专利名称：一种功能化吸头及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种功能化吸头，还涉及该功能化吸头的制备方法，属于样品预处理技术。
背景技术：
固相萃取(SPE)有选择性好、富集倍数高、回收率高及重现性好等优点，是一种重要的样品预处理技术。为了缩短处理时间、降低样品量和简化萃取操作，微型化SPE装置已被用于生物分析中，如商品化的功能化吸头，包括Millipore的Zip-Tip, Thermo FisherScientific的HyperSep-Tip以及Supelco的Supel-Tip等。但是，由于这些商品化的功能化吸头用于SPE时的上样体积不能超过10微升，在处理低丰度样品时受到很大限制。这是因为当样品中目标分析物的浓度非常低时，需加大SPE实验中的上样体积，所以商品化的功能化吸头无法满足低丰度、较大体积(>10微升)样品的前处理。另一方面，已有部分文献报道将纤维状吸附剂或块状吸附剂直接装填至吸头用于萃取实验。但是，由于常规的SPE吸附剂大部分为粉末状，纤维状吸附剂及块状吸附剂种类较少，而已有方法并不适用于粉末状吸附剂，这大大地限制了其发展。
发明内容
本发明要解决的问题在于克服现有技术的不足，提供一种简单、快速的功能化吸头的制备方法。本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案为是一种功能化吸头的制备方法，包括以下步骤I)利用移液枪将有机硅灌封胶在吸头尖端内壁上形成一层胶膜；2)向吸头尖端加入粉末吸附剂，使粉末吸附剂固载于吸头尖端的胶膜上；3)用细铁线穿透固载有粉末吸附剂的吸头尖端，使其形成通道；4)室温下固化，固化时间> 24h，用水洗去未固载在胶膜上的粉末，得到尖端固载粉末吸附剂的功能化吸头。所述的有机硅灌封胶为单组份有机硅灌封胶。所述细铁线直径为20(T400 u m。一种利用上述方法制备的功能化吸头，该功能化吸头尖端内壁上有固载了粉末吸附剂的胶膜，吸头尖端具有穿透胶膜的孔。在制备功能化吸头过程中，通过控制移液枪刻度可控制吸头尖端形成胶膜的高度，从而控制粉末吸附剂的固载量，并确保粉末吸附剂集中在吸头末端，这有利于SPE实验中目标分析物与吸附剂充分接触和调整上样、洗涤及解吸中溶液体积。细铁线穿透固载有粉末吸附剂的吸头尖端形成通道，保证了最终制备的功能化吸头具备优良的通透性，使其在SPE实验中能顺利流通溶液。本发明提供的制备方法简单、快速、经济，普遍适用于粉末吸附剂，所制备的功能化吸头通透性好。将固载有不同吸附剂的多种功能化吸头用于蛋白组学及多肽组学中的样品前处理，取得了良好的效果。
图1为实施例1中的制备的固载介孔二氧化硅的功能化吸头电镜图，a c为不同放大倍数的电镜图。图2为实施例1中固载介孔二氧化硅的功能化吸头中吸附剂的孔径分布图。图3为实施例2、3、4中SPE实验流程示意图。图4为实施例2中固载介孔二氧化硅的功能化吸头富集20nM牛血清白蛋白(BSA)酶解物及200nMBSA蛋白的质谱图，a、c及e分别为富集BSA多肽实验中的未经处理样品、萃余液及解吸液的质谱图，b、d及f分别为富集BSA蛋白实验中的未经处理样品、萃余液及解吸液的质谱图。图5为实施例2中重复利用30次萃取实验的固载介孔二氧化硅的功能化吸头富集20nM BSA后解吸液的质谱图。图6为实施例2中固载介孔二氧化硅的功能化吸头富集200nM辣根过氧化物酶(HRP)蛋白的质谱图，a、b、c分别为未经处理样品、萃余液及解吸液的质谱图。图7为实施例2中固载介孔二氧化硅的功能化吸头富集InM血管紧张素II后解吸液的质谱图。图8为实施例2中三个不同批次制备的固载介孔二氧化硅的功能化吸头分别用于富集20nM人工合成多肽(氨基酸序列为P14R)后解吸液的质谱图。图中“#”代表内标的质
