专利名称：用于分析、分离和离析单独的极性质子单体和/或低聚物的改进方法
技术领域：
本发明涉及依据聚合度，利用二醇相液相色语(LC)分离并 优选回收包括但不限于黄烷-3-醇的单独的极性质子单体和/或低聚物 的改进方法。已知各种黄烷-3-醇具有不同性质，并对人和动物具有不同 用途。基于聚合度更有效地分离和回收单独的黄烷-3-醇将使其作用靶 向性更高和更力o有效。
相关技术讨i仑原花色素，即黄烷-3-醇的低聚物和聚合物，为继木质素之 后含量第二丰富的天然植物酚。黄烷-3-醇单体主要通过一个单体4 位与另一个单体8位间的碳碳键(C4—C8)而连接在一起，少量通过 C4—C6键而连接在一起。原花色素包括B-型和A-型原花色素。在B-型原花色素中， 单体通过黄烷间C4—C6和/或黄烷间C4—C8 4建而连接在一起。只具 有C4—C8键的低聚物为线性，而至少一个C4—C6键的存在将导致 支化的低聚物。而A-型原花色素为包括在C2-0-C7以及在C4—C6 或C4—C8位键的双重连接低聚物。原花色素的分子量通常以聚合度(DP)表示。 一般将单独的 低聚物称作二聚物和三聚物等。原花青素为最大类的原花色素。Gu等表明发现41种食 物中包含原花色素，27种食物中包含原花青素(J. Agric. and Food Chem.)(2OO3》l:7513)。原花青素可包括(-)-表儿茶素、(+)-表儿茶素、 (+)-儿茶素和/或(-)-儿茶素单体单元，以及没食子酸化的单体，例如(-)-儿茶素没食子酸酯、(+)-儿茶素没食子酸酯、(-)表儿茶素没食子酸酯 和/或(+)-表儿茶素没食子酸酯。已知原花色素在植物食物的颜色稳定性、涩味和苦味中起 到重要作用。(见例如Haslam,"实用多畅、从分子^X别和生理作用角 度(Practical Polyphenols: From Molecular Recognition and Physiological Action)"(CambridgeU. Press, 1998))。然而，原花色素的名声却因这些 酚类化合物潜在的健康益处而得到了提高。(见例如Bagchi等，毒理 学(Toxicology) (2000) 148:187; Foo等，天然产物杂志(丄Natural Products) (2000) 63:1225; Steinberg等，Am. J. Clin. Nutri. (2003) 77:1466)。还已知用于人体和动物时各种原花青素4氐聚物具有特异性 质和潜在作用。例如，Tempesta公开了聚合度(DP)为2-11的原花青
素低聚物具有明显的抗病毒活性，并用于治疗被副黏液病毒 (paramyxovaridae)(例如呼吸道合另包病毒)、正黏液病毒 (orthomyxovaridae)(例如流行性感冒病毒A、 B和C)以及疱渗病毒(例 如单纯疱渗病毒)感染的包括人在内的温血动物(美国专利5,211 ;944)。 Romanczyk Jr.等公开了包含DP为3-11的原花青素^f氐聚物和合适载体 的抗肿瘤组合物(美国专利5,554,645)。 Romanczyk Jr.等还公开了 DP 为5-12的原花青素低聚物用作抗氧化剂(美国专利5，891,905)。Schmitz 等公开了将DP为2-18的可可原花青素低聚物与乙酰水杨酸用于抗血 小板疗法(美国专利6,524,630)。因为其结构复杂性和性质多样性，原花色素的分析记载很 丰富(Santos-Buelga等，"多酚分析方法(Processes in Polyphenol Analysis)",皇家化学会(Royal Society of Chemistry) ， Cambridge, 2003 ， 267页)。Lea描述了将正相高效液相色谱(NP-HPLC)用于原花青素分 析(Lea等，食品和农业科学杂志(J. Sci. Food and Agriculture) (1979) 30:833)，并还观察到利用Sephadex LH-20柱在等度条件得到了其中 较大低聚物较较小低聚物保留时间更长的洗脱顺序(Ani. J. Enology and Viticulture (1979) 30:289)。 Wilson等公开了利用四氢呋喃-己烷-乙酸/曱酸-异丙醇梯度流动相通过氰基柱基于DP实现了苹果汁原花 青素的部分分离(食品农业科学(Sci. Food. Agric.) (1981) 32:257)。已在二氧化硅固定相上实现了原花青素低聚物分离和分 析的明显提高。见Rigaud等，Chromatogr. (1993) 654:179; Cheynier 等,酶学方法(Processes in Enzymology) (1999) 299; Natsume等，Biosci. Biotechnol. Biochem. (2000) 64:2581 。已实现五聚体(DP-5)原花青素低 聚物的分析。