专利名称：一种超临界流体萃取－高效液相色谱联用系统的制作方法
技术领域：
本发明涉及超临界流体萃取和高效液相色谱，具体地说是一种超临界流体萃取-高效液相色谱联用系统。
背景技术：
天然产物研究一直是植物学、化学和药学的重要研究领域，通过从天然产物中寻找生物活性成分和先导物来研究创制新药，是世界各国新药研究科学工作者公认的有效途径。有效成分的提取是天然产物研究中最基本，也是最关键的环节之一。超临界流体萃取(supercritical fluid extraction，简称SFE)是近年发展较快的一种新型样品提取技术，已被用于天然产物中非极性和弱极性有效成分的提取，尤其是挥发性、热敏性的物质。此外，通过加入适当的添加剂(如甲醇，水等)，还可以有效地萃取极性化合物。和传统的化学方法相比，超临界流体萃取技术不仅使用的有机溶剂量很少，而且具有速度快、效率高、能耗较少、成本低、安全性好等优点。
超临界流体萃取可以与高效液相色谱(HPLC，high performance liquidchromatography)、气相色谱(GC，gas chromatography)和超临界流体色谱(SFC，supercritical fluid chromatography)等分析仪器联用。SFE通常与HPLC离线联用；先将萃取物重新定溶到有机溶剂(如甲醇，乙酸乙脂等)中，再注射入高效液相色谱中进行分离检测。这种方法所需时间长、操作繁琐、人为误差较大。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于超临界流体萃取和高效液相色谱的联用系统。该联用系统可以将样品的预处理、分离和检测整合到一个平台。因此，与常用的离线分析系统相比，该联用系统具有很多优点，如所需样品量小(毫克级)、可以避免样品的污染和变质、分析速度快、操作简单、人为误差小以及自动化程度高等。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为一种超临界流体萃取-高效液相色谱联用系统以两个三通阀和一根捕集柱将超临界流体萃取装置(包括二氧化碳泵，改性剂泵，柱温箱和背压控制阀等部件)和高效液相色谱联结起来，形成一个样品预处理和分离检测集成的平台。
具体结构为该联用系统包括超临界流体萃取装置、第一号三通阀、第二号三通阀、捕集柱、液相色谱泵、分析柱及检测器；超临界流体萃取装置与第一号三通阀的一个接口相连，而第一号三通阀的另两个接口分别与捕集柱的入口端及液相色谱泵相连，捕集柱的出口端与第二号三通阀的一个接口相连，而第二号三通阀的另两个接口分别与分析柱的入口端及废液瓶相连，分析柱的出口端与检测器相连。
所述检测器(7)为紫外检测器，示差折光检测器，蒸发光散射检测器，电化学检测器或质谱检测器。
所述超临界流体萃取装置包括二氧化碳泵，改性剂泵，柱温箱和背压控制阀；柱温箱内设置有管路串联的预热环，混合柱和萃取池，预热环通过一个三通分别与二氧化碳泵和改性剂泵相连，萃取池与背压控制阀管路连接。
该系统的操作分为超临界流体萃取过程、溶剂替换过程和高效液相色谱分离检测过程；(1)作为萃取介质的可以是二氧化碳、水、甲醇、氨气、乙醇、苯和异丙醇等；(2)根据萃取的需要，所述捕集柱可以是硅胶柱、二巯基柱、氨基柱、氰基柱、苯基柱、C4柱或C18柱等；(3)根据待测样品的性质，溶剂替换过程中采用的溶剂可以是纯水、乙酸乙酯、正己烷以及各种组成的甲醇/水或乙腈/水混合体系等；(4)根据待分离样品的性质，所述分析柱可以是离子交换柱、硅胶柱、二巯基柱、氨基柱、氰基柱、苯基柱、C4柱或C18柱等。
具体过程为1)样品置于萃取池中，在设定的压力和温度下进行提取；2)超临界流体携带着溶解物流经背压控制阀；由于压力下降，温度升高，超临界流体迅速气化，与萃取物成为两相而立即分离；萃取介质经过管路排出系统，而萃取物被捕集柱吸附。同时，捕集柱还可以作为保护柱；由于在萃取过程中，部分萃取介质也会被捕集柱保留，必须除去以免干扰色谱分离的检测；解决方法是先采用溶剂充满捕集柱，赶出残留萃取介质。