谱信号。图9为实施例2中固载介孔二氧化硅的功能化吸头富集用水稀释10倍的血浆样品的质谱图，a为未经处理样品的质谱图，b为富集后解吸液的质谱图。图10为实施例3中商品化Zip-Tip C18及固载C18键合硅胶的功能化吸头用于样品脱盐和富集后解吸液的质谱图，其中a为商品化Zip-Tip C18用于样品脱盐和富集后解吸液的质谱图，b为固载C18键合硅胶的功能化吸头用于样品脱盐和富集后解吸液的质谱图。图11为实施例4中固载二氧化钛的功能化吸头富集磷酸化多肽实验中未经处理样品及解吸液的质谱图，其中，a为固载二氧化钛的功能化吸头富集磷酸化多肽实验中未经处理样品的质谱图，b为固载二氧化钛的功能化吸头富集磷酸化多肽实验中解吸液的质谱图，31、￠2及￠3代表P -酪蛋白中的三个磷酸化多肽信号。
具体实施例方式以下通过实施例对本发明做进一步的介绍。实施例1固载介孔二氧化硅的功能化吸头的制备及表征利用移液枪抽/推有机硅灌封胶使200 y L吸头尖端涂上一层胶膜；加入介孔二氧化硅粉末使其固载在吸头尖端的胶膜 上；用直径约300 的细铁线在固载介孔二氧化硅粉末的吸头尖端穿透形成通道；室温下固化24h，用水洗去未固载在胶膜上的粉末，得到尖端固载介孔二氧化硅的功能化吸头。通过扫描电子显微镜对制备的固载介孔二氧化硅的功能化吸头进行表征。如图1所示，通过a可以看到功能化吸头尖端存在一个直径约300i!m的通道，这与实施例1中用到的细铁线直径吻合；通过b可以看到介孔二氧化硅颗粒紧密堆积在吸头尖端的内壁上；通过c可以看到介孔二氧化硅颗粒通过灌封胶交联在一起。对功能化吸头末端通过灌封胶交联在一起的介孔二氧化硅吸附剂进行氮气吸附/脱附测试，结果表明该吸附剂比表面积为345m2/g，孔径分布如图2所示具有很窄的分布范围，最可几孔径为2. 4nm，证明该吸附剂具有大比表面积和有序介孔的特征。实施例2固载介孔二氧化硅 的功能化吸头富集内源性多肽(I)固载介孔二氧化硅的功能化吸头富集牛血清白蛋白(BSA)酶解物如图3所示，将固载介孔二氧化硅的功能化吸头连接至移液器后抽/推200 u L20nM BSA酶解物水溶液20次使多肽吸附至功能化吸头，经过200 u L水洗后用5 u L含0. 1%三氟乙酸(TFA)的50%(v/v)乙腈(ACN)解吸。将I y L样品溶液及I y L基质溶液(2mg/mL a -氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)溶解于含0. 1%TFA的50%(v/v)ACN中)滴在质谱靶板上，室温晾干后进行基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱(MALD1-T0F)分析。如图4所示，利用近程MASCOT服务器(Matrix Science, London, UK)进行数据库搜索，未经处理的20nMBSA酶解物只能检测到信噪比较差的两个多肽信号，经过固载介孔二氧化硅的功能化吸头富集后的萃余液检测不到明显的多肽信号，而解吸液中可检测到24个具有高信噪比的多肽信号，这说明固载介孔二氧化硅的功能化吸头具有很高的多肽富集效率。为考察功能化吸头重复利用的可行性，将已重复过30次萃取实验的固载介孔二氧化硅的功能化吸头再次用于萃取20nM BSA酶解物水溶液(步骤同上)，将解吸液用MALD1-T0F进行分析，结果如图5所示，可检测到23个具有高信噪比的多肽信号，这说明制备的功能化吸头在萃取过程中具有良好的稳定性，可重复利用于SPE实验。(2)固载介孔二氧化硅的功能化吸头富集高分子量蛋白如图3所示，将固载介孔二氧化硅的功能化吸头连接至移液器后抽/推200 u L200nM BSA蛋白或者辣根过氧化物酶(HRP)蛋白水溶液20次，经过200 u L水洗后用5 ii L含0. 1%TFA的50% (v/v) ACN解吸。将I y L样品溶液及I U L基质溶液(2mg/mL CHCA溶解于含0. 1%TFA的50%(v/v) ACN中)滴在MALDI靶板上，室温晾干后进行MALD1-T0F分析。