Hammerstone等公开了在分析未发酵的脱脂可可豆的过 程中改进该方法导致了单体至十聚体分离度的提高。见农业和食品化 学杂志(J. Agric. and Food Chem.) (1999) 47:490。 Gu等还公开了进一 步改进导致了十聚体(DP-10)的洗脱，以及整体峰形和分辨率的改善。 见农业和食品化学杂志(J. Agric. and Food Chem.) (2002)50:4852)。这些HPLC方法使用由二氯甲烷-甲醇-乙@^/曱酸-水组成 的梯度流动相，以实现直至五聚体的原花青素低聚物的分离，另一分 离苹果原花青素的方法利用己烷-曱醇-乙酸乙酯或己烷-丙酮，经二氧 化硅柱分离(Yanagida等，J. Chromatogr. A (2000) 890:251)。然而，包括Gu等的方法在内的现有HPLC方法具有不少 缺点。第一，使用氯化溶剂例如二氯甲烷会引起安全问题。当来自大 规模系统的离析的流分可能用于进一 步生物研究时，这尤其是个问 题。已知接触二氯甲烷会影响皮肤、眼睛、中枢神经系统(CNS)和心 血管系统，短期接触可导致疲劳、乏力、嗜睡、头晕、四月支麻痹、皮
月夫发麻、恶心以及刺激皮肤和眼睛。长期接触二氯曱烷则与试验动物 的肺癌、肝癌和胰腺癌相关。二氯甲烷也是可导致出生缺陷的诱变剂， 如果妇女在怀孕过程中与其接触。已知另 一种常用的HPLC溶剂四氢呋喃(THF)剌激人体受 试体的眼睛，以及粘膜和胃肠道。过度接触THF可导致咳嗽、呼吸 急促、头昏、中枢神经系统(CNS)抑制、中毒和虚脱。用于分离原花青素低聚物的现有HPLC方法的其他问题 包括利用二氧化硅作为固定相时与原花青素的正相(NP)分离相关的 一贯性问题，即柱与柱之间的易变性。低聚物常常出现峰强度降低情 况或者完全检测不到，因为其可能被吸附在二氧化石圭表面。为原花青 素NP分离中峰形所需，在流动相中使用水，进一步降低了柱间重现 性。此外，从实际角度出发，大部分用于分离各种黄烷-3-醇(包括原 花青素低聚物)的现有HPLC方法涉及使用三或四元流动相，因此超 出了不具备复杂的四元HPLC泵的分析实验室的能力范围。需要基于DP识别单独的极性质子低聚物的改进方法，以 及基于DP分离和回收单独的极性质子低聚物的方法，所述方法避免 使用危险的和对环境有害的溶剂，改善了单独的极性质子低聚物的分 离和回收，适用于仅装备有普通两元HPLC泵的分析实验室，适用于 以制备规才莫回收特定低聚物。
发明概述本发明提供了用于分离和洗脱单独的4及性质子单体和/或 低聚物的改进方法。所述方法包括以下步骤(i)将包含单体和/或低 聚物的液体样品引入用极性键合固定相填充的液相色谱(LC)柱；(ii) 通过使包含基本由极性非质子溶剂组成的A相和基本由极性质子溶 剂组成的B相的两元流动相流过所述柱子，基于聚合度分离所述单独 的单体和/或低聚物；和(iii)洗脱包含所述单体和/或低聚物的一个或
多个单独的流分。在某些优选实施方案中，可通过干燥或其他常规方
法回收一种或多种洗脱的单独的单体和/或低聚物以用于食品、药用 食品、营养品或药品。可回收洗脱的单独的单体和/或低聚物以在其 他分离中用作标准品。优选引入LC柱的液体样品中提取物的量大于10毫克。 更优选，提取物的量大于IOO毫克。更优选，提取物的量大于l克。所述极性4定合固定相可为二醇相、甘油相、氨基相、氰基 相、三甲基甲硅烷基相、二甲基曱硅烷基相、丙基相、丁基相、戊基 相、己基相、苯基相、卣化相或硝基相。优选固定相为二醇相或甘油 相。在两元流动相中(优选其为含水的)，所述极性非质子溶剂 可为乙腈、丙酮、环己酮、甲基乙基酮、甲基叔丁基醚、二乙醚、二 曱醚、乙酸甲酯、乙酸乙酯和硝基曱烷中的任意溶剂，所述极性质子 溶剂可为甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇和异丁醇中的任意溶剂。A相中极性非质子溶剂的比例可高达100%体积，B相中 极性质子溶剂的比例可高达100%体积。A相和B相的剩余部分可为 任意无机或有机酸和/或水。优选，A相中极性非质子溶剂和B相中极性质子溶剂的比例大于50%体积。更优选，极性非质子溶剂(A相) 和极性质子溶剂(B相)的比例大于90%体积。在优选实施方案中，A 相中极性非质子溶剂为约98%体积乙腈，B相中极性质子溶剂为约 95%体积甲醇。优选极性键合固定相的颗粒大小为约3 ium-约10 |iim。优 选LC柱的直径为至少十(10)毫米。本发明还提供了用于基于聚合度分离和洗脱单独的极性 质子单体和/或低聚物的系统。所述系统包括用极性键合固定色谱相 填充的LC柱；和用于洗脱包含所述单体和/或低聚物的一个或多个单 独流分的两元流动相，其中所述流动相包含基本由极性非质子溶剂组 成的A相和基本由极性质子溶剂组成的B相。