本发明属于有机物分析领域，尤其涉及一种玉米赤霉烯酮免疫亲和柱的再生方法。
背景技术：
玉米赤霉烯酮(Zearalenone，简称ZEN)，又称F-2毒素，主要是由镰刀菌属(Fusarium)，如禾谷镰刀菌(F.graminearum)和三线镰刀菌(F.tricinctum)等产生的一类具有雌激素活性的非类固醇类，主要污染玉米、小麦、大米、大麦、小米和燕麦等谷物，可直接通过污染的谷类等作物进人和动物体内，亦可通过被污染的肉、奶等动物性食品进入人体，是真菌毒素中污染严重且对人和动物危害较大的毒素之一，可导致繁殖障碍、生长发育受阻、免疫抑制、诱发肿瘤等。
ZEN是世界上污染范围最广的一种镰刀菌毒素，在欧洲、非洲、亚洲、北美洲、南美洲以及大洋洲等世界各地的谷物以及农副产品中都检测到ZEN的存在。ZEN在我国饲料原料及配合饲料中的污染情况也普遍存在。2012年度我国饲料与原料中真菌毒素检测报告显示，饲料中ZEN阳性平均值为977μg/kg，污染最高可达2968μg/kg。对ZEN的监测控制形势十分严峻，目前国际上较为常用的检测真菌毒素样品前处理方法之一是免疫亲和柱法。
免疫亲和柱是20世纪90年代在分析领域得到应用的一种新技术，它是将一定量的单克隆抗体偶联在合适的担体上，制成相应的免疫亲和柱。该柱具有高选择性吸附和抗干扰的特性，净化效果好，检测灵敏度高。但目前市面上的免疫亲和柱产品价格比较昂贵，单只柱体在100元以上，而且免疫亲和柱为一次性使用，未对其进行再生利用，这对于一般的实验室、检验或科研而言成本将大大增加，从而限制了研究工作的开展。
技术实现要素：
本发明提供了一种玉米赤霉烯酮免疫亲和柱的再生方法，该方法简单易行，所使用的试剂低毒环保，可极大地节约检测成本。
为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案为：
一种玉米赤霉烯酮免疫亲和柱的再生方法，包括以下步骤：
将注射器连接于已使用的玉米赤霉烯酮免疫亲和柱的上部，用10-15ml体积比为7:3的甲醇-水溶液、以2-3滴/秒的速度冲洗所述玉米赤霉烯酮免疫亲和柱；
待甲醇-水溶液排干后，用10-15ml水、以2-3滴/秒的速度冲洗所述玉米赤霉烯酮免疫亲和柱；
待水排干后，用磷酸盐缓冲溶液完全填充柱体，于2℃-8℃冷藏保存。
作为优选技术方案，所述已使用的玉米赤霉烯酮免疫亲和柱中所上样的溶液中玉米赤霉烯酮总量不超过2000ng。
作为优选技术方案，所述已使用的玉米赤霉烯酮免疫亲和柱中所上样的溶液的pH值在6-8之间。
作为优选技术方案，所述玉米赤霉烯酮免疫亲和柱可再生利用至少3-6次。
作为优选技术方案，无基质干扰时，玉米赤霉烯酮免疫亲和柱可再生利用至少6次；对于复杂基质样品，玉米赤霉烯酮免疫亲和柱可再生利用3次。
作为优选技术方案，无基质干扰时，所上样的溶液为配制的玉米赤霉烯酮标准品溶液，所述复杂基质样品选自玉米蛋白饲料、玉米皮粉、玉米粒、玉米粉中的任意一种。
作为优选技术方案，在使用再生方法处理的所述玉米赤霉烯酮免疫亲和柱前，需要将所述玉米赤霉烯酮免疫亲和柱提前20-30分钟回温至室温。
作为优选技术方案，所述玉米赤霉烯酮免疫亲和柱在使用后需要立即再生处理。
与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：