3)切换三通阀连通捕集柱和分析柱，同时启动已设定的梯度洗脱程序，进行样品的色谱分离，并通过检测器进行定性定量分析。
该联用系统利用超临界流体作为萃取介质，通过同时控制萃取压力、萃取温度和萃取时间，实现样品中活性成分的提取，并通过高效液相色谱实现在线分离分析。与常用的离线分析系统相比，本发明具有如下优点1、能够有效地避免样品的污染和变质。本发明避免了萃取后样品的重新定容过程，减少了人工操作，因此能够有效地避免样品的污染和变质。
2.所需的样品量小。本发明联用系统可以将萃取物完全转移到分析柱，所需样品量仅为毫克级。
3.分析速度快。本发明避免了繁琐的离线操作，可以缩短分析时间，大大提高了分析速度。
4.结构简单、成本低廉。本发明接口采用两个商品化的三通阀和一根捕集柱组合而成，制作过程非常简易。
5.操作简单、人为误差小和自动化程度高。采用自动切换阀，利用控制软件可以实现整个操作过程的自动化，具有操作简单、易于实现仪器自动化操作等特点，因此在实际应用中具有明显的优势。。
6.本发明联用系统可以将样品的预处理、分离和检测整合起来，用于天然产物(包括中药)以及其他生物样品的分析，具有良好的应用前景和经济效益。
图1为本发明超临界流体萃取-高效液相色谱联用系统及其操作方法示意图；图中a.超临界萃取过程；b.溶剂替换过程；c.高效液相色谱分离和检测过程；1.背压控制器，2.第一号三通阀，3.液相色谱泵，4.捕集柱，5.第二号三通阀6.分析柱7.检测器，8.携带萃取产品的超临界流体，9为废液瓶；图2为本发明超临界流体萃取-高效液相色谱在线联用系统得到的灵芝子实体色谱图；图3为超临界流体萃取和高效液相色谱离线联用系统得到的灵芝子实体色谱图。
具体实施例方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细说明。
超临界流体萃取系统JascoTMLC-1500超临界流体萃取装置(Jasco，日本)，包括PU-1580型CO2泵，PU-2080plus型液相泵，CO-2060型恒温箱，BP-1580-81型背压控制器。捕集柱Hypersil C18(4.6×150mm，5μm)色谱柱；分析柱Hypersil C18(4.6×250mm，5μm)色谱柱。
液相色谱分离检测系统依利特P230型高效液相色谱仪(依利特公司，大连)；Jasco UV-2075plus型紫外检测器(Jasco，日本)；乙腈为supragradient色谱纯(Scharlau Chemie S.A.，巴塞罗那，西班牙)，甲酸为分析纯(哈尔滨化工化学试剂厂)；流动相A去离子水(1％甲酸)B乙腈(1％甲酸)；线性梯度洗脱程序0～60min，流动相B由20％线性增至100％；60min后流动相B保持100％。流速为1mL/min；检测波长为254nm。
该实例以灵芝子实体作为研究对象。灵芝子实体由沈阳万象生物养殖公司提供。将子实体干燥、粉碎和过筛，精密称取15mg灵芝子实体粉末，置于萃取池中。在优化的条件(压力15MPa，温度35℃，CO2流量1mL/min，背压阀温度50℃)下萃取2小时，然后进行高效液相色谱的在线分析。
采用离线的高效液相色谱分析作为对照例精密称取3g灵芝子实体粉末，置于萃取池中，在优化的条件(压力15MPa，温度35℃，CO2流量1mL/min，背压阀温度50℃)下萃取2小时，用甲醇定容至500μl，用0.45μm滤膜过滤，进样20μl。
该新型超临界流体萃取-高效液相色谱联用系统及其操作方法示意图如图1所示。整个系统的运行由三个部分构成萃取过程、溶剂替换过程和高效液相色谱分离检测过程。
