位点。
[0164] 其它实例包括基于VH链的域抗体，其为能够结合靶点的多肽，该多肽包含至少一 个结合域，其中该结合域是可变的重链抗体或其功能片段的单一可变区域。
[0165] 其它实例包括基于VL链的域抗体，其为能够结合靶点的多肽，该多肽包含至少一 个结合域，其中该结合域是可变的轻链抗体或其功能片段的单一可变区域。
[0166] 上文所述的fAb可以衍生自任何上文所述的不同的免疫球蛋白类别（IgA、IgD、 IgE、IgM或IgG，特别是IgG;以及其任何亚类(例如IgGl、IgG2、IgG3和IgG4)。
[0167] 具体的fAb是scFv和Fab类型。
[0168] 本发明待纯化的免疫球蛋白或抗体可以是任何Ig类别（IgA、IgD、IgE、Igim!UgG， 特别是IgG;以及其任何亚类(如IgGl、IgG2、IgG3和IgG4)。
[0169] 更加优选地，fAb或抗体或其工程变体是重组产生，例如通过在宿主细胞中表达， 例如在原核宿主例如大肠杆菌或在真核宿主例如毕赤酵母或在哺乳动物或植物细胞中表 达。
[0170] g)分离方法
[0171] 本发明的分离或纯化方法还可以通过在包含式（1)化合物的吸附剂存在下，在适 合的pH和离子强度的水性环境中处理，例如振摇生物物质，分离吸附剂，例如经过滤分离， 并通过适合的pH和离子强度的变动将结合的蛋白质从吸附剂上洗脱而进行。
[0172] 有利地是，本发明的分离或纯化方法是经相互作用或色谱法进行，其包括：
[0173 ] (a)接触阶段，其中将包含生物物质的混合物与固定在色谱柱上的包含式（1)化合 物的吸附剂接触，
[0174] (b)洗涤阶段，其中通过将洗涤溶液流经吸附剂而将未结合的物质从包含式（1)化 合物的吸附剂中除去，和
[0175] (c)洗脱阶段，其中将洗脱溶液流经包含式（1)化合物的吸附剂，以回收柱子中截 留的所需生物物质。
[0176] 根据本发明的另一方面，提供了吸附剂，其包含如上文所定义的式（1)化合物与具 有能够与所述式（1)化合物的反应性基团反应以形成共价键的底物的加合物，其中变量定 义如上文所提供且特别有价值。
[0177] 本发明的吸附剂是高纯度的物质，没有任何染料浸出行为，且在基质上包含不同 水平的染料配体浓度。
[0178] 此外，本发明的吸附剂在结合和分离抗体、抗体片段以及其工程变体方面是化学 和热稳定的，并且是高度选择性的。
[0179] 染料配体可以类似地按照本领域已知的方法制备。
[0180] 现在将通过参考以下实施例来更加详细的解释本发明。温度以摄氏度提供。除非 另外指明，否则份数是重量份数，且百分比是指重量百分比。重量份数是指以千克对升的比 率表示的单位体积内的重量。
[0181] 实验部分
[0182] A · -般方法
[0183] 1.测定色谱树脂性能
[0184] 1.1抗体聚集物的产生
[0185] 将蛋白A琼脂糖纯化的人多克隆IgG分子(20ml，蛋白质含量15mg/ml)用25mM乙酸 钠 pH 4.0缓冲液透析两次(分别4小时和16小时）。将IgG样品在60°C孵育20小时，以诱发IgG 聚集物的产生。随后将热处理的IgG样品调至75mM NaCl和pH 5.0,再次用缓冲液A1透析 (25mm MES 20%1，2_丙二醇pH 6.0)。将未处理的对照IgG样品用缓冲液A1透析。
[0186] 图1说明了 IgG单体样品及经热处理获得的IgG聚集物的分析型SEC(图la)以及非 还原的SDS-PAGE分析（图lb)的结果（IgG =免疫球蛋白，HT =热处理，Mu =蛋白多聚体，Mo = 蛋白单体）。
[0187] 热处理的IgG和未处理的对照IgG样品的蛋白质含量调至15mg/ml。
[0188] 1.2色谱条件
