一种稳定和富集生物介质中儿茶酚胺的方法

专利名称：一种稳定和富集生物介质中儿茶酚胺的方法
技术领域：
本发明属于临床医学检验和临床分析技术领域，具体来说，涉及一种稳定和富集生物介质中儿茶酚胺的方法。
背景技术：
儿茶酚胺都是重要的单胺类神经递质。儿茶酚胺含有邻苯二酚基苯结构，又名邻苯二酚胺，包括去甲肾上腺素、肾上腺素和多巴胺，主要分布于交感神经细胞、肾上腺髓质和中枢神经系统。儿茶酚胺是细胞体内传播神经冲动的重要递质，具有重要的生理功能，与神经活动、行为以及大脑皮层的醒觉和睡眠节律都有关系。例如，肾上腺素是哺乳动物和人类中枢神经重要的信息传递物质，是由肾上腺髓质分泌的一种儿茶酚胺递质。在生物体内， 肾上腺素控制着神经系统进行一系列的神经化学过程及生物反应。在应激状态、内脏神经刺激和低血糖等情况下，肾上腺髓质释放肾上腺素进入血液循环，促进糖原分解并升高血糖，促进脂肪分解，引起心跳加快。肾上腺素代谢障碍会引起其含量变化，从而导致某些疾病的发生。因此，准确测定生物介质中的单胺类神经递质含量，对基础研究和临床诊断都有重要的意义。目前，离体检测儿茶酚胺类神经递质，常用三羟基吲哚法、乙二胺缩合法、荧光法、 放射酶学法、高效液相色谱法、电分析化学法、毛细管电泳法、化学发光分析法和色质联用法。检测儿茶酚胺类神经递质的生物介质一般为血液、唾液、尿液和羊水等。这些生物样本中，儿茶酚胺类神经递质的含量较低，一般在200-500pg/mL。另一方面，这些生物样本中含有单胺氧化酶和氧位转甲基酶，儿茶酚胺的胺基和两个邻位的酚羟基易被单胺氧化酶和氧位转甲基酶降解。例如，尿样中的儿茶酚胺被单胺氧化酶作用，去氨基后代谢为香草扁桃酸、高香草酸和3-甲氧基-4羟基苯乙二醇等。因此，在分析检测前，常常对生物样品进行预处理，去蛋白或加入蛋白阻隔剂。例如，常在血液中加入蛋白脲，以阻止儿茶酚胺以去氨基形式被代谢，其后再富集、提纯、分离生物样品中的儿茶酚胺。儿茶酚胺的提取、分离常采用液液萃取法(LLE)和固相萃取法(SPE)。液-液萃取又称溶剂萃取或抽提。用溶剂分离和提取液体混合物中的组分的过程。在液体混合物中加入与其不相混溶(或稍相混溶)的选定的溶剂，利用其组分在溶剂中的不同溶解度而达到分离或提取目的。但液液分离存在特异性差及耗时多等缺点，在分离提纯上也有缺点。固相萃取技术基于液-固相色谱理论，采用选择性吸附、选择性洗脱的方式对样品进行富集、 分离、纯化，是一种包括液相和固相的物理萃取过程。SPE是利用选择性吸附与选择性洗脱的液相色谱法分离原理。较常用的方法是使液体样品通过吸附剂，保留其中被测物质，再选用适当强度溶剂冲去杂质，然后用少量溶剂洗脱被测物质，从而达到快速分离净化与浓缩的目的。也可选择性吸附干扰杂质，而让被测物质流出；或同时吸附杂质和被测物质，再使用合适的溶剂选择性洗脱被测物质。SPE装置由SPE小柱(常用C18小柱)和辅件构成。 提取、分离儿茶酚胺类物质通常使用C18小柱液固。例如，测定尿液和血液中柳丁氨醇，使用C18小柱提取后用高效液相色谱检测。虽然SPE小柱有许多优点(如有机溶剂用量少、安全、高效等)，但在使用C18小柱洗脱时，SPE固相提纯存在柱压大、流速慢和时间长等缺点。这极可能导致不稳定、易降解的儿茶酚胺在分离提纯过程中大量降解，并且影响最终的检测结果。由于液液萃取法和固相萃取法存在上述技术缺点，导致儿茶酚胺在分离提纯过程大量分解，故有效的富集方法对于儿茶酚胺含量的准确测量有着举足轻重的作用。

发明内容
技术问题本发明所要解决的技术问题是提供一种稳定和富集生物介质中儿茶酚胺的方法，该方法采用磁性纳米颗粒表面的磺化壳聚糖来稳定和富集生物介质中的儿茶酚胺，利用磁性纳米颗粒的磁分离功能，从生物介质中分离和洗涤儿茶酚胺，过程简单快速、成本低廉、富集率高。技术方案为解决上述技术问题，本发明稳定和富集生物介质中儿茶酚胺的方法， 其特征在于，该方法包括以下步骤10.制备表面包裹磺化壳聚糖的磁性纳米颗粒胶体溶液，该步骤包括步骤101、 102 和 103 101.制备磁性纳米颗粒，该步骤包括步骤1011、1012和1013 1011.将摩尔比为2 1的Fe3+和Fe2+投料用浓度为2mol/L盐酸溶液超声搅拌溶解三氯化铁，将盐酸和三氯化铁形成的混合溶液加入至反应釜中，通入氮气搅拌，形成三氯化铁盐酸溶液；再用浓度为2mol/L的盐酸溶液超声溶解硫酸亚铁，形成硫酸亚铁盐酸溶液；将硫酸亚铁盐酸溶液与三氯化铁盐酸溶液混合搅拌，形成混合铁盐溶液；1012.将质量百分比浓度为12. 5%的四甲基氢氧化铵水溶液加入步骤1011制备的混合铁盐溶液中，用蠕动泵搅拌，同时通入氮气；然后进行磁分离洗涤，得到黑色沉淀；1013.进行氧化和表面修饰首先，用2mol/L的盐酸溶液稀释步骤1012制得的黑色沉淀，并调节PH值为3，超声搅拌直至pH值稳定；其后，将盐酸溶液稀释黑色沉淀后所形成的溶液加入反应釜中进行油浴加热搅拌，反应体系温度为90°C，同时用空气泵鼓入空气， 进行氧化反应lh_5h，然后磁分离洗涤，从而制得磁性纳米颗粒；102.制备表面包裹2，3-二巯基丁二酸的磁性纳米颗粒胶体溶液，该步骤包括步骤 1021、1022 和 1023 1021.用蒸馏水稀释步骤101制备的位于反应釜中磁性纳米颗粒，形成磁性纳米颗粒胶体溶液，然后用盐酸溶液调节该磁性纳米颗粒胶体溶液的pH值为2. 