快速分离人参中人参皂苷和残留农药的方法与流程

本发明涉及人参与残留农药分离、药用成分净化领域，具体涉及一种快速分离人参中人参皂苷和残留农药的方法。

背景技术：

人参是一种珍贵的常用中药材,不仅在中医药宝库中占有重要地位,而且在远东其他国家,如韩国、日本和俄罗斯也很受重视。人参皂苷是从人参中分离出来的主要有效成分，它具有抗癌作用等多种功效，是人参营养的主要体现，但由于人们逐渐认识到残留农药对人体和环境的危害，有机氯残留农药含量偏高是制约我国人参以及人参浸膏制品进入国际市场的重要因素之一。

目前，分离人参中残留农药的常用方法有：超临界萃取、水洗法、炮制法、吸附法、反渗透法、有机溶剂萃取法、生物化学法等。但这些方法不能在短时间内分离人参皂苷和残留农药，难以实现高通量获得人参皂苷等药用成分。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的不足而提供一种快速分离人参中人参皂苷和残留农药的方法，该方法能够实现短时间内高效分离极性差异较大的人参皂苷和残留农药，达到快速净化复杂基质中的人参皂苷的效果。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

一种快速分离人参中人参皂苷和残留农药的方法，包括如下步骤：

（1）将人参样品经有机溶剂回流提取后，得到人参提取液；

（2）将所述步骤（1）得到的人参提取液先后经过未活化的碳纤维材料和活性炭纤维；

（3）采用第一流动相洗脱所述步骤（2）得到吸附有残留农药的未活化的碳纤维材料和吸附有人参皂苷的活性炭纤维材料，得到第一组分洗脱液，将所述第一组分洗脱液直接流入废液瓶中，去除人参提取液中强极性水溶性的杂质；

所述第一流动相包括体积终浓度为0.05～0.2%的甲酸溶液与体积终浓度为5～10%的甲醇溶液；

（4）采用第二流动相洗脱所述步骤（3）得到活性炭纤维材料，得到第二组分洗脱液，对所述第二组分洗脱液进行在线ESI-MSMS分析：进入ESI中离子化，后经串联MS分析，得到人参主皂苷；

所述第二流动相包括体积终浓度为0.05～0.2%的甲酸溶液与体积终浓度为80～100%的甲醇溶液；

（5）采用第三流动相洗脱所述步骤（3）得到未活化的碳纤维材料，得到第三组分洗脱液，将所述第三组分洗脱液馏分接入100 µL衬管中，之后定容50 µL，后进GC-MS等仪器分析，得到残留农药的分析，实现人参皂苷和残留农药的快速分离；

所述第三流动相包括体积终浓度为80～100%的二氯甲烷溶液。

进一步地，所述步骤（4）中的第二组分洗脱液中人参主皂苷包括Rb1，Re，Rb2，Rc，Rd，Rg1和Rf。

进一步地，所述步骤（5）中的所述第三组分洗脱液中残留农药包括有有机氯农药、腐霉利。

进一步地，所述步骤（3）中的第一流动相包括体积终浓度为0.1%的甲酸溶液与体积终浓度为8%的甲醇溶液；所述步骤（4）中的第二流动相包括体积终浓度为0.1%的甲酸溶液与体积终浓度为100%的甲醇溶液；所述步骤（5）中的第三流动相为体积终浓度为100%的二氯甲烷溶液。

进一步地，所述步骤（3）中第一流动相的流速为1.5～3.5 mL /h，优选2.5 mL /h；所述步骤（4）中第二流动相的流速为1.5～3.5 mL /h，优选2.5 mL /h；所述步骤（5）中第二流动相的流速为1.5～3.5 mL /h，优选2.5 mL /h。