[0189] 色谱柱(直径=0.5cm，长度5，2cm)用大约1.0ml色谱树脂填充，并安装到标准HPLC 系统上。
[0190] 缓冲液:
[0191] 装载/平衡缓冲液Al:25mM MES pH 6.0,20%1，2丙二醇
[0192] 洗脱缓冲液Bl:25mM MES pH 6.0,20% 1,2丙二醇，1.0M NaCl
[0193] 洗脱缓冲液B2:25mM Tris/HCl pH8.5，10%异丙醇
[0194] CIP缓冲液Α2:1·0Μ NaOH
[0195] 上样:
[0196] 样品（2.0ml，15mg/ml)以75cm/h(0.25ml/min,保留时间4分钟)施加，并用缓冲液 A1洗去未结合的蛋白质。以300cm/h用20CV至100%B1线性梯度洗脱结合的蛋白质，然后用 7CV的缓冲液B2和7CV的缓冲液A2完全抽提。将蛋白质样品在UV 280nm下检测，并收集蛋白 质流分。
[0197] SDS PAGE:
[0198] 将10yg样品和lml流分中的15μ1在非还原条件下加载至SDS-PAGE上，然后用考玛 斯亮蓝染色。
[0199] 收集窗口 'A'和窗口 'B'的流分，调至0.9mg/ml，并用25mM乙酸钠 pH4.0缓冲液透 析。在非还原条件下将相等的量(l〇yg)加载至SDS-PAGE上，然后用考玛斯亮蓝染色。
[0200] 分析型 SEC:
[0201] 将25μ1'Α'和'B'的混合流分加载至在30°C下缓冲液以1.0ml/min流动的BioSep-SEC-S2000柱上（Phenomenex)(100mM磷酸钠 pH 4.0缓冲液，300mM NaCl)〇
[0202] 在UV280nm下检测等度蛋白质洗脱。
[0203] 2.用UV-可见光分光光度计测定染料含量(配体密度）
[0204] 2.1标准曲线的制作
[0205] 制备标准溶液:
[0206] 在100ml容量瓶中在振摇下将染料(25mg)溶于水(80ml)，并随后超声处理10分钟。 将该容量瓶用水装满至刻度。
[0207] 制备校准溶液
[0208] 按照如下方法制备具有5、10、15、20和25!1^/1浓度的五份标准溶液。将标准溶液 (1、2、3、4和5ml)移液至50ml容量瓶中，向其中加入HCl(6mol/l，40ml)。将该溶液在振摇浴 中于40 °C混合1小时。还可以将该溶液在振摇浴中于更高温度下混合，例如在60 °C下1小时。 将该溶液冷却至室温，并用HCl(6mol/l)将容量瓶装满至刻度。
[0209] 样品制备与检测
[0210]为了从待分析的染料样品中除去液体，进行常规的冷冻干燥步骤。例如，为了干燥 含水样品，冷冻干燥可以在_15°C和〈lmbar减压下进行。将一份所述冷冻干燥的树脂样品 (lOOOmg)置于50ml容量瓶中，加入HCl(6mol/l，40ml)。将该溶液在振摇浴中于40°C混合1小 时。还可以将该溶液在振摇浴中于更高温度下混合，例如在60 °C下1小时。将该溶液冷却至 室温，并用HCl(6mol/l)将容量瓶装满至刻度。
[0211] 使用lcm比色杯和具体染料的Amax来检测UV-可见光光谱。用6M HC1来完成仪器的 空白设置。
[0212] 计算
[0213 ] R =从校准曲线中读取样品中染料的量[mg/1 ]
[0214] 在50ml容量瓶中染料的量= R/1000*50[mg]
[0216] B.合成样品 [0217] 1.染料配体的制备
[0218]合成以下通式5的染料配体以进行如下文所述的富集试验。
[0220] X =卤素
[0221] R = H或甲基
[0222] n = l、2或 3
[0223] 表4(表中的"Triazine"是指三嗪）