7，超声搅拌直至PH值稳定；1022.按照磁性纳米颗粒与2，3- 二巯基丁二酸的摩尔比1_1. 5，称取2，3_ 二巯基丁二酸，将2，3- 二巯基丁二酸超声溶解于二甲基亚砜溶液中，然后将溶解了 2，3- 二巯基丁二酸的二甲基亚砜溶液加入步骤1021制得的pH值为2. 7的磁性纳米颗粒胶体溶液中，搅拌反应lh-5h ；1023.步骤1022的搅拌反应结束后，对步骤1022中溶有2，3_ 二巯基丁二酸和二甲基亚砜溶液的磁性纳米颗粒胶体溶液进行磁分离，形成含表面包裹2，3-二巯基丁二酸的磁性纳米颗粒的混合反应溶液；用四甲基氢氧化铵水溶液调节该混合反应溶液的PH为 10，超声直至PH稳定为10 ；然后将该混合反应溶液的pH值调回为7，进行定容透析，得到表面包裹2，3- 二巯基丁二酸的磁性纳米颗粒胶体溶液；
103.先包覆后磺化，制备表面包裹磺化壳聚糖的磁性纳米颗粒胶体溶液该步骤包括步骤1031、1032和1033 1031.按照壳聚糖与铁的重量比为2-8，在40-80°C的恒温下，将壳聚糖溶解在体积比为-10%的醋酸水溶液中，搅拌至澄清，形成壳聚糖溶液；用水稀释步骤1023制得的表面包裹2，3- 二巯基丁二酸的磁性纳米颗粒胶体溶液，形成表面包裹2，3- 二巯基丁二酸的磁性纳米颗粒胶体溶液的稀释液；1032.启动搅拌机，将步骤1031制备的壳聚糖溶液加入步骤1031制备的表面包裹 2，3_ 二巯基丁二酸的磁性纳米颗粒胶体溶液的稀释液中，持续搅拌a!-20h;然后磁分离、 用水洗涤后，加水磁分离16h-Mh ；将上层水倒掉，取出下层黑色粒子，在90-120°C烘干该黑色粒子6-12小时，该黑色粒子为表面包覆壳聚糖的磁性纳米颗粒；1033.将步骤1032制备的表面包覆壳聚糖的磁性纳米颗粒加入质量百分浓度为 90-98%的硫酸溶液中，然后用搅拌机搅拌该硫酸溶液2-8小时后，用无水乙醇萃取一次， 再加入无水乙醇静置6-20小时，吸出上清液后，向下层奶白色乳状液体中加入重量百分浓度为10%的氢氧化钠溶液，再用重量百分浓度为5%的氢氧化钠溶液调节pH值为6-9之间，形成磺化溶液；将该磺化溶液加水稀释后，用离心机分离，下层絮状物加水超声溶解，得到表面包裹磺化壳聚糖的磁性纳米颗粒胶体溶液；20.稳定和富集生物介质中的儿茶酚胺，包括步骤201、202和203 201.用涡旋仪将步骤1033制得的表面包裹磺化壳聚糖的磁性纳米颗粒胶体溶液涡旋，并超声10-60min ；202.将生物介质样品溶液加入离心管，并加入100 μ L的步骤201制得的表面包裹磺化壳聚糖的磁性纳米颗粒胶体溶液，避光涡旋l-5min，超声5-20min后再静置10-60min， 形成待测混合溶液；203.将步骤202制得的待测混合溶液离心10_60min，转速为9000_16000r/min，下层所沉积的黑色颗粒为富集了儿茶酚胺的磁性纳米颗粒；30.洗脱步骤203制得的富集了儿茶酚胺的磁性纳米颗粒首先，将步骤203制得的富集了儿茶酚胺的磁性纳米颗粒进行磁分离和水洗涤； 然后，使用洗脱剂于富集了儿茶酚胺的磁性纳米颗粒中，用涡旋仪避光涡旋l_5min，用超声仪超声3-20min，静置10_60min后，用离心机离心10_60min，转速为9000_16000r/min，上清液进样含有洗脱的儿茶酚胺。有益效果与现有技术相比，本发明具有以下有益效果1.利用磁性纳米颗粒的磁分离功能，从生物介质中分离和洗涤儿茶酚胺，过程简单快速、成本低廉、富集率高。传统的液固提取方法，使用二苯基硼酸(DPBA)和C18固相萃取柱。在C18柱表面填充二苯基硼酸来富集儿茶酚胺。在碱性条件下，DPBA-乙醇胺酯理解成带负电的二苯基硼酸和乙醇胺，二苯基硼酸与儿茶酚胺上的邻羟基形成带负电的稳定复合物且固着在C18柱上，富集率达到95%。本发明源于纳米粒子表面的负电荷与儿茶酚胺的NH3+作用，这样静电吸附可实现富集，同时抑制以去氨基形式被代谢。磁性纳米粒子富集儿茶酚胺原理在适当的环境下，溶液中的儿茶酚胺以NH3+-R形式存在；同时磁性纳米颗粒表面带大量的负电荷，二者主要通过静电作用吸附，达到富集目的。本发明的方法利用磁性纳米颗粒 HS03-CS_DMSA@MNPs 富集 NE、E 和 DA 的效率分别为 98. 7士3. 1%, 100. 0士2. 7%和97.0士4.3%，均高出传统的液固提取方法的95%富集率。同时，相比传统的液固提取方法，本发明的方法过程简单快速、成本低廉。2.生物介质中的儿茶酚胺稳定性高。儿茶酚胺被富集的作用基团不同，二苯基硼酸(缩写DPBA)方法儿茶酚胺分子上的邻羟基被作用，而磁性纳米颗粒富集的作用部位是儿茶酚胺上的氨基。事实上，在生物样本中，儿茶酚胺主要是以去氨基形式被代谢，即被单胺氧化酶作用代谢。如在尿样中，儿茶酚胺去氨基代谢为香草扁桃酸(VMA)、高香草酸 (HVA)和3-甲氧基-4羟基苯乙二醇(HMPG)等。所以常常在分析检测前去蛋白或加入蛋白阻隔剂。例如，蛋白脲常被加入血液中以阻止儿茶酚胺以去氨基形式被代谢。因此，按照本发明提供的方法，当儿茶酚胺上的氨基通过静电吸附作用固定在纳米颗粒表面，儿茶酚胺被单胺氧化酶代谢的几率相对减少，稳定了生物样本中的儿茶酚胺。表面包覆磺化壳聚糖的磁性纳米颗粒富集儿茶酚胺分子的稳定性可达40小时以上。3.使用磁分离作为提纯分离方法，提高检测结果的准确性。传统的提纯富集儿茶酚胺方法有固相萃取法(SPE)和液液萃取法(LLE)。SPE提纯过程使用萃取小柱时，后柱压大、流速慢。液-液萃取(LLE)存在特异性差、耗时长和分离提纯的纯度不高等缺点。这些缺点对不稳定易分解的儿茶酚胺分离带来很多不便，且影响最终检测结果。本发明使用的磁性纳米颗粒具备尺寸小、比表面积大、悬浮稳定性好、在外磁场作用下的可磁导向性运输的特点，在物质的富集和分离方面有着重要的优势。在富集和洗脱过程以磁分离的形式实现分离，省时且整个过程可避光。采用磁分离，从而克服了固相萃取法和液液萃取法缺点， 有利于提高检测结果的准确性。