如图4及图6所示，未经处理的200nM BSA蛋白或HRP蛋白水溶液可检测到明显的蛋白信号，经过固载介孔二氧化硅的功能化吸头富集后的萃余液可检测到与未处理溶液信号强度相似的蛋白信号，而解吸液中没有检出明显的蛋白信号，这说明固载介孔二氧化硅的功能化吸头对蛋白没有明显吸附效果。综合(1)与(2)的结果，说明固载介孔二氧化硅的功能化吸头具有选择性富集多肽并排阻高分子量蛋白的特征。(3)固载介孔二氧化硅的功能化吸头的灵敏度考察如图3所示，将固载介孔二氧化硅的功能化吸头连接至移液器后抽/推200 y LlnM血管紧张素II水溶液20次使多肽吸附至功能化吸头，经过200 u L水洗后用5 y L含0. 1%TFA的50% (v/v) ACN解吸。将I y L解吸液及I U L基质溶液(2mg/mL CHCA溶解于含0. 1%TFA的50%(v/v)ACN中)滴在MALDI靶板上，室温晾干后进行MALD1-T0F分析。如图7所示，将固载介孔二氧化硅的功能化吸头用于处理极低浓度的多肽样品时，解吸液中仍可检测到高信噪比(S/N42. 9)的多肽信号，这说明固载介孔二氧化硅的功能化吸头在富集多肽时具有高灵敏度。(4)固载介孔二氧化硅的功能化吸头的重现性考察将在三个不同批次制备的固载介孔二氧化硅的功能化吸头分别用于富集20nM人工合成多肽(氨基酸序列为P14R)水溶液。如图3所示，将固载介孔二氧化硅的功能化吸头连接至移液器后抽/推200 ii L20nM人工合成多肽(氨基酸序列为P14R)水溶液20次使多肽吸附至功能化吸头，经过200 u L水洗后用5 ii L含0. 1%TFA的50% (v/v) ACN解吸。将
0.5uL解吸液、0. 5uL内标及I u L基质溶液(2mg/mL CHCA溶解于含0. 1%TFA的50% (v/v)ACN中)滴在MALDI靶板上，室温晾干后进行MALD1-T0F分析。如图8所示，三个功能化吸头处理同一个样品后得到的解吸液中多肽信号相对强度接近，说明制备固载介孔二氧化硅的功能化吸头具有良好的重现性。(5)固载介孔二氧化硅的功能化吸头用于实际样品分析如图3所示，将固载介孔二氧化硅的功能化吸头连接至移液器后抽/推200 y L用水稀释10倍的血浆样品，经过200 ii L水洗两次后用5 ii L含0. 1%TFA的50%(V/V)ACN解吸。将I ii L样品溶液及I y L基质溶液(2mg/mL CHCA溶解于含0. 1%TFA的50% (v/v) ACN中)滴在MALDI靶板上，室温晾干后进行MALD1-T0F分析。如图9所示，由于血浆中高丰度蛋白及高浓度盐的干扰，未经处理的稀释血浆样品无法检测到明显的多肽信号，而经过固载介孔二氧化硅的功能化吸头富集后的解吸液中可检测到丰富的多肽信号，这说明固载介孔二氧化硅的功能化吸头可用于复杂生物样品中内源性多肽的高效富集。实施例3固载C18键合硅胶的功能化吸头的制备及应用(I)固载C18键合硅胶的功能化吸头的制备利用移液枪抽/推有机硅灌封胶使200 U L吸头尖端涂上一层胶膜；加入C18键合硅胶粉末使其固载在吸头尖端的胶膜上；用直径约300 u m的细铁线在固载C18键合硅胶粉末的吸头尖端穿透形成通道；室温下固化24h，用水洗去未固载在胶膜上的粉末，得到尖端固载C18键合硅胶的功能化吸头。以商品化Zip-Tip C18为对照，考察固载C18键合硅胶的功能化吸头对低丰度、高盐浓度的样品进行处理.(2)商品化Zip-Tip C18用于样品脱盐如图3所示，将商品化Zip-Tip C18吸头连接至移液器后抽/推IOii L含IOnM BSA酶解物及IM NaCl的水溶液20次使多肽吸附至功能化吸头，经过10 ii L水洗后用2 y L含
0.1%TFA的80% (v/v) ACN解吸。将I y L样品溶液及I y L基质溶液(2mg/mL CHCA溶解于含