[0225] υ"三嗪"指示了基团B与三嗪环的连接，如上式5中所示。[0226] 表5(表中的"Triazine"是指三嗪）
[0229] υ"三嗪"指示了基团V与三嗪环的连接，如上式5中所示。
[0230]具体染料可以按照如W0 2006/108760中所详细描述来制备，其公开内容引入本文 作为参考。
[0231] 1.1蒽醌染料的制备：
[0232] 4-氨基芳基-取代的蒽醌染料可以容易地从起始原料溴氨酸和对应的取代的苯二 胺通过文献中的Ullman偶联方法制备(例如H.Zollinger，Color Chemistry，第3版，Wiley-VCH(2003),273-278·)。
[0233] 合成实施例D1:
[0234] 具有结构基团B-2的蒽醌染料的合成:
[0236] 通过氯化亚铜（I)催化的1-氨基-4-溴蒽醌-2-磺酸与对氨基乙酰苯胺在碳酸氢钠 缓冲水溶液中于70 °C下进行偶联反应3小时，随后在10-12%的发烟硫酸中于环境温度下磺 化，然后在稀释的硫酸中于75°C下水解和脱保护6小时，从而获得所述染料。
[0237] 合成实施例D2:
[0238] 具有结构基团B-3的蒽醌染料的合成:
[0240]通过乙酸铜（II)催化的1-氨基-4-溴蒽醌-2-磺酸与对苯二胺磺酸在碳酸钠缓冲 水溶液中于80°C下进行偶联反应2小时，得到所述染料。
[0241] 合成实施例D3:
[0242]具有结构基团B-4的蒽醌染料的合成:
[0244] 通过铜催化的1-氨基-4-溴蒽醌-2-磺酸与1，3-苯二胺-4-磺酸在碳酸氢钠缓冲水 溶液中于60°C下进行偶联反应17小时，得到所述染料。
[0245] 1.2染料配体的制备
[0246] 染料配体通常可以按照两种不同的方法制备(也参见流程1):
[0247] 方法bl)在pH4-5和15°C下将对应的蒽醌染料(B-2至B-4)与氰脲酰氯偶联90分钟， 生成蓝色二氯中间体，并随后与对应的取代的胺(V-1至V-8)在pH7.5-8.5和60 °C下偶联5小 时，或者
[0248] 方法b2)将取代的胺(V-1至V-8)与氰脲酰氯在pH3.5-4和5°C下偶联120分钟，生成 无色的二氯中间体，并随后与对应的蒽醌染料(B-2至B-4)在pH7.5-8.5和50 °C下偶联16小 时。
[0250]合成实施例L1:染料D15
[0252] 方法bl):
[0253] 5°C下将184.4g(1.0mol)氰脲酰氯溶于1870ml乙基甲基酮中，并加入2240g冰水来 沉淀。5°C下将0，933mol蒽醌染料B-3在2240g中的溶液和pH 7 · 5的448g碳酸钠溶液(20 % ) 加入该氰脲酰氯混悬液中。将反应物加温至15°C，并在此温度下搅拌90分钟，其间通过缓慢 加入112g碳酸钠溶液（20 % )将pH值维持在4-5。反应完成后(HPLC监控），在15 °C下将194g (l，12mol)对-氨基苯磺酸(V-8)在670g水中的溶液和ρΗ7·5的300g碳酸钠溶液(20%)加入 该二氯中间体中。通过加入672g碳酸钠溶液(20%)将pH调至7.5-8.5,并保持该水平直至偶 联完成。将该混合物加热至60°C，并搅拌5小时。
[0254]反应完成后(HPLC监控），将1140g氯化钠加入反应混合物中，并在2小时内冷却至 25°C，并另外保持该温度16小时以沉淀配体染料。过滤后，用1200g浓的氯化钠溶液洗涤，将 滤饼在水中重新成浆，并经反渗透脱盐。将该浓缩的不含氯化物的染料溶液喷雾干燥，得到 512g(61%产率)的染料D15的三钠盐，为深蓝色细粉(X max.=622nm)。
[0255] 方法 b2):