超临界萃取过程如图1.a所示。样品置于萃取池中，在设定的压力和温度下进行提取。超临界CO2携带着溶解物流经背压控制阀。由于压力下降，温度升高，CO2与萃取物迅速成为两相而立即分离。CO2经过管路排出系统，而萃取物被捕集柱吸附，同时，捕集柱还可以作为保护柱。由于捕集柱的容量有限，萃取的样品量不宜过大，以毫克级为宜。
溶剂替换过程如图1.b所示。在萃取过程中，部分CO2气体也会被捕集柱保留，必须除去这些气体以免干扰色谱分离的检测。本实例采用1％甲酸的水溶液作为替换溶剂，由于萃取物与填料间强烈的相互作用，水不能将萃取物洗脱出来。排汽泡的时间也是需要考察的要素之一，时间太短，排气不完全，干扰测定；时间太长，会造成样品的损失。我们发现对于HypersilC18(4.6×150mm，5μm)柱，以1ml/min的流速冲洗3.5min已经能够满足要求。
高效液相色谱分离和检测过程如图1.c所示。经过前面两个阶段后，切换三通阀连通捕集柱和分析柱，同时启动已设定的梯度洗脱程序，进行样品的色谱分离分析。
尽管超临界流体萃取-高效液相色谱在线联用系统得到的色谱2和离线的色谱3相似，但是在线联用系统不仅可以将萃取物完全转移到分析柱，所需样品量仅为毫克级，而且缩短了分析时间，能够避免样品污染、变质的可能性。此外，还具有操作简单、易于实现仪器的自动化操作等特点，因此在实际应用中具有明显的优势。
权利要求
1.一种超临界流体萃取-高效液相色谱联用系统，其特征在于包括超临界流体萃取装置、第一号三通阀(2)、第二号三通阀(5)、捕集柱(4)、液相色谱泵(3)、分析柱(6)及检测器(7)；超临界流体萃取装置与第一号三通阀(2)的一个接口相连，而第一号三通阀(2)的另二个接口分别与捕集柱(4)的入口端及液相色谱泵(3)相连，捕集柱(4)的出口端与第二号三通阀(5)的一个接口相连，而第二号三通阀(5)的另两个接口分别与分析柱(6)的入口端及废液瓶相连，分析柱(6)的出口端与检测器(7)相连。
2.按照权利要求1所述超临界流体萃取-高效液相色谱联用系统，其特征在于所述检测器(7)为紫外检测器，示差折光检测器，蒸发光散射检测器，电化学检测器或质谱检测器。
3.按照权利要求1所述超临界流体萃取-高效液相色谱联用系统，其特征在于所述超临界流体萃取装置包括二氧化碳泵，改性剂泵，柱温箱和背压控制阀；柱温箱内设置有管路串联的预热环，混合柱和萃取池，预热环通过一个三通分别与二氧化碳泵和改性剂泵相连，萃取池与背压控制阀管路连接。
4.按照权利要求1所述超临界流体萃取-高效液相色谱联用系统，其特征在于所述捕集柱为硅胶柱、二巯基柱、氨基柱、氰基柱、苯基柱、C4柱或C18柱。
5.按照权利要求1所述超临界流体萃取-高效液相色谱联用系统，其特征在于所述分析柱为离子交换柱、硅胶柱、二巯基柱、氨基柱、氰基柱、苯基柱、C4柱或C18柱。
全文摘要
本发明涉及超临界流体萃取装置和高效液相色谱，具体地说是一种超临界流体萃取－高效液相色谱联用系统，包括超临界流体萃取装置、第一号三通阀、第二号三通阀、捕集柱、液相色谱泵、分析柱及检测器；超临界流体萃取装置与第一号三通阀的一个接口相连，而第一号三通阀的另两个接口分别与捕集柱的入口端及液相色谱泵相连，捕集柱的出口端与第二号三通阀的一个接口相连，而第二号三通阀的另两个接口分别与分析柱的入口端及废液瓶相连，分析柱的出口端与检测器相连。本发明利用超临界流体萃取装置实现样品中活性成分的提取，通过高效液相色谱实现在线分离分析，所需样品量小、避免样品污染和变质、分析速度快、操作简单、人为误差小、自动化程度高。
文档编号B01J20/281GK1936572SQ20051004726
公开日2007年3月28日 申请日期2005年9月23日 优先权日2005年9月23日
发明者张玉奎, 张洁, 霍玉书, 张丽华, 张维冰 申请人:中国科学院大连化学物理研究所