本发明为玉米赤霉烯酮免疫亲和柱的重复利用建立了一套可操作性极强的再生方法，该方法所使用的试剂低毒环保，不仅操作快速简便，还可有效地节约成本，能够极大满足检验检疫工作的需要。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例提供了一种玉米赤霉烯酮免疫亲和柱的再生方法，包括以下步骤：
S1：将注射器连接于已使用的玉米赤霉烯酮免疫亲和柱的上部，用10-15ml体积比为7:3的甲醇-水溶液、以2-3滴/秒的速度冲洗所述玉米赤霉烯酮免疫亲和柱。
在本步骤中，所使用的玉米赤霉烯酮免疫亲和柱的规格为小于1ml，使用10-15倍柱体积的甲醇-水溶液冲洗玉米赤霉烯酮免疫亲和柱，可确保柱体中的残留物得到有效清除。具体的，在本步骤中还限定了甲醇-水的体积比以及冲洗速度，主要是考虑到简化操作过程，同时兼具冲洗效果，在确保操作可行性的前提下，可有效提高工作人员的检测效率。进一步，在本步骤中，在使用注射器向柱体内注射溶液时，可以对注射器施加正压或负压，以确保溶液可按预期流速冲洗柱体。可以理解的是，当使用其它规格的柱体时，所加入的溶液可按上述倍数进行调整。
S2：待甲醇-水溶液排干后，用10-15ml水、以2-3滴/秒的速度冲洗所述玉米赤霉烯酮免疫亲和柱；
在本步骤中，在柱体排干上述溶液后，继续加入水主要是为了将上步反应中残留在柱体内的甲醇-水溶液冲洗干净，并进一步去除柱体内的杂质。
S3：待水排干后，用磷酸盐缓冲溶液完全填充柱体，于2℃-8℃冷藏保存。
在本步骤中，使用磷酸盐缓冲溶液填充柱体主要是为了让柱体的活性得以复苏，从而可被继续利用。其中，所使用的磷酸盐缓冲溶液的pH为7，不宜过酸过碱，以避免影响柱体的整体活性，以及再次使用时抗原与柱体内抗体的结合性。
本发明上述实施例为玉米赤霉烯酮免疫亲和柱的重复利用建立了一套可操作性极强的再生方法，该方法所使用的试剂低毒环保，不仅操作快速简便，还可有效地节约成本，能够极大满足检验检疫工作的需要。
在一优选实施例中，所述已使用的玉米赤霉烯酮免疫亲和柱中所上样的溶液中玉米赤霉烯酮总量不超过2000ng。在本实施例中，具体限定了柱体内上样样品中玉米赤霉烯酮的最大含量。为了确保柱体可对玉米赤霉烯酮有效结合，当上样样品浓度过大时，应对其进行适当稀释，以确保柱体可对其进行有效处理。
在一优选实施例中，所述已使用的玉米赤霉烯酮免疫亲和柱中所上样的溶液的pH值在6-8之间。在本实施例中，为了避免上样样品偏酸或偏碱对抗原以及柱体内相应抗体结合的影响，在处理上样样品时，应对其pH值进行控制，优选控制在6-8之间。
在一优选实施例中，所述玉米赤霉烯酮免疫亲和柱可再生利用至少3-6次。这里需要说明的是，免疫亲和柱的工作原理是柱体中含有连接单克隆抗体的凝胶悬浮物，抗体对毒素有特异吸附性，上样样品被柱体中免疫吸附剂上的抗体吸附后，先用水淋洗除去柱上吸附的杂质，再用甲醇即可洗脱下目标物。这也就是说，经甲醇洗脱后，柱体内可能残留含量不同程度的玉米赤霉烯酮以及部分杂质，在这种情况下，只要通过有效手段将其从柱体内洗脱下来即可实现对柱体的再生利用。经方法优化以及试验证明，对于柱体内不同程度的残留物含量，可使柱体再生利用至少3-6次。
在一优选实施例中，对于无基质干扰时，玉米赤霉烯酮免疫亲和柱可再生利用至少6次；对于复杂基质样品，玉米赤霉烯酮免疫亲和柱可再生利用3次。在本实施例中，对于无基质干扰时，在柱容量范围内，免疫亲和柱在使用6次后不会对回收率有显著影响。这里需要说明的是，所谓的无基质干扰是指所上样的溶液为配制的玉米赤霉烯酮溶液，利用玉米赤霉烯酮标准品进行测试主要是为了模拟样品中含有玉米赤霉烯酮的情况，在此基础上对柱体进行再生试验发现，样品回收率并没有显著下降，这说明了上样的溶液中不论是否含有玉米赤霉烯酮并不是影响柱子重复利用的主要因素。而对于复杂基质样品而言，免疫亲和柱在使用3次后回收率显著下降，这主要可能是上样的溶液中所含有的除玉米赤霉烯酮以外的其它物质对亲和柱中抗体造成干扰或破坏。