[0256] 将60.68(0.35111〇1)对-氨基苯磺酸(￥-8)溶于16(^水和43.48氢氧化钠溶液(30%) 中。在第二个瓶子中，将65.9g(0.36mol)氰脲酰氯良好地悬浮于370g冰和100g水中，并加入 对-氨基苯磺酸钠溶液。用420ml氢氧化钠溶液(10 % )对pH进行校准并维持在2.5-3.5，并将 温度保持在5°C。将反应物搅拌120分钟，随后加温至40°C，并再搅拌30分钟。迅速加入 0.25mol蒽醌染料B-3在420ml水中的溶液和150ml氢氧化钠溶液（30%)，并用460ml氢氧化 钠溶液(10% )将pH调整并保持在7.5-8.5，并将该混合物在50°C搅拌16小时。
[0257] 反应完成后，将600g氯化钠加入反应混合物中，并在2小时内冷却至25°C，另外保 持该温度16小时以沉淀配体染料。过滤后，用530ml氯化钠溶液(26 % )洗涤，将滤饼在水中 重新成浆，并经反渗透脱盐。将该浓缩的不含氯化物的染料溶液喷雾干燥，得到lllg(52% 产率)的染料D15的三钠盐，为深蓝色细粉(X max.=622nm)。
[0258] 合成实施例L2:染料D16:
[0260]按照实施例1中的方法b2)，通过将0.082mol氰脲酰氯与0.080mol邻氨基苯磺酸 (V-6)在pH2.5-3.5和0-5 °C下偶联120分钟以得到二氯中间体，并随后将该中间体与 0.057mol蒽醌染料B-2在pH7.5-8.5和50°C下偶联16小时，得到染料D16,产率78%(Amax.= 605/619nm)〇
[0261]合成实施例L3:染料Dll
[0263] 按照实施例1中的方法bl)，通过将0.0315mol氰脲酰氯与0.030mol蒽醌染料B-4在 PH4-5和15°C下偶联90分钟以得到二氯中间体，并随后将该中间体与0.0318mol间氨基苯磺 酸(V-7)在 ρΗ7·5-8·5 和60°C 下偶联5 小时，得到染料 D11，产率 64%(Xmax.=591/624nm)。 [0264]合成实施例L4:染料D01
[0266] 按照实施例1中的方法b 1)，通过将1.Omo 1氰脲酰氯与0.933mo 1蒽醌染料B-4在 PH4-5和15 °C下偶联90分钟以得到二氯中间体，并随后将该中间体与1.12mo 1 N-乙基-N-(间-(β-硫酸基乙基）磺酰基-苯基）胺(V-4)在pH7 · 5-8 · 5和60 °C下偶联5小时，得到染料 D01，产率49% (Amax. =623nm)。
[0267] 合成实施例L5:染料D21:
[0269] 按照实施例1中的方法b2)，通过将0.057mol氰脲酰氯与0.057mol间氨基苯磺酸 (V-7)在pH2.5-3.5和0-5 °C下偶联120分钟以得到二氯中间体，并随后将该中间体与 0.040mol蒽醌染料B-2在pH7.5-8.5和50°C下偶联16小时，得到染料D21，产率79%(A max.= 609/629nm)。
[0270] 合成实施例L6:染料D20:
[0272]按照实施例1中的方法bl)，通过将1 .Omol氰脲酰氯与0.933mol蒽醌染料B-3在 PH4-5和15 °C下偶联90分钟以得到二氯中间体，并随后将该中间体与1.12mo 1间氨基苯磺酸 (V-7)在 ρΗ7·5-8·5 和60°C 下偶联5 小时，得到染料 D20,产率 63%(Xmax.=627nm)。
[0273]合成实施例L7:染料DIO:
[0275] 按照实施例1中的方法b2)，通过将0.143mol氰脲酰氯与0.140mol对氨基苯磺酸 (V-8)在pH2.5-3.5和0-5 °C下偶联120分钟以得到二氯中间体，并随后将该中间体与 0. lOOmol蒽醌染料B-4在pH7.5-8.5和50°C下偶联16小时，得到染料D10，产率50 % (Amax.= 595/620nm)