0.1%TFA的50%(v/v) ACN中)滴在MALDI靶板上，室温晾干后进行MALD1-T0F分析。(3)固载C18键合硅胶的功能化吸头用于样品脱盐和富集如图3所示，将固载C18键合硅胶的功能化吸头连接至移液器后抽/推200 y L含IOnMBSA酶解物及IM的NaCl的水溶液20次使多肽吸附至功能化吸头，经过200 u L水洗后用5 ii L含0. 1%TFA的80%(v/v)ACN解吸。将I y L样品溶液及I y L基质溶液(2mg/mLCHCA溶解于含0. 1%TFA的50%(v/v) ACN中)滴在MALDI靶板上，室温晾干后进行MALD1-T0F分析。如图10所示,利用近程MASCOT服务器(Matrix Science, London, UK)进行数据库搜索，含高盐浓度的多肽水溶液经过商品化Zip-Tip C18处理后后只能得到7个多肽信号且信噪比低，而经过固载C18键合硅胶的功能化吸头处理后可检测到25个高信噪比的多肽信号。结果表明，固载C18键合硅胶的功能化吸头在处理盐浓度高且目标分析物浓度低的样品时具有比商品化Zip-Tip C18更好的脱盐性能。实施例4固载二氧化钛的功能化吸头的制备及应用(I)固载二氧化钛的功能化吸头的制备利用移液枪抽/推有机硅灌封胶使20(^ L吸头尖端涂上一层胶膜；加入二氧化钛粉末使其固载在吸头尖端的胶膜上；用直径约300 的细铁线在固载二氧化钛粉末的吸头尖端穿透形成通道；室温下固化24h，用水洗去未固载在胶膜上的粉末，得到尖端固载二氧化钛的功能化吸头。(2)固载二氧化钛的功能化吸头用于富集磷酸化多肽 如图3所示，将二氧化钛的功能化吸头连接至移液器后抽/推30 ii L含I ii M BSA酶解物、IOOnM ^ -酪蛋白酶解物及1%TFA的50%(v/v) ACN溶液20次，经过30 y L含1%TFA的50% (v/v) ACN溶液清洗两次后用30 u L2. 5%氨水解吸。将解吸液旋干后用2 u L基质溶液(20mg/mL2，5- 二羟基苯甲酸溶解于含1%磷酸的50%(v/v)ACN中)重新溶解，取I U L滴在MALDI靶板上，室温晾干后进行MALD1-T0F分析。如图11所示，由于非磷酸化多肽的信号抑制，未处理的样品中无法检测到明显的磷酸化多肽信号，而经过固载二氧化钛的功能化吸头处理后可以检测到高信噪比的3个来自于￠-酪蛋白的磷酸化多肽信号，这说明固载二氧化钛的功能化吸头可用于选择性富集磷酸化多肽。
权利要求
1.一种功能化吸头的制备方法，其特征在于，包括以下步骤 1)利用移液枪将有机硅灌封胶在吸头尖端内壁上形成一层胶膜； 2)向吸头尖端加入粉末吸附剂，使粉末吸附剂固载于吸头尖端的胶膜上； 3)用细铁线穿透固载有粉末吸附剂的吸头尖端，使其形成通道； 4)室温下固化，固化时间>24h，用水洗去未固载在胶膜上的粉末，得到尖端固载粉末吸附剂的功能化吸头。
2.根据权利要求1所述的一种功能化吸头的制备方法，其特征在于所述的有机硅灌封胶为单组份有机硅灌封胶。
3.根据权利要求1或2所述的一种功能化吸头的制备方法，其特征在于所述细铁线直径为 200~400 u m。
4.一种利用权利要求1所述的方法制备的功能化吸头，其特征在于所述的吸头尖端内壁上有固载了粉末吸附剂的胶膜，吸头尖端具有穿透胶膜的孔。
全文摘要
本发明公开了一种功能化吸头，还公开了该功能化吸头的制备方法。该方法首先将有机硅灌封胶涂覆到吸头尖端，再加入粉末吸附剂，并用细铁丝穿透吸头末端，室温固化后即得到末端固载有粉末吸附剂的功能化吸头。该制备方法简单，快速，普遍适用于各种粉末吸附剂。利用该制备方法得到的功能化吸头渗透性好，将其用于蛋白组学及多肽组学的样品预处理，取得了很好的效果。
文档编号B01D15/08GK103055986SQ20121057588
公开日2013年4月24日 申请日期2012年12月26日 优先权日2012年12月26日
发明者冯钰锜, 朱钢添, 罗彦波 申请人:武汉大学