进一步地，所述人参中的人参主皂苷和残留农药的组分离时间为7.5 min。

进一步地，所述步骤（1）中有机溶剂为80%乙醇溶液或甲醇溶液，所述甲醇的体积浓度为99.9%，水的体积浓度为99.9%。

进一步地，所述步骤（1）中回流提取的温度为75～85℃。

进一步地，所述步骤（1）中回流提取后的人参提取液经过滤膜过滤，所述滤膜的孔径为0.22 μm、0.45 μm或0.6 μm。

本发明提供了一种快速分离人参中人参皂苷和残留农药的方法，以未活化的碳纤维材料和活性炭纤维材料依次对人参皂苷和残留农药进行吸附，未活化的碳纤维材料通过π-π作用力、范德华力和疏水相互作用力等非共价作用力与残留农药结合；活性炭纤维材料，表面粗糙，具有许多含氧的官能团，增强了碳纤维的亲水性，活性炭纤维材料可以与极性较强的人参皂苷结合，同时极性最强的水溶性杂质与两种炭纤维的作用力均很弱，被第一流动相快速洗脱，去除干扰人参皂苷检测的杂质。组分分离与串联质谱离子化过程结合可从人参萃取液中快速检测人参皂苷，能有效提高目标物离子化效率，并减少同时分析的物质降低背景干扰，提高检测灵敏度，可快速去除人参皂苷中残留农药有效维护食品安全；组分分离与紫外检测器结合可离线分析人参皂苷和其中残留的农药，接出的两类物质的馏分可分别进入LC-MSMS和GC-MS进行检测。整个分离时间只需7.5 min，该方法既可以去除人参皂苷中残留农药分析人参皂苷的含量又可分析农药残留量；且本发明提供的分离方法快速，操作简便，对于不同种类人参样品通用性好，装置简易，易于制作成大型自动化装置。

附图说明

图1为本发明实施例中组分分离装置的结构原理示意图。

图2为本发明实施例在线分离检测ESI-MS全扫描模式总离子色谱图。

图3为本发明实施例在线人参皂苷分离检测7种目标物质MRM色谱图。

图4为本发明实施例残留农药GC-MS检测的总离子色谱图。

图5为本发明实施例残留农药GC-MS检测的SIM色谱图。

具体实施方式

一种快速分离人参中人参皂苷和残留农药的方法，包括如下步骤：

（1）将人参样品经有机溶剂回流提取后，得到人参提取液。其中的有机溶剂可以为80%乙醇溶液或甲醇溶液，所述甲醇的体积浓度为99.9%，水的体积浓度为99.9%；回流提取的温度为75～85℃, 回流提取的间隔时间优选为3～5 min，更优选为5 min；回流提取后的人参提取液经过滤膜过滤，所述滤膜的孔径为0.22 μm、0.45 μm或0.6 μm，优选0.45 μm；

（2）将所述步骤（1）得到的人参提取液先后经过未活化的碳纤维材料和活性炭纤维；

（3）利用组分分离装置如图1，转换阀门，采用第一流动相洗脱所述步骤（2）人参提取液先后经过的未活化的碳纤维材料和活性炭纤维，得到吸附有残留农药的未活化的碳纤维材料和吸附有人参皂苷的活性炭纤维材料，得到第一组分洗脱液，将所述第一组分洗脱液直接流入废液瓶中，去除人参提取液中强极性水溶性的杂质；

所述第一流动相包括体积终浓度为0.05～0.2%的甲酸溶液与体积终浓度为5～10%的甲醇溶液；优选：0.1%的甲酸溶液与8%的甲醇溶液；

所述第一流动相的流速为1.5～3.5 mL /h，优选2.5 mL /h；

（4）采用第二流动相洗脱所述步骤（3）得到活性炭纤维材料，得到第二组分洗脱液，对所述第二组分洗脱液进行在线ESI-MSMS分析：进入ESI中离子化，后经串联MS分析，得到人参主皂苷；

所述第二流动相包括体积终浓度为0.05～0.2%的甲酸溶液与体积终浓度为80～100%的甲醇溶液；优选：0.1%的甲酸溶液与100%的甲醇溶液；

所述第二组分洗脱液中人参主皂苷包括Rb1，Re，Rb2，Rc，Rd，Rg1和Rf；

所述第二流动相的流速为1.5～3.5 mL /h，优选2.5 mL /h；

（5）离线操作，断开装置与质谱连接线，采用第三流动相洗脱所述步骤（3）得到未活化的碳纤维材料，得到第三组分洗脱液，将所述第三组分洗脱液馏分接入100 µL衬管中，之后定容50 µL，后进GC-MS等仪器分析，得到残留农药的分析，实现人参皂苷和残留农药的快速分离，分离时间约为7.5 min；