[0276] 2.吸附剂(树脂)的制备
[0277] 按照如W006/108760A2中所述经聚胺间隔物的吸附剂合成的一般方法，该公开物 引入本文作为参考。
[0278] 2.1具体吸附剂
[0279] 制备了以下树脂：
[0280] 表 6
[0282] 以下间隔物用于这些实施例：1，6_二氨基己烷(DAH)。
[0283] 合成实施例A1:
[0284] a)经DAH连接体合成吸附剂的方法-树脂BR 36、37
[0285] 将琼脂糖凝胶(6%交联，225g)用水(4500ml)洗涤，并在2L加套的反应器里立即悬 浮于水(900ml)中。加入表氯环氧丙烷（37.5g，405mmol)，然后加入等当量的NaOH( 16.2g， 405mmol)，并将反应物质以290rpm在25°C振摇4小时。随后将混悬液过滤，用水(4500ml)彻 底洗涤，得到环氧基-活化的琼脂糖。
[0286] 将环氧基-活化的琼脂糖（225g)加入1，6_二氨基己烷（12.55g，108mmol)在水 (900ml)的溶液中。将反应混合物在45°C振摇4小时，并过滤。将所得的氨基官能化的凝胶用 水(4500ml)彻底洗涤并排空。
[0287] 将氨基官能化的琼脂糖（225g)分成75g的三份，将第一份悬浮于染料D10(2.32g， 3mmo 1)在水（300ml)的溶液中，并将该混合物于45°C在290rpm振摇16小时。将该混悬液过 滤，并用水（2000ml)、lM NaCl(500ml)、匪 P(1000ml)、l:lv/v 匪 P:水（500mL)、lM NaCl (300ml)、1M NaOH( 300ml)、1M NaCl (300ml)以及最后用水（2000ml)洗去过量的染料配体。 将排空的吸附剂BR36在20 % v/v乙醇中于4 °C储存。
[0288] 将第二份75g的氨基官能化的琼脂糖悬浮于染料D11 (2.32g，3mmol)在水(300ml) 的溶液中，并将该混合物于45°C在290rpm振摇16小时。将该混悬液过滤，并用水(2000ml)、 1M NaCl(500ml)、NMP(1000ml)、l:lv/v NMP:水（500mL)、lM NaCl(300ml)、lM NaOH (300ml)、lM NaCl (300ml)以及最后用水（2000ml)洗去过量的染料配体。将排空的吸附剂 BR37在20%v/v乙醇中于4°C储存。
[0289] b)用于合成吸附剂BR45、BR46、BR47的操作程序
[0290]将琼脂糖凝胶(6%交联，225g)用水(4500ml)洗涤，并在2L加套的反应器里立即悬 浮于水(900ml)中。加入表氯环氧丙烷（37.5g，405mmol)，然后加入等当量的NaOH( 16.2g， 405mmol)，并将反应物质以290rpm在25°C振摇4小时。随后将混悬液过滤，用水(4500ml)彻 底洗涤并排空，得到环氧基-活化的琼脂糖。
[0291] 将环氧基-活化的琼脂糖（225g)加入1，6_二氨基己烷（12.55g，108mmol)在水 (900ml)的溶液中。将反应混合物在45°C振摇4小时，并过滤。将所得的氨基官能化的凝胶用 水(4500ml)彻底洗涤并排空。
[0292] 将氨基官能化的琼脂糖（225g)分成75g的三份，将第一份悬浮于染料D21(2.32g， 3mmo 1)在水（300ml)的溶液中，并将该混合物于45°C在290rpm振摇16小时。将该混悬液过 滤，并用水（2000ml)、lM NaCl(500ml)、匪 P(1000ml)、l:lv/v 匪 P:水（500mL)、lM NaCl (300ml)、1M NaOH( 300ml)、1M NaCl (300ml)以及最后用水（2000ml)洗去过量的染料配体。 将排空的吸附剂BR45在20 % v/v乙醇中于4 °C储存。