所述极性键合固定相可为二醇相、甘油相、氨基相、tt 相、三甲基甲硅烷基相、二曱基甲硅烷基相、丙基相、丁基相、戊基 相、己基相、苯基相、由化相和硝基相中的任意相。优选极性4定合固 定色谱相为二醇相或甘油相。还优选极性键合固定色谱相的颗粒大小 为约3 pm-约10 imi。优选柱子的直径为至少十(10)毫米。在两元流动相中，A相中极性非质子溶剂可为乙腈、丙酮、 环己酮、甲基乙基酮、甲基叔丁基醚、二乙醚、二甲醚、乙酸甲酯、 乙酸乙酯和硝基甲烷中的任意溶剂。B相中极性质子溶剂可为曱醇、 乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇和异丁醇中的任意溶剂。用于该系统的合适极性质子单体和/或低聚物包括原花色 素、可水解的单宁、寡糖、寡核苷酸、肽、丙烯酰胺、聚山梨醇酯、 聚酮、泊洛沙姆、聚乙二醇、聚氧乙烯醇和聚乙烯醇。其中极性质子 单体和/或低聚物为原花色素，其可为原芽菜定、原木犀草定、原五 羟黄酮、原花葵素、原花翠素、原桂金合欢定、原四羟黄酮、原刺槐 定、proteracacinidins和/或原黑金合欢素。在优选实施方案中，单体 为表儿茶素和/或儿茶素，低聚物为其原花青素低聚物。
A相中极性非质子溶剂的比例可高达100%体积，B相中 极性质子溶剂的比例可高达100%体积。A相和B相的剩余部分可为 任意无机或有机酸和/或水。优选，A相中极性非质子溶剂和B相中 极性质子溶剂的比例大于50%体积。更优选，极性非质子溶剂(A相) 和极性质子溶剂(B相)的比例大于90%体积。在优选实施方案中，A 相中极性非质子溶剂为约98%体积乙腈，B相中极性质子溶剂为约 95%体积甲醇。
和离析黄嘌呤方法。所述方法包括以下步骤(i)将包含黄嘌呤和极 性质子单体和/或低聚物的液体样品引入用极性键合固定色谱相填充 的液相色谱(LC)柱；(ii)通过使基本由极性非质子溶剂组成的等度流 动相流过所述柱子，将黄噪呤从单体和/或低聚物中分离出来；和(iii) 洗脱包含黄噪呤的一个或多个单独流分。优选黄嘌^冷为咖啡因和/或 可可碱。在优选实施方案中，所述液体样品为极性脱脂可可提取物。 在某些优选实施方案中，可通过干燥或其他常规方法回收洗脱的单独 的黄噪呤以用于食品、药用食品、营养品或药品。也可回收洗脱的单
独的黄嘌呤以在其他分离中用作标准品。所述极性键合固定相可为二醇相、甘油相、氨基相、M 相、三曱基曱硅烷基相、二曱基曱硅烷基相、丙基相、丁基相、戊基 相、己基相、苯基相、卣化相或硝基相。优选固定相为二醇相或甘油相。在等度流动相中(优选其为含水的)，优选极性非质子溶剂 为乙腈。优选等度流动相中极性非质子溶剂的比例为至少90%体 积。流动相的剩余部分可为任意无机或有机酸和/或水。在优选实施 方案中，等度流动相中的极性非质子溶剂为约99%体积乙腈。
和离析黄噤呤的系统。所述系统包括用极性键合固定色谱相填充的液
相色谱柱；和用于洗脱包含黄噤呤的一个或多个单独流分的等度流动
相，其中所述流动相基本由极性非质子溶剂组成。所述极性键合固定相可为二醇相、甘油相、氨基相、氰基 相、三曱基曱硅烷基相、二甲基甲硅烷基相、丙基相、丁基相、戊基 相、己基相、苯基相、卣化相和硝基相中的任意相。优选固定相为二 醇相或甘油相。也优选固定相的颗粒大小为约3 nm-约10 iiim。优选 柱子的直径为至少十(10)毫米。在等度流动相中，优选极性非质子溶剂为乙腈。优选等度 流动相中极性非质子溶剂的比例大于90%体积。剩余部分可为任何无 机或有机酸和/或水。在优选实施方案中，等度流动相中的极性非质 子溶剂为约99%体积乙腈。本发明还提供了用于分离和洗脱黄噪呤和单独的极性质 子单体和/或低聚物的方法。所述方法包括以下步骤(i)将包含黄嘌
呤和极性质子单体和/或低聚物的液体样品引入用极性键合固定色谱 相填充的液相色谱柱；(ii)通过使基本由极性非质子溶剂组成的等度 流动相流过所述柱子并洗脱包含黄嘌呤的一个或多个单独流分，将黄 噪呤从单体和/或低聚物中分离出来；(iii)接着通过使包含基本由极
性非质子溶剂组成的A相和基本由极性质子溶剂组成的B相的两元 流动相流过所述柱子，基于聚合度分离单独的单体和/或低聚物；和(iv) 洗脱包含所述单体和/或低聚物的一个或多个单独流分。在某些优选 实施方案中，可通过千燥或其他常规方法回收洗脱的黄嘌呤和/或一 种或多种洗脱的单独的单体和/或低聚物以用于食品、药用食品、营 养品或药物。也可回收洗脱的黄噤呤和/或洗脱的单独的单体和/或低 聚物，在其他分离中用作标准品。优选黄嘌呤为咖啡因和/或可可碱。所述单体和/或低聚物 可为原花色素、可水解的单宁、寡糖、寡核苷酸、肽、丙烯酰胺、聚 山梨醇酯、聚酮、泊洛沙姆、聚乙二醇、聚氧乙烯醇和聚乙烯醇。所 述极性键合固定相可为二醇相、甘油相、氨基相、氰基相、三甲基甲
硅烷基相、二甲基甲硅烷基相、丙基相、丁基相、戊基相、己基相、 苯基相、卣化相或硝基相。以下具体描述公开了这些和其他目的以及实施方案，或者 从以下具体描述中显而易见这些和其他目的以及实施方案。