所述第三流动相包括体积终浓度为80～100%的二氯甲烷溶液，优选100%的二氯甲烷溶液；

所述第三流动相的流速为1.5～3.5 mL /h，优选2.5 mL /h；

所述第三组分洗脱液中残留农药包括有有机氯农药（六六六，滴滴滴）、腐霉利。

在本发明中采用东北地区人参为分析样品，所述植物样品的部位优选为根部。本发明对所述人参的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的人参的来源即可。所述人参样品无需前处理过程。

在本发明中，所述人参样品与萃取溶剂的质量体积比优选为1 g：5 mL～1 g：15 mL，更优选为1 g：10 mL。

附图1为本发明人参提取液分离人参皂苷和残留农药所用装置的结构示意图，1、第一流动相试剂瓶；2、第二流动相试剂瓶；3、第三流动相试剂瓶；4、泵1；5、泵2；6、泵3；7、控制器；8、进样阀；9、阀1；10、阀2；11、填充有未活化的碳纤维材料微型柱；12、阀3；13、填充有活性炭纤维的微型柱；14、阀4；15、废液筒；16、质谱检测器。

附图1展示了A、B、C、D 进样后4种不同阶段的情况：

A状态为第一流动相对填充有未活化的碳纤维材料微型柱和填充有活性炭纤维的微型柱润洗的过程，第一流动相进入装置内，在控制器7的作用下，设置一定流速，其中将阀1和阀4断开，阀2和阀3闭合，使第一流动相先后通过填充有未活化的碳纤维材料的微型柱11和填充有活性炭纤维的微型柱13，用废液筒15收集排出的废液，达到润洗未活化的碳纤维材料的微型柱11和填充有活性炭纤维的微型柱13的目的；

B状态为去除强极性杂质的洗脱过程，人参提取液样品均由进样阀8手动进样进入装置内，在控制器7的作用下，设置一定流速，其中将阀1和阀4断开，阀2和阀3闭合，使第一流动相先后通过填充有未活化的碳纤维材料的微型柱11和填充有活性炭纤维的微型柱13，用废液筒15收集排出的人参中强极性杂质废液，填充有未活化的碳纤维材料的微型柱11结合弱极性农残，填充有活性炭纤维的微型柱13结合上人参主皂苷；

C状态为人参主皂苷的洗脱过程，第二流动相在控制器7的作用下到达进样阀8，设置一定流速，其中将阀2和阀4断开，阀1和阀3闭合，使第二流动相仅通过填充有活性炭纤维的微型柱13，使结合在填充有活性炭纤维的微型柱13的人参主皂苷洗脱下来，得到的第二组分洗脱液，在线进行离子化得到人参主皂苷质谱图；

D状态为残留农药的洗脱过程，拧开与质谱连接的接头，第三流动相在进样阀8的作用下进入装置中，在控制器7设置一定流速，将阀2和阀4闭合，阀1和阀3断开，使第三流动相仅通过填充有未活化的碳纤维材料的微型柱11，使结合在填充有未活化的碳纤维材料的微型柱11上的残留农药洗脱下来，得到的第三组分洗脱液经管线流出，接出该馏分，后进入GC-MS分析检测。

在本发明中，所述未活化的碳纤维材料和活性炭纤维的表面是不同的。所述未活化的碳纤维材料表面未经过修饰，所述活性炭纤维的表面为是经表面修饰氧元素。本发明中对所述未活化的碳纤维材料和活性炭纤维的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员熟知的未活化的碳纤维材料和活性炭纤维的来源即可。在本发明实施例中，所述未活化的碳纤维材料和活性炭纤维是商业化产品。

所述未活化的碳纤维材料和活性炭纤维材料优选作为填充材料填充到微型柱中，将植物萃取液依次通过填充有未活化的碳纤维材料的微型填充柱和填充有活性炭纤维材料的微型填充柱。所述微型柱的长度优选为5 cm，所述微型柱的内经优选为0.75 mm。

在本发明中，所述填充碳纤维材料的填充度优选为6000～8000根，更优选为7000根；所述填充活性炭纤维材料的填充度优选为3000～4000根，更优选为3500根。

得到吸附有残留农药的未活化的碳纤维材料和吸附有人参皂苷的活性炭纤维材料后，本发明用第一流动相先后对所述未活化的碳纤维材料和进行第一次洗脱，得到第一组分洗脱液和经第一次洗脱后的未活化的碳纤维材料和活性炭纤维材料。