图1是本发明试验中合成的磁性纳米颗粒(MNPs)的透射电镜图。图2是图1中磁性纳米颗粒(MNPs)的粒径分布图。图3是本发明试验中合成的表面包覆2，3- 二巯基丁二酸的磁性纳米颗粒(DMSA0 MNPs)的透射电镜图。图4是图3中表面包覆2，3- 二巯基丁二酸的磁性纳米颗粒(DMSAOMNPs)的粒径分布图。图5是本发明试验中合成的表面包覆磺化壳聚糖的磁性纳米颗粒(HS03-CS-DMSA@ MNPs)的透射电镜图。图6是图5中表面包覆磺化壳聚糖的磁性纳米颗粒(HS03-CS-DMSA@MNPs)的粒径分布图。图7是本发明试验中合成的三种磁性纳米颗粒表面的kta电势随不同pH的变化曲线图。图中，矩形代表磁性纳米颗粒(MNPs)，圆形代表表面包覆2，3_ 二巯基丁二酸的磁性纳米颗粒(DMSAOMNP s)，三角形代表表面包覆磺化壳聚糖的磁性纳米颗粒 (HS03-CS-DMSAiMNPs)。其中，kta电势为零是等电点，表明颗粒表面无净电荷。图8是室温条件下，富集于表面包覆磺化壳聚糖的磁性纳米颗粒(HS03-CS-DMSA@ MNPs)的儿茶酚胺洗脱率随时间的变化曲线，横坐标表示时间，单位h，纵坐标表示脱附效率。其中，圆形代表对儿茶酚胺中的去甲肾上腺素(NE)的洗脱率，矩形代表对儿茶酚胺中的肾上腺素(E)的洗脱率，三角形代表对儿茶酚胺中的多巴胺(DA)的洗脱率。
图9是100 μ L3. Og/L的表面包覆磺化壳聚糖的磁性纳米颗粒(HS03-CS-DMSA@ MNPs)富集溶液中不同浓度的儿茶酚胺的富集率曲线，横坐标表示标准品浓度，单位ng/ mL，纵坐标表示结合效率。其中，圆形代表对儿茶酚胺中的肾上腺素(E)的洗脱率，矩形代表对儿茶酚胺中的去甲肾上腺素(NE)的洗脱率，三角形代表对儿茶酚胺中的多巴胺(DA) 的洗脱率。图10是人类唾液经表面包裹磺化壳聚糖的磁性纳米颗粒(HS03-CS-DMSA@MNPs) 富集，洗脱剂洗提后的高效液相色谱图。其中，纵坐标表示强度，单位微安，横坐标表示滞留时间，单位min。图中位于上方的曲线表示浓度为lOOOng/ml的去肾上腺、肾上腺和多巴胺标准品的色谱峰，位于下方的曲线表示唾液的色谱峰，其中有多巴胺的色谱峰。图11是人类血液经表面包裹磺化壳聚糖的磁性纳米颗粒(HS03-CS-DMSA@MNPs) 富集，洗脱剂洗提后的高效液相色谱图。其中，纵坐标表示强度，单位微安，横坐标表示滞留时间，单位min。其中有多巴胺的色谱峰。
具体实施例方式
下面对本发明的技术方案进行详细的说明。本发明使用的三种磁性纳米粒子均以 Y-Fe2O3为纳米核，分别是裸γ-F^O3粒子(缩写为MNPs)、DMSA包裹的γ-!^2O3粒子(缩写为DMSAOMNPs)和磺化壳聚糖(缩写为CS)包裹的Y-Fii2O3粒子(缩写为HS03-CS-DMSA@ MNPs)。本发明的一种稳定和富集生物介质中儿茶酚胺的方法，包括以下步骤10、20和 30。10.制备表面包裹磺化壳聚糖的磁性纳米颗粒胶体溶液，该步骤包括步骤101、 102 和 103。101.制备磁性纳米颗粒，该步骤包括步骤1011、1012和1013。1011.将摩尔比为2 1的Fe3+和Fe2+投料用浓度为2mol/L盐酸溶液超声搅拌溶解三氯化铁，将盐酸和三氯化铁形成的混合溶液加入至反应釜中，通入氮气搅拌，形成三氯化铁盐酸溶液；再用浓度为2mol/L的盐酸溶液超声溶解硫酸亚铁，形成硫酸亚铁盐酸溶液。三氯化铁中的Fe3+和硫酸亚铁中的!^e2+的摩尔比为2 1。将硫酸亚铁盐酸溶液与三氯化铁盐酸溶液混合搅拌，形成混合铁盐溶液。1012.将质量百分比浓度为12. 5%的四甲基氢氧化铵水溶液加入步骤1011制备的混合铁盐溶液中，用蠕动泵搅拌，同时通入氮气；然后进行磁分离洗涤，得到黑色沉淀。1013.进行氧化和表面修饰首先，用2mol/L的盐酸溶液稀释步骤1012制得的黑色沉淀，并调节PH值为3，超声搅拌直至pH值稳定；其后，将盐酸溶液稀释黑色沉淀后所形成的溶液加入反应釜中进行油浴加热搅拌，反应体系温度为90°C，同时用空气泵鼓入空气， 进行氧化反应lh_5h，然后磁分离洗涤，从而制得磁性纳米颗粒。步骤101采用化学共沉淀法方法制备磁性纳米颗粒四氧化三铁(化学分子式 狗304)，反应体系的浓度、反应时间、反应温度、Fe2YFe3+的摩尔比值、碱溶液的加入时间和速度均对磁性纳米颗粒的粒径、形态、结构及性能有很大影响。新制备的磁性纳米颗粒四氧化三铁，不稳定，在溶液中容易被氧化。因此，在酸性条件下，把磁性纳米颗粒四氧化三铁氧化成稳定的磁性纳米颗粒可以有效解决磁性纳米颗粒四氧化三铁的稳定性问题。