用于样品分析与处理的快速热循环的制作方法

本发明涉及进行样品中核酸扩增反应的方法和装置。

背景技术：

聚合酶链式反应(pcr)对于分子生物学，食品安全和环境监测日益重要。许多生物学研究人员在他们的核酸分析工作中使用pcr，因为pcr拥有高灵敏度和高特异性。pcr的时间周期通常约为1小时，主要是由于耗时的pcr热循环过程，该过程将含有样品的反应器加热并冷却至不同的温度以进行dna变性，退火和延伸。通常，热循环设备和方法采用在两个加热浴槽之间移动反应器，所述两个加热浴槽的温度被设定为核酸扩增反应所需的目标温度。研究人员一直都在致力于提高热循环的速度。

热电冷却器(tec)或珀尔帖冷却器也被用作加热/冷却元件。然而，它所提供典型的1-5℃/秒的升温速率在改变反应器温度方面算是缓慢的，这不利地加长了热循环的时间。

作为通过减少热质量来提高pcr速度的尝试，具有嵌入式薄膜加热器和传感器的微加工pcr反应器已被开发出来，以在74℃/秒的冷却速率和约60-90℃/秒的加热速率下实现更快的热循环。然而，这种用于制造pcr装置的晶片制造工艺非常昂贵，因此在满足生物测试中低成本一次性应用的要求方面不切实际。

也有报道指出，相比采用热电冷却器的热循环仪，在封闭容器中以热空气和冷空气交替冲洗反应器的方法可以获得更快的温度攀升。然而，从热传导的角度来看，空气的导热系数和热容量远比液体的低，因此空气循环仪的升温速度比液体的慢。tec需要大量的时间来加热和冷却其本身以及tec上方的加热块。此外还需要克服加热块和反应器之间的接触热阻。

交替型水冲洗循环器也已被开发出来，以两个温度相异的水交替冲洗反应器以加快pcr的速度。但是，这些装置包含许多泵，阀门和管道连接器，这些连接器在处理高温和高压时增加了维护的复杂性并降低了可靠性。使用循环液体浴介质时，液体通常从浴液中溢出。

传统水浴pcr循环仪利用水的高导热性和热容量来实现有效的温度加热和冷却。但是，这样的循环器使用了包含大量水的大体积加热槽，而大水量使注水和放水过程难以掌控，这也使在热循环能开始之前，加热到目标温度的时间太长。这样的循环器设备沉重且功耗高。槽内的水在使用过程中会蒸发，需要添加。此外，在热循环中，每次所述反应器被交替插入这些水浴槽中，当反应器从水浴槽中取出时，一层水附着在反应器上，从而拖慢所述反应器内部的温度变化。

研究人员还测试了以不同温度的移动加热辊交替接触反应器。然而，长管式反应器的使用不仅使安装和操作大量反应器麻烦，而且昂贵。当反应器处于大型阵列或面板中时，在所有反应器中实现加热均匀性可能具有挑战性。

本发明提供了一种已被改良的方法和装置，用于在不使用复杂和昂贵的部件或耗材的情况下以超高速度和实惠的成本实现pcr。此装置坚固、轻便、使用方便、只需少量浴槽介质，能处理一次性反应材料，从而避免一个反应器与下一个反应器互相污染。本发明为生物分析领域带来了非常积极的影响。

技术实现要素：

除非特别说明，否则术语“包括”和“包含”及其语法变体旨在表示“开放”或“包容性”语言，使得它们包括所记载的要素，但也允许包含额外未列举的要素。单词“基本上”并不排除“完全”。术语“第一浴槽”，“第二浴槽”，“第六浴槽”并不构成按照顺序的相应浴槽，而仅用于根据它们个别的功能进行识别。这些浴槽可能并不代表独立的实体，因为它们中的一些可能是可共享的。术语“热处理”包括：a)热循环，并且可选地包括：b)热循环之前和/或之后的热处理步骤。术语“热曲线”是指单单在(a)期间或在(a)和(b)期间反应器随着时间的温度变化。