在一优选实施例中，无基质干扰时，所上样的溶液为配制的玉米赤霉烯酮标准品溶液，所述复杂基质样品选自玉米蛋白饲料、玉米皮粉、玉米粒、玉米粉中的任意一种。在本实施例中，玉米赤霉烯酮免疫亲和柱主要是用于分析含有玉米赤霉烯酮成分的样品，其中，检测对象优选上述所列举的样品种类。可以理解的是，玉米赤霉烯酮免疫亲和柱可检测的样品并不局限于上述所列举的，这可根据本领域技术人员的实践经验进行选择。
在一优选实施例中，在使用再生方法处理的所述玉米赤霉烯酮免疫亲和柱前，需要将所述玉米赤霉烯酮免疫亲和柱提前20-30分钟回温至室温。在本实施例中，由于处理后的玉米赤霉烯酮免疫亲和柱在再生后，需要保存在低温下，因此为了确保在再次利用之前，能够使柱体内的抗体活性得以复苏，需要在使用前20-30分钟将其回温至室温，以供使用。
在一优选实施例中，所述玉米赤霉烯酮免疫亲和柱在使用后需要立即再生处理。在本实施例中，免疫亲和柱在使用后需立即进行再生处理，这样可避免柱体内残留过多杂质影响其活性的恢复。但需要说明的是，在再生处理之后，应避免立即投入再次重复使用中，这样做会导致抗体没有复性的时间，从而导致回收率的明显下降。
为了更清楚详细地介绍本发明实施例所提供的玉米赤霉烯酮免疫亲和柱的再生方法，下面将结合具体实施例进行描述。
实施例1
1、实验材料
1.1仪器与设备
液相色谱质谱联用仪：Agilent 1290-6460；万分之一天平：Mettler AE163；振荡器：IKA MS1；摇床；免疫亲和柱净化装置；玉米赤霉烯酮免疫亲和柱(华安麦科)；量筒；一次性注射器10ml。
1.2试剂和材料
甲醇(液相色谱纯)；乙腈(液相色谱纯)；去离子水；快速定性滤纸；微纤维滤纸；氯化钠；氯化钾；磷酸氢二钾；磷酸氢二钠；玉米赤霉烯酮标准品(SIGMA-ALDRICH公司)
Pbs缓冲液：8g Nacl、0.2g Kcl、1.16g Na2HP04·12H20、0.2g KH2P04加入800ml超纯水溶解，定容至1L。
1.3标准溶液的配制
准确称取10mg玉米赤霉烯酮标准品用甲醇溶解，准确定容至100mL，得浓度为100μg/mL的标准储备液，避光于-20℃下保存。使用时，用甲醇水(70+30，V/V)将储备液分别稀释至20、50、100、200、500ng/ml。
2、实验方法
2.1样品提取
准确称取5.0g±0.01g玉米蛋白饲料样品，加入25ml提取液(80％乙腈-水溶液)，涡旋混匀2min；置于摇床上(200-300r/min)剧烈振荡20min，用快速定性滤纸过滤，收集滤液。取10ml滤液加入40ml水稀释，再用微纤维滤纸过滤，并收集滤液作为上样液。
2.2样品净化
取出免疫亲和柱，将上方的塞子取出剪断，再插回亲和柱上；将柱体与10ml注射器连接固定于操作架上，去掉亲和柱下方堵头，调节开关，使液滴以2滴/秒的速度流出，取25ml上样液逐步加入注射器中；待液体排干后，用10ml去离子水洗涤2遍；排干后，加入1ml甲醇洗脱，流速为1滴/秒，收集洗脱液。取0.5ml洗脱液加入0.5ml水，过0.22μm滤膜上机。
2.3液相色谱串联质谱条件
2.3.1液相色谱条件