本发明采用在酸性条件下通入空气的方法对新制备的磁性纳米颗粒四氧化三铁进行氧化。步骤1011 以及下面各步骤中提及的反应釜可以是玻璃反应釜。102.制备表面包裹2，3- 二巯基丁二酸的磁性纳米颗粒胶体溶液，该步骤包括步骤 1021、1022 和 1023。1021.用蒸馏水稀释步骤101制备的位于反应釜中磁性纳米颗粒，形成磁性纳米颗粒胶体溶液，然后用盐酸溶液调节该磁性纳米颗粒胶体溶液的pH值为2. 7，超声搅拌直至PH值稳定。1022.按照磁性纳米颗粒与2，3-二巯基丁二酸的摩尔比1-1. 5，称取2，3_ 二巯基丁二酸，将2，3- 二巯基丁二酸超声溶解于二甲基亚砜溶液中，然后将溶解了 2，3- 二巯基丁二酸的二甲基亚砜溶液加入步骤1021制得的pH值为2. 7的磁性纳米颗粒胶体溶液中，搅拌反应lh-5h。1023.步骤1022的搅拌反应结束后，对步骤1022中溶有2，3_ 二巯基丁二酸和二甲基亚砜溶液的磁性纳米颗粒胶体溶液进行磁分离，形成含表面包裹2，3-二巯基丁二酸的磁性纳米颗粒的混合反应溶液；用四甲基氢氧化铵水溶液调节该混合反应溶液的PH为 10，超声搅拌直至PH稳定为10 ；然后将该混合反应溶液的pH值调回为7，进行定容透析，得到表面包裹2，3- 二巯基丁二酸的磁性纳米颗粒胶体溶液。在步骤102中，根据对儿茶酚胺的吸附要求，选用2，3-二巯基丁二酸(缩写为 DMSA)作为分散剂，修饰在磁性纳米颗粒的表面，有利于磁性液体的稳定性。103.先包覆后磺化，制备表面包裹磺化壳聚糖的磁性纳米颗粒胶体溶液该步骤包括步骤1031、1032和1033。1031.按照壳聚糖与铁的重量比为2-8，在40-80°C的恒温下，将壳聚糖溶解在体积比为-10%的醋酸水溶液中，搅拌至澄清，形成壳聚糖溶液；用水稀释步骤1023制得的表面包裹2，3- 二巯基丁二酸的磁性纳米颗粒胶体溶液，形成表面包裹2，3- 二巯基丁二酸的磁性纳米颗粒胶体溶液的稀释液。1032.启动搅拌机，将步骤1031制备的壳聚糖溶液加入步骤1031制备的表面包裹 2，3_ 二巯基丁二酸的磁性纳米颗粒胶体溶液的稀释液中，持续搅拌a!-20h;然后磁分离、 用水洗涤后，加水磁分离16h-Mh ；将上层水倒掉，取出下层黑色粒子，在90-120°C烘干该黑色粒子6-12小时，该黑色粒子为表面包覆壳聚糖的磁性纳米颗粒。1033.将步骤1032制备的表面包覆壳聚糖的磁性纳米颗粒加入质量百分浓度为 90-98%的硫酸溶液中，然后用搅拌机搅拌该硫酸溶液2-8小时后，用无水乙醇萃取一次， 再加入无水乙醇静置6-20小时，吸出上清液后，向下层奶白色乳状液体中加入重量百分浓度为10%的氢氧化钠溶液，再用重量百分浓度为5%的氢氧化钠溶液调节pH值为6-9之间，形成磺化溶液；将该磺化溶液加水稀释后，用离心机分离，下层絮状物加水超声溶解，得到表面包裹磺化壳聚糖的磁性纳米颗粒胶体溶液。在步骤103中，基于表面包裹2，3-二巯基丁二酸的磁性纳米颗粒表面裸露的羧基，将高分子材料壳聚糖修饰到磁性纳米颗粒表面。磺化壳聚糖包覆的磁性纳米颗粒的合成通过壳聚糖的包覆和壳聚糖包覆磁性纳米颗粒的磺化两步反应来实现。表面包覆磺化壳聚糖的磁性纳米颗粒是本发明的特色。壳聚糖包覆在表面包裹2，3-二巯基丁二酸的磁性纳米颗粒表面的机理是磁性纳米颗粒中的羧基与壳聚糖单体中的氨基作用。纯高聚物状态的壳聚糖磺化的机理如下在质量百分浓度为90-98%的硫酸溶液中，常出现一级电离，电离成H+和-0S03H_，其中H+与壳聚糖的氨基很容易成阳离子，而-0S03H_又与壳聚糖氨基阳离子成盐，在该硫酸存在下，此盐很容易脱去一分子水，最后形成N上取代的磺酸根。但究竟是先磺化再包覆还是先包覆再磺化，这是本发明合成路径的关键问题。本发明改进了现存的壳聚糖表面包裹纳米颗粒的合成方法，采用先包覆壳聚糖，再进行磺化，最后合成了表面包覆磺化壳聚糖的磁性纳米颗粒。本发明先将壳聚糖磺化，再包覆纳米颗粒。用醋酸溶液溶解壳聚糖，而后磺化；但磺化后的壳聚糖成果冻胶体状，不易溶解。反复多次超声溶解后，将澄清的磺化壳聚糖与表面包裹2，3- 二巯基丁二酸的磁性纳米颗粒溶液混合搅拌4h，但所得磁性纳米颗粒不能实现预期的富集作用。原因为两点一，壳聚糖在醋酸溶液中的溶解行为时基于其脱乙酰作用，但磺化了的壳聚糖脱乙酰水平降低。虽在醋酸溶液中基本溶解，但对于纳米级别的粒子，这种溶解度是不够的，导致磺化壳聚糖未包覆到表面包裹2，3-二巯基丁二酸的磁性纳米颗粒上；二、壳聚糖磺化的基团是氨基，而它包覆到表面包裹2，3- 二巯基丁二酸的磁性纳米颗粒表面也是基于磁性纳米颗粒中的羧基与壳聚糖单体中的氨基作用。前一步的磺化将壳聚糖高聚物上活泼的氨基己磺化，没有剩余足够的氨基作用到表面包裹2，3-二巯基丁二酸的磁性纳米颗粒上，导致磺化壳聚糖不能包覆上纳米颗粒。本发明选择先包覆后磺化。首先优化壳聚糖与铁的用量比需；若壳聚糖太过量，之后反复磁分离都不能除去剩余的，则这些壳聚糖会在干燥过程中将纳米颗粒集结成块，超声也回不到均勻状态，不能进行下一步的磺化；若铁过量，壳聚糖不能完全包覆纳米颗粒， 功能基团不能充分地联结到颗粒表面，降低纳米颗粒对儿茶酚胺的富集效率。包覆了壳聚糖的纳米颗粒磺化步骤也是整个合成的关键步骤。