附图简述
图1单体黄烷-3-醇以及通过碳-碳C4—C8和C4—C6键 而连接在一起的原花青素低聚物的结构。图2来自未发酵的可可豆的原花青素的二醇相HPLC荧 光图。图3分离来自越南肉桂(cinnamomum loureirii)丙酮緩冲 液提取物的极性质子单体和低聚物的二醇柱HPLC图。图4原花青素的HPLC色谱图，利用Lichrosphere 二氧 化硅(Uchrosphere Silica)(下)和Develosil 二醇(Develosil Diol)(上)作为
固定相。图5原花青素低聚物基于聚合度的HPLC分析中二醇固 定相相对二氧化硅固定相峰面积增加百分比图。
图6 CP提取物的制备相HPLC图。图7收集自CP提取物HPLC分离的单独流分的FLD图， 对应DP=l-7的低聚流分。图8用于分离来自CP提取物的咖啡因和可可碱的制备 系统的LC色谱图。图9来自半制备二醇分离的离析流分的HPLC分析色谱图。
发明详迷本发明公开了基于聚合度分离和离析极性质子单体和/或 低聚物的改进方法，所述方法利用具有两元流动相的基于二醇的LC 系统洗脱包含单独的极性质子单体和/或低聚物的 一个或多个单独流 分，还公开了用于相同目的的系统。图1示出了单体黄烷-3-醇和通过C4—C8和C4—C6键而 连接在一起的原花青素低聚物的结构。本发明改进方法和系统使用基于二醇的固定相LC柱和两 元流动相，所述流动相包含A相(乙腈和醋酸(CH3CN:H0Ac)之比为 98:2(v/v)的混合物)和B相(甲醇、水和醋酸(CH30H:H20:HOAc)之比 为95:3:2(v/v/v)的混合物)。其解决了更好地分离单独的低聚物，尤其 是较高级低聚物的问题。图4比较了利用二醇固定相(上)和二氧化硅 固定相(下)所得的色谱图。如其所示，二醇固定相实现了单独的低聚 物的更好分离，尤其是实现了 DP为7或更大的低聚物更好分离。应 当理解的是所述改进方法较现有方法更有用，因为其可使用更多种类 溶剂(包括水)，并可用于仅装备有两元LC泵的实验室。另一个益处 在于其能在单次LC运行中分析除原花青素外的其他化合物(即其他 黄酮化合物、咖啡因和可可石咸)，尤其是当与质谱(LC-MS)结合时。本 发明还公开了用于分离咖啡因和可可碱的方法，所述方法使用所述改 进方法的修改形式。下文更具体描述所述方法和系统。虽然具体7/Hf的方法和 系统涉及可可原花青素，本领域普通技术人员应当理解的是所述公开 的方法和系统适于分离任何极性质子单体和/或低聚物，包括但不限 于其他原花色素(例如原芽菜定、原木犀草定、原五羟黄酮、原花葵 素、原花翠素、原桂金合欢定、原四羟黄酮、原刺槐定 (prorobinetindins)、 protemcacinidins和原黑金合欢素)、可水解的单宁、 寡糖、寡核苷酸、肽、丙烯酰胺、聚山梨醇酯、聚酮、泊洛沙姆、聚 乙二醇、聚氧乙烯醇和聚乙烯醇。其他包含极性质子单体和/或低聚 物的物质包括花生红衣、肉桂、蓝莓、苹果、高粱、山楂、蔓越橘和 葡萄。此外，所述公开的方法和系统适于分离糖聚合物，例如麦芽糖 (maltosaccharide)、环糊精、N-乙酰所有溶剂(二氯曱烷、乙腈、甲醇和醋酸)均为色谱级，购 自Fisher Scientific (Fairlawn, New Jersey)。乙醇为USP食品级，购自 Sigma-Aldrich (Milwaukee, Wisconsin) 。 ？K利用来自Millipore (Bedford, Massachusetts)的Milli-Q-水純化系统去离子化。样品制备CP提取物。可可多酚(CP)提取物通过旨在减 少可可原花青素降解的多步法制备。收获可可豆，洗去浆状物，千燥。 在环境条件下以压榨器按压干燥的可可豆，以去除可可脂。然后用乙 醇:水(70:30v/v)研磨和提取油饼。离心去除固体。减压蒸发提取液去 除乙醇，最后喷雾干燥。样品制备来自可可籽的CP提取物。将新鲜的未发酵的 可可籽(30 g)冷冻干燥(16.9 g)。用己烷使冷冻干燥的可可籽(10.2 g)脱 脂，研磨脱脂可可豆小样(6.3 g)，用40mL丙酮:水:醋酸(70:29.5:0.5， v/v/v)超声(10分钟，50。C)提取三次。减压旋转蒸发去除合并提取液 中的丙酮。冷冻干燥剩余液体得到紫红色残留物(1.13 g)。正相高效液相色谱质谱(NP-HPLC-MS)分析CP提取物和 纯化的低聚物。可可提取物中的原花青素低聚物和下文所述制备系统 所得原花青素低聚流分的分离和表征利用NP-HPLC-MS进行。在装 有自动取样器、四元HPLC泵、柱加热器、二极管阵列检测器和荧光 ^r测器的Agilent 1100 HPLC系统上进行分离。所述HPLC与装有 API-ES电离室的HP Series 1100质量选择检测器(型号G1946A)界面 相连。