色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C18(1.8μm,2.1*100mm)；柱温：35℃，流速：0.3ml/min,进样量：10μL；流动相：A水，B乙腈，梯度洗脱程序：0→1.0min,40％B；1.0→3.0min,40％B→95％B；3.0→6.0min,95％B；6.0→6.1min,40％B；6.1min→8min，40％B。
2.3.2质谱条件：
电喷雾离子源；负离子扫描；多重反应监测；GAS Temp：320℃；GAS Flow：8L/min；Nebulizer：30psi，具体可参见表1。
表1.玉米赤霉烯酮的质谱参数
“*”表示定量离子
2.4使用过的免疫亲和柱的处理方法
使用过的免疫亲和柱用2×10mL甲醇+水(70+30，V/V)冲洗，调节流速约为3滴/s，再用2×10mL水冲洗，流速也为3滴/s。最后用Pbs缓冲溶液填充柱体，放入2-8℃冰箱内保存。
3实验结果
3.1方法精密度和回收率
在不含玉米赤霉烯酮的玉米蛋白饲料阴性样品中按照100μg/kg、200μg/kg、500μg/kg添加玉米赤霉烯酮标准品，按照2.1和2.2实验操作处理，按照2.3测定条件测得的精密度和回收率。结果见表2和表3。
表2.方法精密度
表3.方法回收率
3.2测定无基质干扰时对免疫亲和柱的再生次数
取玉米赤霉烯酮标准品，用16％的乙腈水稀释成浓度为20ng/ml的溶液作为样品溶液，进行回收试验，重复使用6次，结果见表4。玉米赤霉烯酮免疫亲和柱经过6次试验，回收率(n＝6，RSD＝99.97％)的结果无明显差异，仍在85％以上，见表4。由此可见，在无基质干扰的情况下，玉米赤霉烯酮免疫亲和柱可再生重复使用至少6次。
表4无基质干扰时对亲和柱回收试验结果
3.3测定复杂基质样品(含有玉米赤霉烯酮的玉米蛋白饲料阳性样品)在使用后对玉米赤霉烯酮免疫亲和柱重复利用情况
取玉米蛋白饲料样品，按照500μg/kg的标准加入玉米赤霉烯酮标准品，制成含有玉米赤霉烯酮的阳性样品，按照实验方法进行操作考察免疫亲和柱的重复利用情况，结果见表5。玉米赤霉烯酮的回收率随着使用次数的增加在逐渐降低，前三次实验，免疫亲和柱的回收率(n＝6，RSD＝99.97％)在80％以上，满足实验要求。从第四次开始，回收率下降至60％左右，可能是基质中的某些物质对亲和柱中抗体造成干扰，抑制了其结合，导致无法满足实验要求。
表5复杂基质样品对亲和柱回收试验结果
实施例2
免疫亲和柱处理方法对重复利用的影响
取玉米赤霉烯酮标准品，用16％的乙腈水稀释成浓度为20ng/ml的溶液作为样品溶液，研究不同处理方法对免疫亲和柱回收率的影响。样品溶液经过免疫亲和柱净化后：A:立即用甲醇-水、水洗涤，置于PBS中过夜放置；B:空气中暴露3小时后，用甲醇-水、水洗涤，置于PBS中过夜放置；C:甲醇中浸泡3小时后，用甲醇-水、水洗涤，置于PBS中过夜放置，D:用甲醇-水、水洗涤后，继续使用。回收结果见表6。
表6.免疫亲和柱不同的处理方法对重复利用的影响
由表6数据可知，免疫亲和柱的净化受很多因素的影响，比如：温度、pH值、柱容量等。该实验中抗体在空气中暴露3小时后，玉米赤霉烯酮回收率有明显的下降，回收率仅为71.08％，说明柱体干燥会影响回收率；免疫亲和柱在处理后立即重复使用，抗体没有复性的时间，也导致回收率有明显下降；同时，有机试剂会使抗体变性，长时间处于甲醇中会使回收率显著下降。