因为磁性纳米颗粒的核是四氧化三铁， 易被磺化使用的硫酸溶解。所以整个磺化步骤使用的仪器溶剂都必须确保无水状态，一旦有水，浓硫酸被稀释至稀硫酸，纳米颗粒就被消解。同时，磺化过程中的搅拌速度必须要快， 最好能实现边超声边搅拌，因为浓硫酸会有碳化作用，纳米颗粒集结成块不能均勻被磺化。 以上方法制备的表面包裹磺化壳聚糖的磁性纳米颗粒胶体溶液均勻稳定，在对儿茶酚胺的富集作用中也有良好表现。20.稳定和富集生物介质中的儿茶酚胺，包括步骤201、202和203。201.用涡旋仪将步骤1033制得的表面包裹磺化壳聚糖的磁性纳米颗粒胶体溶液涡旋，并超声10-60min。202.将生物介质样品溶液加入离心管，并加入100 μ L的步骤201制得的表面包裹磺化壳聚糖的磁性纳米颗粒胶体溶液，避光涡旋l-5min，超声5-20min后再静置10-60min， 形成待测混合溶液。203.将步骤202制得的待测混合溶液离心10_60min，转速为9000_16000r/min，下
层所沉积的黑色颗粒为富集了儿茶酚胺的磁性纳米颗粒。在步骤20中，儿茶酚胺在弱酸性条件下才能稳定存在，其离解常数为8. 5 9. 5。 当pH = 6. 0-7. 0时，儿茶酚胺分子在水溶液中电离生成NH3+-R。这时，表面包覆功能基团的磁性纳米颗粒表面存在大量的负电荷，主要通过静电作用吸附儿茶酚胺，可能有壳聚糖的铵基团间的氢键和聚合物链间的分子间作用力。30.洗脱步骤203制得的富集了儿茶酚胺的磁性纳米颗粒。
首先，将步骤203制得的富集了儿茶酚胺的磁性纳米颗粒进行磁分离和水洗涤； 然后，使用洗脱剂于富集了儿茶酚胺的磁性纳米颗粒中，用涡旋仪避光涡旋l_5min，用超声仪超声3-20min，静置10_60min后，用离心机离心10_60min，转速为9000_16000r/min，上清液进样含有洗脱的儿茶酚胺。在步骤30中，结合本发明磁性纳米颗粒富集儿茶酚胺的实验原理，洗脱实验有以下三个策略加入强电解质以离子替换；调节溶液PH值，改变磁性纳米颗粒的表面电荷和改变溶液的极性。洗涤固定在表面包覆磺化壳聚糖的磁性纳米颗粒表面的儿茶酚胺，利用 PH值、溶液组成、极性不同于富集时的溶液(即洗脱剂)，打破上述纳米颗粒与儿茶酚胺之间的静电吸附平衡，析出」L茶酚胺。针对不同的生物介质，使用不同的洗脱剂。对于洗脱从尿液或者羊水的生物介质中富集的儿茶酚胺，使用的洗脱剂以水为溶剂，无机酸为溶质。无机酸是盐酸、硝酸和磷酸中的任意一种或者任意组合。对于洗脱从血液、唾液和脑脊液的生物样品中富集的儿茶酚胺，使用的洗脱剂以有机极性溶剂和水的混合溶液为溶剂，以有机酸为溶质。有机酸是二甲基亚砜、乙二醇、甲酸、乙酸和三氯乙酸中的任意一种或者任意组合。进一步，在所述的步骤30之后，进行液相色谱电化学检测步骤使用液相色谱将儿茶酚胺与儿茶酚胺的代谢物等干扰物质的色谱峰分离，并使用电化学检测器进行检测， 用外标法对洗脱的儿茶酚胺进行定量检测，检测中的色谱条件为色谱柱C18色谱柱；流动相10-60mM柠檬酸，15-100mM磷酸二氢钠，I-IOmM庚烷磺酸钠；0. 05-0. 5mM 乙二胺四乙酸，体积比5. 0-7. 0%的乙腈，氢氧化钠调pH = 3. 5-5. 5 ；流速为 0. 5-2. OmL/min ；柱温为25_40°C ；进样量2-20 μ L ；电化学检测器的工作电压为0. 35-0. 7V ；操作时温度20°C -25°C。下面通过试验来说明采用本技术方案的效果。1.试验试剂硫酸亚铁溶液(FeSO4 ·7Η20)、三氯化铁溶液(FeCl3 ·6Η20)、二甲基亚砜(DMSO)、浓盐酸(HCl)、柠檬酸、磷酸二氢钠、氢氧化钠均为分析纯(AR)；四甲基氢氧化铵((CH3)4NOH) 纯度为25% ；2，3_ 二巯基丁二酸(DMSA)纯度彡99% ；标准品多巴胺(DA)、去甲肾上腺素 (NE)、肾上腺素(E)均为Sigma产品；乙腈、甲醇、壳聚糖为色谱纯(CS)；乙二胺四乙酸二钠 (EDTA-2Na)、磷酸二氢钠、高氯酸、柠檬酸、三氯乙酸为分析纯；庚烷磺酸钠为HPLC专用试剂、分析纯；实验用水为三蒸水。2.试验仪器试验中使用的仪器均可以由市场购买。本试验中使用的仪器包括超声波清洗器， 由昆山市超声仪器有限公司生产。透析袋，由上海泰伯经营产品部销售。电热真空干燥箱， 由上海精宏实验设备有限公司生产。离心机，由德国Eppendorf公司生产。电子分析天平， 由奥豪斯仪器有限公司生产。透射电子显微镜(TEM)，由日本JEOL公司生产。kta电势分析仪，由贝克曼公司生产。空气泵，由浙江森森实业有限公司生产。高效液相色谱系统，由日本岛津LC-20AD高效液相色谱仪和岛津L-ECD-6A电化学检测器组成，该高效液相色谱系统包括 LC-20AD 双泵，SIL-20AC 自动进样器，CT0-20A 柱温箱和 Diamonsi C18 (150X4. 6mm， 5ym)不锈钢柱。数据分析使用随机附带的岛津高效液相色谱软件包。实验使用的色谱柱为 VP-ODS Dikma C18 (5 μ m，250mmX 4. 6mm)，流动相的 PH值用 Orion model SA 720PH计测定(Orion Research Incorporated, USA)。3.色谱条件流动相;35mM柠檬酸，45mM磷酸二氢钠，6mM庚烷磺酸钠；0. 