所4吏用的柱子为购自 Phenomenex(Torrance, California)的 DevelosilDiol(250x4.6mml.D.， 5p颗粒大小)。两元流动相由(A)乙 腈:醋酸(98:2， v/v)和(B)甲醇:水:醋酸(95:3:2， v/v/v)组成。利用线性梯 度(流动相)在30。C以0.8 mL/分钟流速如下进行分离0-35分钟， 0-40%B; 35-40分钟，40%B等度；40-45分钟，40-0%B，接着5分 钟再平衡时间。通过荧光检测(FLD)(激发波长二276nm，发射波长 二316nm)监控洗脱液。利用MS法和自Hammerstone等，丄Agric. and Food Chem. (1999) 47:490修改的参数表征提取物和純化的流分，通过
引用将其公开的内容结合到本文。电离试剂通过正好在质谱前的LC 洗脱液液流中的T形物加入，并通过LC泵输送。用于在正离子才莫式 分41"的条件包括以0.05 mL/分钟流速引入0.05 M NaCl以有助于电 离，3.5kV毛细管电压，100 V裂解器(fragmentor)电压，25psig喷雾 压力和350°C干燥气体温度。用于在负离子才莫式分析的条件包括1.5 M NH4OH作为緩冲剂，其流速为0.09 mL/分钟29分钟，然后0.05 mL/ 分钟。毛细管电压为3kV,裂解器电压为75V,喷雾压力为25psig, 干燥气体温度为350°C。MS分析忽略氢氧化铵的使用。将样品溶解在丙S同:水:醋 酸(70:29.5:0.5， v/v/v)或流动相中，注入前滤过0.45 jxm PTFE注射过CP提取物的对比NP-HPLC在Lichrosphere 二氧化硅和 Develosil 二醇固定相上进行。CP流分的分离在Lichrosphere Silica和 Develosil Diol上并在Adamson等,J. Agric. and Food Chem. (1999) 47:4184所述色谱条件下进行。色谱系统为装有控温取样器、四元泵、 柱加热器和荧光检测器的Agilent 1100 Series HPLC系统。所使用的 4主子为Lichrosphere Silica(250 x 4.6 mm, 5 ji, 100人孑14圣)和Develosil Diol。色谱流动相由二氯甲烷(CH2Cl2)、甲醇(CH30H)和醋酸:水 (l:l)(HOAc:H20)组成。起始流动相条件为82%CH2C12、 14%CH3OH 和4%(HOAc:H20)。接着，使CH3OH在30分钟后增至28.4%, 50 分钟后为42.8%, 51分钟后为86.0%。在整个色谱运行中，HOAc:H20 比率保持恒定为4%。利用276 nm激发波长和316 nm发射波长进行 荧光检测。所有样品通过以下方法制备溶解在丙酮水醋酸 (70:29.5:0.5)中，然后滤过0.45 PTFE注射过滤器，随后HPLC注 入。CP提取物的制备型NP-HPLC。 Agilent 1100系列制备泵 与HP 1050 UV检测器和Kipp and Zonen记录仪相连。利用购自 Phenomenex(Torrance, CA)的Develosil Diol(300 x 50 mm I.D.， 100 jim
颗粒大小)柱实现原花青素的制备分离。流动相由溶剂
A(CH3CN:HOAc, 99:1 v/v)和B(CH3OH:H20:HOAc, 95:4:1 v/v/v)组成， 使用0-30%B线性梯度35分钟，接着等度30分钟，最后提高至80%B。 再平衡时间为10分钟。将流速设为55 mL/分钟，柱温为室温(23 ± 2°C)。将检测器设为280 nm。上柱利用装有2 mL注样环的手动进样 器Rheodyne阀(Rheodyne Valve)7725型进行。将CP提取物溶解在流 动相中，离心，注入前滤过0.45 pm PTFE注射过滤器。原花青素的半制备分离也利用购自Phenomenex(Torrance, CA)的Develosil Diol(250 x 21.5 mm I.D., 100 pm颗粒大小)柱实现。流 动相由上述相同组合物组成。0-30%B线性梯度45分钟，接着等度 20分钟，最后提高至85%B以从柱中洗去任何剩余的残留物。该柱 子的流速为15mL/分钟。图2示出了未发酵的脱脂可可籽提取物的色谱图。标识 2-14表示峰中原花青素的聚合度。化合物依据其聚合度被洗脱，并利 用LC-MS表征为黄烷-3-醇单体和至十四聚体(DP-14)的低聚物。如 Gu等所公开，未发酵可可黄烷-3-醇单体和低聚物的成分仅由(-)-表儿 茶素和(+)_儿茶素构成。见j. Agric. and Food Chem.(2003) 51:7513。 与本文所述色谙分离相一致，Gu等离析出了十聚体峰后的由平均DP 为14的原花青素组成的原花青素聚合物。(Id.)。