[0293] 将第二份75g的氨基官能化的琼脂糖悬浮于染料D19(2.32g，3mmol)在水(300ml) 的溶液中，并将该混合物于45°C在290rpm振摇16小时。将该混悬液过滤，并用水(2000ml)、 1M NaCl(500ml)、NMP(1000ml)、l:lv/v NMP:水（500mL)、lM NaCl(300ml)、lM NaOH (300ml)、lM NaCl (300ml)以及最后用水（2000ml)洗去过量的染料配体。将排空的吸附剂 BR46在20 % v/v乙醇中于4 °C储存。
[0294] 将第三份75g的氨基官能化的琼脂糖悬浮于染料D16(2.32g，3mmol)在水(300ml) 的溶液中，并将该混合物于45°C在290rpm振摇16小时。将该混悬液过滤，并用水(2000ml)、 1M NaCl(500ml)、NMP(1000ml)、l:lv/v NMP:水（500mL)、lM NaCl(300ml)、lM NaOH (300ml)、lM NaCl (300ml)以及最后用水（2000ml)洗去过量的染料配体。将排空的吸附剂 BR47在20%v/v乙醇中于4°C储存。
[0295] C.试验实施例
[0296] 实施例T1:从单体IgG分子中进行不充分的HMWA(高分子量聚集物）分离(现有技 术）
[0297] IgG抗体聚集物如方法部分(A. 1.1)中所述制备。
[0298] 聚集物样品是按照如上文A. 1.2所述在市售的BlueSepharose⑧(BS)树脂(染料 配体密度137ymol/g)上进行分析。具体而言，将柱洗脱液如图2a所示混合。混合物A(BS-A) 和B(BS-B)进一步经SDS-PAGE(图2b)和分析型尺寸排阻色谱法（图2c)分析。
[0299] (L =加载，Mu =蛋白多聚体，Mo =蛋白单体;非还原的SDS-PAGE，用考马斯蓝染色） [0300]特别是在混合物B中，Mo和Mu的未充分分离是很明显的。
[0301]实施例T2:通过应用本发明的BASF树脂从单体IgG分子中的改善的HMWA分离 [0302] IgG抗体聚集物如方法部分(A. 1.1)中所述制备。
[0303] 将聚集物样品按照如上文A. 1.2所述在BASF树脂81?36、81?37、81?45、81?46和81?47(染 料配体010、011、021、015、016分别具有284、281、280、307、256以111〇1/^的染料配体密度<6连 接体）（参见图3a和3b)。每个色谱分离的单一流分经SDS-PAGE分析（图4)，表明改善的聚集 物(Mu)去除。为了进一步分析BASF树脂的更优越的分离特性，将如图2a和3a、b中所示的柱 洗脱液混合。将混合物A和B进一步经分析型尺寸排阻色谱法（图5)和SDS PAGE(图6)分析。 [0304] (L =加载，FT =流穿，Mu =蛋白质多聚体，Mo =蛋白质单体;非还原的SDS-PAGE，用 考马斯蓝染色）
[0305]如果与市售的蓝琼脂糖（实施例T1)相比，特别是在混合物B中Mo和Mu的改善的分 离是很明显的。
[0306]本文所引用的现有技术文献的内容引入本文作为参考。
【主权项】