25mM EDTA, 7.0% (ν/ ν)乙腈，NaOH调pH = 4. 15 ；流速为1. OmL/min ；柱温为30°C ；电化学检测器工作电压为 0. 7V ；进样量20 μ L0测定操作在25°C进行。4.试验方法稳定和富集生物介质中儿茶酚胺的方法，该方法包括以下步骤10、20和30 10.制备表面包裹磺化壳聚糖的磁性纳米颗粒胶体溶液，该步骤包括步骤101、 102 和 103 101.制备磁性纳米颗粒，该步骤包括步骤1011、1012和1013 1011.将摩尔比为2 1的!^3+和!^2+投料用200mL浓度为2mol/L盐酸溶液超声搅拌溶解54. 05g三氯化铁，将盐酸和三氯化铁形成的混合溶液加入至3L反应釜中，通入氮气搅拌，形成三氯化铁盐酸溶液；再用50mL浓度为2mol/L的盐酸溶液超声溶解27. 80g 硫酸亚铁，形成硫酸亚铁盐酸溶液；将硫酸亚铁盐酸溶液与三氯化铁盐酸溶液混合搅拌，形成混合铁盐溶液；1012.将1. 25L质量百分比浓度为12. 5%的四甲基氢氧化铵水溶液90s加入步骤 1011制备的混合铁盐溶液中，用蠕动泵搅拌，同时通入氮气；然后进行磁分离洗涤一次，得到黑色沉淀；1013.进行氧化和表面修饰首先，称取步骤1012制备黑色沉淀重量的一半，用水稀释至5L，此时该溶液的浓度约为2g/L，然后用2mol/L的盐酸溶液稀释该溶液，并调节pH 值为3，超声搅拌直至pH值稳定；其后，将盐酸溶液稀释黑色沉淀后所形成的溶液加入反应釜中进行油浴加热搅拌，反应体系温度为90°C，同时用空气泵鼓入空气，进行氧化反应5h， 然后磁分离洗涤一次，从而制得磁性纳米颗粒；102.制备表面包裹2，3- 二巯基丁二酸的磁性纳米颗粒胶体溶液，该步骤包括步骤 1021、1022 和 1023 1021.用蒸馏水稀释步骤101制备的位于反应釜中磁性纳米颗粒，形成浓度为 1.2g/L的磁性纳米颗粒胶体溶液，然后用盐酸溶液调节该磁性纳米颗粒胶体溶液的pH值为2. 7，超声搅拌直至pH值稳定；1022.将1. 365g的2，3_ 二巯基丁二酸超声溶解于50mL 二甲基亚砜溶液中，然后将溶解了 2，3- 二巯基丁二酸的二甲基亚砜溶液加入步骤1021制得的pH值为2. 7的磁性纳米颗粒胶体溶液中，搅拌反应B ；1023.步骤1022的搅拌反应结束后，对步骤1022中溶有2，3_ 二巯基丁二酸和二甲基亚砜溶液的磁性纳米颗粒胶体溶液进行磁分离一次，形成含表面包裹2，3- 二巯基丁二酸的磁性纳米颗粒的混合反应溶液；用四甲基氢氧化铵水溶液调节该混合反应溶液的 PH为10，超声搅拌直至pH稳定为10 ；然后将该混合反应溶液的pH值调回为7，进行定容透析，得到表面包裹2，3- 二巯基丁二酸的磁性纳米颗粒胶体溶液；103.先包覆后磺化，制备表面包裹磺化壳聚糖的磁性纳米颗粒胶体溶液该步骤包括步骤1031、1032和1033 1031.在60°C的恒温下，将1. 2g的壳聚糖溶解在60mL体积比为1 %的醋酸水溶液中，搅拌至澄清，形成壳聚糖溶液；用水稀释步骤1023制得的表面包裹2，3-二巯基丁二酸的磁性纳米颗粒胶体溶液，形成1. 5g/L的表面包裹2，3- 二巯基丁二酸的磁性纳米颗粒胶体溶液的稀释液；1032.启动搅拌机，将步骤1031制备的壳聚糖溶液加入200mL步骤1031制备的表面包裹2，3- 二巯基丁二酸的磁性纳米颗粒胶体溶液的稀释液中，持续搅拌4h ；然后磁分离、用水洗涤两次后，加水至1L，磁分离Mh ；将上层水倒掉，取出下层黑色粒子，在100°C烘干该黑色粒子12小时，该黑色粒子为表面包覆壳聚糖的磁性纳米颗粒；1033.将步骤1032制备的表面包覆壳聚糖的磁性纳米颗粒加入30mL质量百分浓度为98%的硫酸溶液中，然后用搅拌机搅拌该硫酸溶液3小时后，用无水乙醇萃取一次，再加入无水乙醇静置12小时，吸出上清液后，向下层奶白色乳状液体中加入IOmL重量百分浓度为10 %的氢氧化钠溶液，再用重量百分浓度为5 %的氢氧化钠溶液调节pH值为6-9之间，形成磺化溶液；将该磺化溶液加水稀释后，用离心机分离，下层絮状物加水超声溶解，得到表面包裹磺化壳聚糖的磁性纳米颗粒胶体溶液；20.稳定和富集生物介质中的儿茶酚胺，包括步骤201、202和203 201.用涡旋仪将步骤1033制得的表面包裹磺化壳聚糖的磁性纳米颗粒胶体溶液涡旋，并超声20min ；202.将ImL的lOOng/mL生物介质样品溶液加入离心管，并加入100 μ L的步骤201 制得的表面包裹磺化壳聚糖的磁性纳米颗粒胶体溶液，避光涡旋lmin，超声5min后再静置 20min,形成待测混合溶液；203.将步骤202制得的待测混合溶液离心20min，转速为16000r/min，下层所沉积的黑色颗粒为富集了儿茶酚胺的磁性纳米颗粒；30.洗脱步骤203制得的富集了儿茶酚胺的磁性纳米颗粒首先，将步骤203制得的富集了儿茶酚胺的磁性纳米颗粒进行磁分离和水洗涤； 然后，使用洗脱剂于富集了儿茶酚胺的磁性纳米颗粒中，用涡旋仪避光涡旋lmin，用超声仪超声5min，静置20min后，用离心机离心20min，转速为16000r/min，上清液进样含有洗脱的儿茶酚胺。5.