图3示出了利用改 进的二醇固定相和两元流动相法，基于DP,从越南肉桂丙酮緩冲液 提取物中进行单体和低聚物的类似分离。与现有方法对比。为评价Develosil Diol相相对于 Lichrosphere Silica的色谱性能，在Adamson等所述色谱条件下(J. Agric. and Food Chem. 47 (1999) 4184)对各柱子进行评测。当在二氧化 硅上进行测试时，用于二醇相的新色谱条件(即二醇为固定相，乙腈 代替两元流动相中的二氯甲烷)未实现原花青素的分离。典型的 Lichrosphere Silica相和Develosil Diol相色谱图见图4。该色镨图表明 了在相同色谱条件下保留性质的明显区别。该键合的二醇相仅针对原
花青素单体即(-)-表儿茶素和(+)-儿茶素表现出了类似的保留性质。该 键合的二醇相针对二聚体至十聚体表现出了更强的保留性质，保留时
间随聚合度提高而增加。在相同条件下十聚体流分的保留时间较
Lichrosphere Silica相所观察到的保留时间长约50%。与二醇相更强的 保留性质相一致，还观察到分离种类(spedation)的增加。这从整个色 谱图清楚可见，甚至影响了在10分钟的单体区域。二醇相基本得到 了(-)-表儿茶素和(+)-儿茶素的基线分离，而二氧化硅相表现出了明显 的共洗脱。就所述保留能力更强的键合相而言，该分离种类的增加并 非出人意料的结果。然而，比较二醇和二氧化硅固定相间的峰面积却 得到了出人意料的结果二醇相相对于二氧化硅相DP=2至DP=10 的总峰面积增加。该总峰面积增加的程度随分子量增大而变大。如图 5所示，这些观察结果很可能是吸附现象降低的结果。考虑到更长的 保留时间通常产生面积更小的更宽峰形，该观察结果尤其令人振奋。制备规^莫。扩大色谱法的规模引起了人们的兴趣，不仅是 为得到用于进一步分析进展的标准品，还为通过产生"纯净的"低聚流 分，用于随后的生物学研究，以阐明这些酚类分子所利用的不同生理 机理。虽然大部分基于DP分离原花青素的现有分析方法有效，并已 常规应用(见例如Rigaud等，Chromatogr.(1993)654:179; Hammerstone 等，J. Agric. and Food Chem. (1999)47:490;和Gu等，J. Agric. and Food Chem. (2002)50:4852),但流动相的组成(0 2(:12, CH3OH， HOAc)严 重阻碍了扩大该方法的规j莫。本文所述二醇固定相法的 一个主要优势在于其能扩大所 述方法的规3莫，而不必过多地关注安全问题和处理费用。由于溶剂选 一泽和用于分析规3莫的相对简单的两元流动相梯度，只需改变梯度和流
速，所述方法即可转移至半制备(250x21.5 mm)规模，然后转移至制 备(300 x 50 mm)^Mt HPLC系统。使用由乙腈、曱醇和醋酸组成的流动相，利用制备 Diol-Develosil柱(300 x 50 mm)实现原花青素低聚物的分离。在280 nm监控洗脱液的吸光度。在70分钟流程中观察到九个峰。图6示出了 记录仪所得图形。其中T和C指黄噤呤，分别是可可碱和咖啡因。 编号的峰指示DP。溶剂沸点低且易去除，从而有助于低聚物的离析。 此外，酸含量更少。该方法与Adamson等的方法(J. Agric. and Food Chem. (1999)47:4184)(其中在使用二氯甲烷-甲醇-醋酸-水梯度的二氧化硅柱 上进行可可原花青素低聚物的分离)成了鲜明对比。在使用500x20 mm Supelcosil LC-Si柱的单次运行(180分钟)中，Adamson等用了将 近4.5升二氯曱烷作为流动相的一部分。此外，Adamson等需要多个 提取过程以离析用作参考物质的低聚流分。与Sephadex对比。虽然可上载至制备二醇柱的原料的理 论上限值小于可上载至600 x 100 cm Sephadex LH-50柱的原料的理 论上限值(分别为 4 g对25 g CP)，但就溶剂使用、时间(二醇70分钟 运行相比于Sephadex几天)和分辨率而言存在着明显改进。此外，制 备二醇系统可在收集过程中检测和监控，进而得到如图7所示"更纯
净的，，流分。现在，是CP提取物在流动相中的溶解性限制了一次注入 (2 mL注样环体积)中原料量的多少。样品制备涉及将CP提取物溶解 在流动相(A:B, 25:75 v/v)中。在这些条件下，形成白色沉淀(鉴定为 黄噤呤的混合物)和树脂材料。提高溶剂和固体的比率并没有改变这 些结果。离心后，分离上清液并注入柱子。加入乙醇溶解树脂材料。 基于分析规4莫的方法，分析该溶解的材料，得到DP高达14的流分。 然而，用引起沉淀的流动相将该可溶于乙醇的材料注入柱子，对于大 规模制备工作是不理想的。现阶段正在对用于样品制备的各种方法 (通过提取预纯化)进行研究以提高每个注样体积的注样量，进而提高 效率。分析离析峰(HPLC/FLD)有助于评价流分的纯度，所有流 分的纯度均大于95%。图7示出了自CP提取物的制备型HPLC分离 收集的单独的流分的FLD图，该图对应于DP4至DP二7的低聚流分。