在本发明中，所述第一流动相优选采用注射泵导入。所述的注射泵为多通道单独调控的低压注射泵，在低压下实现高效分析。

在本发明中，所述第一流动相优选包括体积终浓度为0.1%的甲酸溶液和体积终浓度为8%的甲醇溶液。

在本发明中，所述第一流动相的流速优选为1.5～3.5 mL /h，更优选为2.5 mL /h。

在本发明中，所述第一次洗脱时间优选为0.5～1.5 min，更优选为1 min。

在本发明中，所述离子化过程的条件优选满足如下条件：

离子源条件：ESI离子源正离子MRM模式检测，毛细管电压优选为3500～4500V，更优选为4000 V，干燥气流速优选为8～14L / min，更优选为11 L / min，喷雾器电压优选为10～25psi；更优选为15 psi，干燥气温度优选为250～320℃，更优选为300℃；

质谱检测条件：各目标物母离子及相应子离子如表所示，Fragmentor为毛细管出口电压（单位：V），CE为碰撞能(单位：eV)，Delta为扫描频率100 μs。

表1 目标物质离子化条件及MRM模式检测参数。

本发明中，所述人参主皂苷包括Rb1，Re，Rb2，Rc，Rd，Rg1和Rf。

得到经第一次洗脱后的未活化的碳纤维材料和活性炭纤维材料后，本发明用第二流动相对经第一次洗脱后的未活化的碳纤维材料和活性炭纤维材料进行第二次洗脱，得到第二组分洗脱液和第二次洗脱后活性炭纤维材料和第一次洗脱后未活化的碳纤维材料。

在本发明中，所述第二流动相优选采用注射泵导入。所述的注射泵为多通道单独调控的低压注射泵，在低压下实现高效分析。

在本发明中，所述第二流动相优选包括体积浓度0.1%的甲酸溶液和体积浓度为100%的甲醇溶液。

在本发明中，所述第二流动相的流速优选为1.5～3.5 mL /h，更优选为2.5 mL /h。

在本发明中，所述未活化的碳纤维材料和活性炭纤维材料与紫外检测器联用，操作环境安全。

得到第二次洗脱后的未活化的碳纤维材料和活性炭纤维材料，本发明优选还包括：将第三流动相通过第一次洗脱后的未活化的碳纤维材料，分离人参中结合在未活化的碳纤维材料上的残留农药，同时冲洗、平衡纤维材料，以便下次循环筛选时使用。

在本发明中，所述第三流动相优选包括体积浓度为二氯甲烷溶液。所述第三流动相的洗脱时间优选为2～3 min，更优选为2 min。

在本发明中，所述第三流动相的流速为1.5～3.5 mL /h，更优选为2.5 mL /h。

下面结合实施例对本发明提供的一种快速分离人参中人参皂苷和残留农药的方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

称取人参样品1 g，经80%乙醇水溶液82℃条件下回流提取，旋转蒸发浓缩，过0.45 μm滤膜定容，后直接由微量注射器注入到进样器内，搬动进样器阀门，完成进样；断开阀门1和阀门2，调节注射泵控制器令泵1推动第一流动相，流速为2.5 mL/ h，样品在第一流动相的带动下进入到由未活化的碳纤维微型柱和活化的炭纤维微型柱，人参提取液中不同极性的组分与两个微型柱的作用机理不同，分别被选择性地保留在不同的微型柱上；（3）第一流动相洗脱后，得到第一组分洗脱液，去除人参提取液中强极性杂质；（4）关闭阀门1、断开阀门2并调节注射泵令泵2推动第二流动相洗脱活化的炭纤维微型柱，流速为2.5 mL/ h进行洗脱得到第二组分洗脱液，经检测器在线进行离子化后进入质谱等仪器进行分析；（5）断开阀门1、关闭阀门2并调节注射泵令泵3推动第三流动相洗脱未活化的碳纤维微型柱，流速为2.5 mL/ h进行洗脱得到第三组分洗脱液，经管线接出的第三组分馏分，后可进入GC-MS等仪器进行分析；（6） 断开阀门1、断开阀门2并调节注射泵令泵3推动第二流动相，流速调节至5.0 mL/ h，调节MS/MS检测器状态为waste，完成冲洗、平衡微型柱过程，以便下次循环筛选时使用。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。