试验结果采用透射电镜表征了经上述步骤制得的磁性纳米颗粒(MNPs)、表面包裹2， 3-二巯基丁二酸的磁性纳米颗粒(DMSAOMNPs)和表面包裹磺化壳聚糖的磁性纳米颗粒 (HS03-CS-DMSAiMNPs)三种磁性纳米颗粒的形貌，如图1_图6所示。经粒径分布计算软件统计，磁性纳米颗粒直径大小为7. 6 士4. 7nm，表面包裹2，3- 二巯基丁二酸的磁性纳米颗粒直径大小为9. 1 士4. Onm，表面包裹磺化壳聚糖的磁性纳米颗粒直径大小为10. 0士5. 8nm。这表明磁性纳米颗粒和表面包裹磺化壳聚糖的磁性纳米颗粒的修饰并没有明显改变磁性纳米颗粒的粒径。由图7可知，磁性纳米颗粒(MNPs)电位在pH值较低时为正，在pH值较高转为负；磁性纳米颗粒(MNPs)的等电点(IEP)为5.0。表面包裹2，3-二巯基丁二酸的磁性纳米颗粒(DMSAiMNPs)在pH = 3-10的范围内，Zeta电位都为负，且随pH的增加，其负电位的绝对值越来越大。这说明虽然2，3-二巯基丁二酸(DMSA)与磁性纳米颗粒(MNPs)的联结是基于-COOH*!^的螯合作用，仍有硫醇基团和一部分羧基裸露在纳米颗粒表面。随表面包裹磺化壳聚糖，磁性纳米颗粒的^ta电位在pH值较低时为正，在pH值较高转为负； 表面包裹磺化壳聚糖的磁性纳米颗粒(HS03-CS-DMSA@MNPs)的IEP为4. 2。这表明表面包裹磺化壳聚糖的磁性纳米颗粒表面DMSA的羧基或硫醇基被壳聚糖的氨基的全部键合；未被磺化的壳聚糖氨基裸露在表面包裹磺化壳聚糖的磁性纳米颗粒(HS03-CS-DMSA@MNPs)表面。此外，表面包裹壳聚糖和2，3- 二巯基丁二酸的磁性纳米颗粒(缩写为CS-DMSA@MNPs) 的IEP为8. 6，表面包裹壳聚糖的磁性纳米颗粒(缩写为CSOMNPs)的IEP (9. 6)，这是由于作为中间联结的磁性纳米颗粒(缩写为DMSA)的部分未与纳米颗粒键合的羧基或硫醇基， 抵消了部分壳聚糖氨基的正电荷。磺化引入的磺酸基明显降低了纳米颗粒表面的电位，导致 IEP 递减，即 CSiMNPs > CS-DMSAiMNPs > HSO3-CS-DMSAiMNPSo当pH > 6. 0时，磁性纳米颗粒(MNPs)、表面包裹2，3_ 二巯基丁二酸的磁性纳米颗粒(DMSAOMNPs)和表面包裹磺化壳聚糖的磁性纳米颗粒(HS03-CS-DMSA@MNPs)三种磁性纳米颗粒的kta电势均为负值，即表面都带负电荷；且负电势绝对值的大小为 MNPs < DMSAiMNPs < HSO3-CS-DMSAiMNPSo 由于表面磺化引入磺酸，HS03-CS-DMSA@ MNPs的静电吸附儿茶酚胺的能力较之DMSAOMWs和MNPs更为突出，如表1所示。以下提及的富集率和洗脱率分别为添加磁性纳米颗粒或洗脱剂后上清液中目标分子与标准溶液目标分子的浓度差与标准溶液的浓度的比值。MNPs和DMSAOMNPs的富集率不到80%， HS03-CS-DMSAiMNPs表现出最高的富集率，对去甲肾上腺素(NE)、肾上腺素(E)、多巴胺 (DA)的富集率均达到98%以上。这是由于当pH> 6.0时，儿茶酚胺分子在水溶液中电离生成NH3+-R(pKb = 8. 5 9. 5)，故纳米颗粒表面越呈电负性，二者越易静电吸引。表IpH = 7. 0时，所制备的三种磁性纳米颗粒富集儿茶酚胺的富集率
权利要求
1. 一种稳定和富集生物介质中儿茶酚胺的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤制备表面包裹磺化壳聚糖的磁性纳米颗粒胶体溶液，该步骤包括步骤101、102和103 制备磁性纳米颗粒，该步骤包括步骤1011、1012和1013 .1011.将摩尔比为2:1的!^3+和!^2+投料用浓度为2mol/L盐酸溶液超声搅拌溶解三氯化铁，将盐酸和三氯化铁形成的混合溶液加入至反应釜中，通入氮气搅拌，形成三氯化铁盐酸溶液；再用浓度为2mol/L的盐酸溶液超声溶解硫酸亚铁，形成硫酸亚铁盐酸溶液；将硫酸亚铁盐酸溶液与三氯化铁盐酸溶液混合搅拌，形成混合铁盐溶液；.1012.将质量百分比浓度为12.5%的四甲基氢氧化铵水溶液加入步骤1011制备的混合铁盐溶液中，用蠕动泵搅拌，同时通入氮气；然后进行磁分离洗涤，得到黑色沉淀；.1013.进行氧化和表面修饰首先，用2mol/L的盐酸溶液稀释步骤1012制得的黑色沉淀，并调节PH值为3，超声搅拌直至pH值稳定；其后，将盐酸溶液稀释黑色沉淀后所形成的溶液加入反应釜中进行油浴加热搅拌，反应体系温度为90°C，同时用空气泵鼓入空气， 进行氧化反应1 h —5h，然后磁分离洗涤，从而制得磁性纳米颗粒；制备表面包裹2，3-二巯基丁二酸的磁性纳米颗粒胶体溶液，该步骤包括步骤1021、 1022 和 1023 .1021.用蒸馏水稀释步骤101制备的位于反应釜中磁性纳米颗粒，形成磁性纳米颗粒胶体溶液，然后用盐酸溶液调节该磁性纳米颗粒胶体溶液的PH值为2. 7，超声搅拌直至pH 值稳定；.1022.按照磁性纳米颗粒与2，3-二巯基丁二酸的摩尔比1一 1. 5，称取2，3- 二巯基丁二酸，将2，3- 二巯基丁二酸超声溶解于二甲基亚砜溶液中，然后将溶解了 2，3- 二巯基丁二酸的二甲基亚砜溶液加入步骤1021制得的pH值为2. 7的磁性纳米颗粒胶体溶液中，搅拌反应Ih—5h ；.1023.