利用负离子模式MS电喷雾电离对单独的低聚流分进行分子量归属。
这些数据与Hammerstone等，J. Agrk. and Food Chem. (1999)47:490 的现有文献报道一致。图6中的数字(即l-7)对应于低聚流分的DP。 利用正离子才莫式LC-MS ESI将标有T和C的最初两个峰识别为黄噤 呤，即可可碱(T)和咖啡因(C)。与二醇相更强的保留性质相一致，还观察到分离种类的增 加。这从整个色谱图清楚可见，并影响了在10分钟的单体区域。二 醇相基本得到了 (-)-表儿茶素和(+)-儿茶素的基线分离，而二氧化硅相 表现出了明显的共洗脱。比较二醇和二氧化硅固定相间的峰面积却得到了出人意 料的结果二醇相相对于二氧化硅相DP=2至DP=10的总峰面积增大。 如图5所示，增加的程度随分子量增大(即DP)而变大。考虑到更长的 保留时间通常产生面积更小的更宽峰形，该观察结果尤其令人振奋。本领域普通技术人员应当理解的是虽然上述实施例使用 二醇固定相，但其他极性键合固定色谱相也可用于获得相同结果。其 他合适固定相包括但不限于甘油相、氨基相(优选丙胺相)、氰基相(优 选氰基丙基相)、三甲基曱硅烷基相、二甲基曱硅烷基相、丙基相、 丁基相、戊基相、己基相、苯基相、卤化相或硝基相。此外，虽然公 开了 5 pm颗粒大小，但本领域普通技术人员应当理解的是具体就 二醇固定相而言，任何市售的颗粒大小均可用于所述分离。目前市售 的二醇颗粒大小包括3、 5和10pm。类似地，虽然上述实施例使用乙腈和曱醇两元流动相，但 两元流动相可为任何才及性非质子溶剂(A_相)和任何极性质子落齐。(B相) 的组合。除乙腈外，用作(A)相的合适极性非质子溶剂包括丙酮、环 己酮、甲基乙基酮、甲基叔丁基醚、二乙醚、二曱醚、乙酸甲酯、乙 酸乙酯和硝基曱烷。除曱醇外，用作(B)相的合适极性质子溶剂包括 乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇和异丁醇。应当理解的是A相中极性 非质子溶剂和B相中极性质子溶剂的比例可为0-100%体积，优选大
于50%体积，更优选大于90%体积。A相和B相的剩余部分可为任 意无^/L或有机酸(例如醋酸)和/或水。除基于DP分离极性质子低聚物外，已发现改变用于分离 原花青素低聚物(基于DP)的流动相梯度能得到脱咖啡因和脱可可碱 的可可多酚提取物。就回收而言开始为1 g(40。/oCP-即400mg原料)， 可回收134 mg低聚物(DP〉2)。回收单体的质量为39 mg。从可可多酚分离黄嘌呤(咖啡因和可可碱，在使用 Develosil Diol 300 x 50 mm， 100 pm柱(固定相)的Agilent 1100 HPLC 系统上于室温(即-25'C)下进行。两元流动相的组成如下(A)相包含 乙腈:醋酸99:l(v/v)， (B)相包含甲醇:水:醋酸95:4:l(v/v/v)。将半制备 操作的流速设为30mL/分钟。利用如下线性梯度进行分离0分钟， 0%B; 15分钟，0%B; 20分钟，100%B; 30分钟，100%B。利用280 nm UV检测和荧光进行分析。图8示出了制备HPLC系统产生的LC图。峰1为可可碱， 峰2为咖啡因，峰3为单体(黄烷醇)，峰4为DP〉1的低聚物。保持
最初的流动相条件15分钟(即0%B相，100。/。A相)，首先洗脱可可石威、 咖啡因和单体。调节流动相至高极性以迅速回收CP低聚物(DP〉1)。图9显示了流分的分析结果。图(a)为CP提取物的荧光检 测结果。图(b)为相同原料的UV检测结果。已知黄嘌p令基本不发出荧 光，CP在UV检测中不产生强信号。因此利用两种4全测;漢式得到更 全面的图。图(c)示出了从CP提取物去除的黄嘌呤的UV图。虽然没 有显示可可碱和咖啡因单独流分的分析，但其可被分离和物理离析。 此外，可分离和离析单体与黄嘌呤。见图(d)。图(e)示出了去除单体和黄嘌呤后CP提取物的UV图。显 而易见的是样品仅包含DP》的低聚物。虽然就某些特定实施方案对本发明进行了描述，但应当理 解的是本领域熟练技术人员可在本发明范围内作出许多改进和变化。 因此，通过所附权利要求对其进行扩展以覆盖可能落入本发明实际主 旨和范围内的所有这些改进和变化。
权利要求
1.一种用于分离和洗脱选自以下的单独的极性质子单体和/或低聚物的高效液相色谱法原花色素、可水解的单宁、寡糖、寡核苷酸、肽、丙烯酰胺、聚山梨醇酯、聚酮、泊洛沙姆、聚乙二醇、聚氧乙烯醇和聚乙烯醇，所述方法包括以下步骤a.将包含所述单体和/或低聚物的液体样品引入用选自二醇相、甘油相、氨基相、氰基相、三甲基甲硅烷基相、二甲基甲硅烷基相、丙基相、丁基相、戊基相、己基相、苯基相、卤化相和硝基相的极性键合固定相填充的液相色谱柱；b.使包含基本由极性非质子溶剂组成的A相和基本由极性质子溶剂组成的B相的两元流动相流过所述柱子，以基于聚合度分离所述单独的单体和/或低聚物；和c.洗脱包含所述单体和/或低聚物的一个或多个单独流分。