1. 用于免疫球蛋白分子的色谱纯化的吸附剂，该吸附剂包含与染料配体共价连接的载 体基质，其中所述染料配体选自蔥酿染料，且其中所述吸附剂的配体密度超过150μπιο 1 /g干 燥的吸附剂。2. 如权利要求1所述的吸附剂，其中所述吸附剂包括所述载体基质、任选的连接体分子 W及通式1的蔥酿化合物的反应产物其中 X是面素； k和m各自互相独立地是0或1，且k+m之和是1或2; B是芳香基团，其包含一个或多个稠合或非稠合的、任选的单-或多取代的芳香环； V是下式的取代基其中 η各自是0或1;条件是两个η不同时是0; R是相同或不同的，选自Η、烷基、畑2、ΝΗ-烷基、ΝΗ-芳基、Ν(烷基)2、N02、0H、0-烷基、CN、C (0)烷基、C(0)芳基、C(0)N出、C(0)N化)烷基、C(0)N(烷基)2、C(0)N化)芳基、面素； 化是氨或任选被取代的C1-C4烷基； Z选自化学键， -(C出）η广，nl是1-4的整数， 亚芳基、 -C出-亚芳基-、 -S〇2-亚芳基-、 -C(0)N(H)亚芳基-、 -S02N化)亚芳基-、 -CH=CH-、 -SOrC 出-CH2-; -C(0)NH-(C 出)η2-，η2 是 1-4 的整数； 且 Υ是相同或不同的极性官能团，选自-S03H、-0S0抽、-C0抽、-Ρ(0)(0Η)2、-0Ρ(0)(0Η)2、0Η 和甜。3. 如上述权利要求中任一项所述的吸附剂，其中 Β是下式的取代基其中 Υ如上文所定义， η是0或1 η3是0、1、2、3或4; Yi相同或不同，选自面素、烷基、烷氧基、Ν02或Υ，其中Υ如上文所定义； W是化学键，或选自-C(0)N化)-、-S02N化)-、-S〇2-或-Ν化)-;且 化选自Η或烷基。4. 如上述权利要求中任一项所述的吸附剂，其中Β是式3a的芳香基团。5. 如上述权利要求中任一项所述的吸附剂，其中V是式2a的取代基。6. 如权利要求4所述的吸附剂，其中B是式3a的芳香基团，其中n3是0、1、2、3或4,且Yi独 立地是烷基或Y。7. 如权利要求5所述的吸附剂，其中V是式2a的取代基，其中R是H，且Z选自化学键或- 50广师-师-。8. 如上述权利要求中任一项所述的吸附剂，其中k是0且m是1。9. 如权利要求1-8中任一项所述的吸附剂，其具有10-200,例如20-180或45-165或80- 120或90-110皿的平均粒径。10. 免疫球蛋白分子的色谱纯化方法，该方法包括将包含混有污染的无机和/或有机物 质的免疫球蛋白分子的至少一种所需类型的样品与权利要求1-9任一项所述的吸附剂接 触，将免疫球蛋白分子的所需类型吸附在所述吸附剂上，任选地用洗涂液洗涂所述吸附剂， 并随后洗脱被吸附的物质，W获得包含富集形式的所述所需免疫球蛋白分子的洗脱物;或 者该方法包括将包含混有污染的无机和/或有机物质的免疫球蛋白分子的至少一种所需类 型的样品与权利要求1-9任一项所述的吸附剂接触，吸附（在选择的条件下)所述污染的无 机和/或有机物质，获得包含更加纯的形式的所述所需免疫球蛋白分子的流分。11. 如权利要求10所述的方法，其中所述免疫球蛋白分子的所需类型是功能抗体(Ab) 或片段抗体(fAb)。12. 如权利要求10和11中任一项所述的方法，其中待纯化的包含免疫球蛋白的样品是 被变性的和/或聚集的/多聚化的免疫球蛋白污染。13. 权利要求1-8中任一项所定义的化合物用于分离免疫球蛋白分子、特别是Ab和fAb 的用途。14. 制备型或分析型试剂盒，其包含至少一种如权利要求1-9中任一项所定义的带有蔥 酿化合物的吸附剂，W及用于鉴别至少一种分离的fAb的其它物质。15. 制备权利要求1-9中任一项的吸附剂的方法，该方法包括将任选活化的载体与适合 的连接体例如Ξ-2'-氨基乙基胺(TREN)反应，随后将由此获得的官能化的吸附剂与权利要 求1 -8的蔥酿化合物反应。
【文档编号】C09B69/10GK105980485SQ201580007238
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2015年2月4日
【发明人】M·F·菲勒, M·格兰斯特罗姆, D·林德, S·S·科尔德, A·萨麦尔
【申请人】巴斯夫欧洲公司