步骤1022的搅拌反应结束后，对步骤1022中溶有2，3-二巯基丁二酸和二甲基亚砜溶液的磁性纳米颗粒胶体溶液进行磁分离，形成含表面包裹2，3- 二巯基丁二酸的磁性纳米颗粒的混合反应溶液；用四甲基氢氧化铵水溶液调节该混合反应溶液的PH为10，超声直至PH稳定为10 ；然后将该混合反应溶液的pH值调回为7，进行定容透析，得到表面包裹2，3- 二巯基丁二酸的磁性纳米颗粒胶体溶液；.103.先包覆后磺化，制备表面包裹磺化壳聚糖的磁性纳米颗粒胶体溶液该步骤包括步骤 1031、1032 和 1033 .1031.按照壳聚糖与铁的重量比为2—8，在40-80°C的恒温下，将壳聚糖溶解在体积比为1%-10%的醋酸水溶液中，搅拌至澄清，形成壳聚糖溶液；用水稀释步骤1023制得的表面包裹2，3- 二巯基丁二酸的磁性纳米颗粒胶体溶液，形成表面包裹2，3- 二巯基丁二酸的磁性纳米颗粒胶体溶液的稀释液；.1032.启动搅拌机，将步骤1031制备的壳聚糖溶液加入步骤1031制备的表面包裹2， 3-二巯基丁二酸的磁性纳米颗粒胶体溶液的稀释液中，持续搅拌2 h -20 h;然后磁分离、 用水洗涤后，加水磁分离16 h —24 h;将上层水倒掉，取出下层黑色粒子，在90-120°C烘干该黑色粒子6-12小时，该黑色粒子为表面包覆壳聚糖的磁性纳米颗粒；.1033.将步骤1032制备的表面包覆壳聚糖的磁性纳米颗粒加入质量百分浓度为 90-98%的硫酸溶液中，然后用搅拌机搅拌该硫酸溶液2-8小时后，用无水乙醇萃取一次，再加入无水乙醇静置6-20小时，吸出上清液后，向下层奶白色乳状液体中加入重量百分浓度为10%的氢氧化钠溶液，再用重量百分浓度为5%的氢氧化钠溶液调节pH值为6-9之间，形成磺化溶液；将该磺化溶液加水稀释后，用离心机分离，下层絮状物加水超声溶解，得到表面包裹磺化壳聚糖的磁性纳米颗粒胶体溶液；\20.稳定和富集生物介质中的儿茶酚胺，包括步骤201、202和203 \201.用涡旋仪将步骤1033制得的表面包裹磺化壳聚糖的磁性纳米颗粒胶体溶液涡旋，并超声10-60min ；\202.将生物介质样品溶液加入离心管，并加入100μ L的步骤201制得的表面包裹磺化壳聚糖的磁性纳米颗粒胶体溶液，避光涡旋l-5min，超声5-20min后再静置10-60min，形成待测混合溶液；\203.将步骤202制得的待测混合溶液离心10-60min，转速为9000-16000r/min，下层所沉积的黑色颗粒为富集了儿茶酚胺的磁性纳米颗粒；洗脱步骤203制得的富集了儿茶酚胺的磁性纳米颗粒首先，将步骤203制得的富集了儿茶酚胺的磁性纳米颗粒进行磁分离和水洗涤；然后， 使用洗脱剂于富集了儿茶酚胺的磁性纳米颗粒中，用涡旋仪避光涡旋l_5min，用超声仪超声3-20min，静置10_60min后，用离心机离心10_60min，转速为9000_16000r/min，上清液进样含有洗脱的儿茶酚胺。
2.按照权利要求1所述的稳定和富集生物介质中儿茶酚胺的方法，其特征在于，在所述的步骤30之后，进行液相色谱电化学检测步骤使用液相色谱将儿茶酚胺与干扰物质的色谱峰分离，并使用电化学检测器进行检测，用外标法对洗脱的儿茶酚胺进行定量检测，检测中的色谱条件为色谱柱C18色谱柱；流动相10-60mM柠檬酸，15-100 mM磷酸二氢钠，1_10 mM庚烷磺酸钠；0. 05-0. 5 mM乙二胺四乙酸，体积比5. 0-7. 0 %的乙腈，氢氧化钠调pH=3. 5-5. 5 ；流速为 0. 5-2. OmL/min ；柱温为25-40°C;进样量2-20 μ L ；电化学检测器的工作电压为0. 35-0. 7 V ；操作时温度20° C — 25° C。
3.按照权利要求1所述的稳定和富集生物介质中儿茶酚胺的方法，其特征在于，所述的步骤30中使用的洗脱剂以水为溶剂，无机酸为溶质。
4.按照权利要求3所述的稳定和富集生物介质中儿茶酚胺的方法，其特征在于，所述的无机酸是盐酸、硝酸和磷酸中的任意一种或者任意组合。
5.按照权利要求1所述的稳定和富集生物介质中儿茶酚胺的方法，其特征在于，所述的步骤30中使用的洗脱剂以有机极性溶剂和水的混合溶液为溶剂，以有机酸为溶质。
6.按照权利要求5所述的稳定和富集生物介质中儿茶酚胺的方法，其特征在于，所述的有机酸是二甲基亚砜、乙二醇、甲酸、乙酸和三氯乙酸中的任意一种或者任意组合。
全文摘要
本发明公开了一种稳定和富集生物介质中儿茶酚胺的方法，该方法包括以下步骤步骤10.制备表面包裹磺化壳聚糖的磁性纳米颗粒胶体溶液，该步骤包括制备磁性纳米颗粒、制备表面包裹2，3-二巯基丁二酸的磁性纳米颗粒胶体溶液和制备表面包裹磺化壳聚糖的磁性纳米颗粒胶体溶液。步骤20.稳定和富集生物介质中的儿茶酚胺。步骤30.洗脱步骤20制得的富集了儿茶酚胺的磁性纳米颗粒。该方法采用磁性纳米颗粒表面的磺化壳聚糖来稳定和富集生物介质中的儿茶酚胺，利用磁性纳米颗粒的磁分离功能，从生物介质中分离和洗涤儿茶酚胺，过程简单快速、成本低廉、富集率高。
文档编号B01J20/30GK102553536SQ20111043022
公开日2012年7月11日 申请日期2011年12月21日 优先权日2011年12月21日
发明者乔婷, 王爽, 邓慧华, 金晶, 陆祖宏 申请人:东南大学