2. 权利要求1的方法，其中所述原花色素选自原芹菜定、原木 犀草定、原五羟黄酮、原花葵素、原花青素、原花翠素、原桂金合欢 定、原四羟黄酮、原刺槐定、protemcacinidins和原黑金合欢素。
3. 权利要求1的方法，其中所述极性非质子溶剂选自乙腈、丙 酮、环己酮、甲基乙基酮、曱基叔丁基醚、二乙醚、二甲醚、乙酸甲 酯、乙酸乙酯和硝基甲烷，且其中所述极性质子溶剂选自甲醇、乙醇、 正丙醇、异丙醇、正丁醇和异丁醇。
4. 权利要求1的方法，其中所述包含所述单体和/或低聚物的液 体样品为脱脂可可提取物，其中所述单体为表儿茶素和/或儿茶素， 且所述低聚物为其原花青素低聚物。
5. 权利要求l的方法，其中所述固定相为二醇相或甘油相。
6. 权利要求l的方法，其中所述A相和B相为含水相。
7. 权利要求1的方法，其中A相中极性非质子溶剂的比例高达 100%体积，且其中B相中极性质子溶剂的比例高达100。/。体积。
8. 权利要求7的方法，其中A相中极性非质子溶剂的比例大于 50%体积，且其中B相中极性质子溶剂的比例大于50%体积。
9. 权利要求8的方法，其中A相中极性非质子溶剂的比例大于 90%体积，且其中B相中极性质子溶剂的比例大于90%体积。
10. 权利要求9的方法，其中A相中极性非质子溶剂包含约98% 体积乙腈，且其中B相中极性质子溶剂包含约95%体积甲醇。
11. 权利要求l的方法，其中所述固定相的颗粒大小为约3 pm画 约10 ixm。
12. —种用于从极性质子单体和/或低聚物中分离和离析黄噪呤 的高效液相色镨法，所述方法包括以下步骤a. 将包含黄嘌呤和极性质子单体和/或低聚物的液体样品？I入用 选自二醇相、甘油相、氨基相、氰基相、三曱基甲硅烷基相、二甲基 甲硅烷基相、丙基相、丁基相、戊基相、己基相、苯基相、卤化相和 硝基相的极性键合固定色谱相填充的液相色谱柱；b. 使基本由极性非质子溶剂组成的等度流动相流过所述柱子， 以从所述单体和/或低聚物中分离出黄噪呤；和c. 洗脱包含黄嘌呤的一个或多个单独流分。
13. 权利要求12的方法，其中所述黄嘌呤为咖啡因和可可碱。
14. 权利要求12的方法，其中所述液体样品为脱脂可可提取物。
15. 权利要求12的方法，其中所述固定相为二醇相或甘油相。
16. 权利要求12的方法，其中所述等度流动相为含水相。
17. 权利要求12的方法，其中所述极性非质子溶剂为乙腈。
18. 权利要求12的方法，其中等度流动相中极性非质子溶剂的 比例为至少90%体积。
19. 权利要求18的方法，其中等度流动相中的极性非质子溶剂 基本由约99%体积乙腈组成。
20. —种用于分离和洗脱黄噤呤和单独的极性质子单体和/或低 聚物的高效液相色谦法，所述方法包括以下步骤a. 将包含黄嘌呤和极性质子单体和/或低聚物的液体样品《1入用 选自二醇相、甘油相、氨基相、氰基相、三曱基甲硅烷基相、二甲基 曱硅烷基相、丙基相、丁基相、戊基相、己基相、苯基相、囟化相和 硝基相的极性键合固定色谱相填充的液相色谱柱；b. 使基本由极性非质子溶剂組成的等度流动相流过所述柱子， 以从所述单体和/或低聚物中分离出黄噤呤；c. 洗脱包含黄嘌呤的一个或多个单独流分；d. 使包含基本由极性非质子溶剂组成的A相和基本由极性质子 溶剂组成的B相的两元流动相流过所述柱子，以基于聚合度分离所迷 单独的单体和/或低聚物；和e. 洗脱包含所述单体和/或低聚物的一个或多个单独流分。
全文摘要
本发明公开了用于基于聚合度分离和离析单独的极性质子单体和/或低聚物的方法。将包含单体和/或低聚物的液体样品引入用极性键合固定色谱相填充的液相色谱(LC)柱。通过两元流动相洗脱使所述单独的单体和/或低聚物分离。所述单体和/或低聚物可为原花色素、可水解的单宁、寡糖、寡核苷酸、肽、丙烯酰胺、聚山梨醇酯、聚酮、泊洛沙姆、聚乙二醇、聚氧乙烯醇或聚乙烯醇。所述两元流动相包含基本由极性非质子溶剂组成的A相和基本由极性质子溶剂组成的B相。本发明还公开了用于分离和离析黄嘌呤(例如咖啡因和可可碱)的方法。将包含黄嘌呤和单体和/或低聚物的液体样品引入用极性键合固定色谱相填充的LC柱。通过等度流动相洗脱分离黄嘌呤，并洗脱单独的流分。本发明还公开了用于分离和离析黄嘌呤合极性质子单体和/或低聚物的方法。在该方法中使用上述相。
文档编号B01D15/08GK101355995SQ200680044033
公开日2009年1月28日 申请日期2006年10月3日 优先权日2005年10月3日
发明者C·J·约翰逊, M·A·凯姆, R·J·罗宾斯 申请人:玛尔斯有限公司