根据第一方面，本发明提供了一个用于在热曲线里进行核酸热处理的方法，此法使用至少一个第一浴槽和一个第二浴槽，浴槽内的浴槽介质可分别被维持在两个不同的温度，此法还使用了一个反应器握持架以握持反应器，每个反应器装有包含核酸的反应材料，反应器可以是任何形式的，比如管状容器或多孔板或芯片或卡盒，此法包括交替地让反应器进入两个浴槽进行多次热循环以交替地达到预定的高目标温度tht，和预定的低目标温度tlt，其中至少一个浴槽内的浴槽介质是高导热粉末。相对液体浴槽介质而言，高导热率粉末增强了与反应器之间的热传导，使浴槽内的温度分布均匀，也改善了反应器表面的温度均匀性。将浴槽加热至预定温度的初始加热时间也显著减少。粉末也消除了在反应器转移于各浴槽之间时液体粘附于反应器表面的问题，此问题造成浴槽内温度与其校准的偏移。此液体粘附也造成即使反应器已被从浴槽中取出，仍保持在浴槽温度一段时间。粉末可以避免这种情况。使用了粉末，当反应器插入浴槽介质时，飞溅情况会显著改善。此外，粉末不会随着时间或使用而蒸发，因此不需要像液体一样再填充。

根据一个有利的实施方案，所述方法包括：在第一浴槽中，使反应器达到tht，其中tht处于85-99摄氏度的区域中，用于核酸的预变性和变性；并在第二浴槽中使反应器达到tlt，其中tlt处于45-75摄氏度的区域用于引物或探针与核酸退火或引物延伸，第一和第二浴槽用于使反应器热循环以实现聚合酶链式反应(pcr)扩增或引物延伸。

根据一个有利的实施方案，所述方法还使用第三浴槽，此法包括：在热循环过程中，将第三浴槽的浴槽介质保持在中等温度；并允许反应器处于第三浴槽中以达到与核酸中引物延伸，或引物或探针于核酸的退火相对应的预定中等目标温度tmt。此法可进一步采用一个第四浴槽，此法包括：在热循环之前，让反应器处于第四浴槽中以允许反应器经历以下附加处理组合：反转录聚合酶连锁反应(rt-pcr)、热启动过程，和等温扩增反应。第三和/或第四浴槽可根据不同的反应材料和分析过程而灵活地达到各种热曲线。由于第一方面描述的优点，第三和第四浴槽中的浴槽介质也可以是高导热率粉末。此法也能允许反应器在热循环过程中处于空气区域内以为核酸进行荧光成像或电化学检测。此空气区域为光学成像处理提供了一种透明介质，这是装有粉末的浴槽无法提供的。在一个替代实施例中，该方法包括：采用第一光纤装置，用于将来自照明光源的光投射到反应材料中；以及采用第二光纤装置将光从反应材料传输到光电探测器。

当反应器是由金属管制成，而且当设备需要在反应器处于粉末内时成像，此法就特别有用。

高导热率粉末可以是金属粉末或是分散于液体中(例如油、甘油、水或其任何混合物)的金属粉末，因为液体填充了粉末颗粒之间的空隙，而且液体的导热性和热容量远高于空气。在反应器进入浴槽时，液体也能降低其摩擦阻力。然而，当反应器被抽离浴槽时，油/甘油会粘附在反应器的表面。该粉末可以包含基本球形的金属颗粒，以在接收反应器时降低摩擦阻力。优选的粉末是粒径为1μm-5mm的铜粉。已知铜粉具有非常高的导热率，而且所述颗粒尺寸被发现对于直径为0.1mm-5mm的市售反应器具有低摩擦阻力。浴槽内的颗粒大小可以变化，以便在反应器插入的容易性和传热速率之间优化。

根据一个实施方案，所述方法包括当以管或孔板的形式使用所述反应器时，所述反应器的至少一个特征包括：在所述反应器的底端有一层金属和一个或多个反应器的底端比其余反应器更尖且横截面积更小，以在粉末接收反应器时降低摩擦阻力。

根据一个实施方案，该方法进一步包括：在热循环之后，使反应器在第五浴槽中逐渐加热；并且在逐步加热期间进行熔解曲线分析以用于热循环之后的后续研究。

此法可有利地包括：使用反应器防护装置来局部防护反应器以防止反应器在进入粉末时因阻力和tht而变形或破裂。金属粉末的致密性越高，传热速率越高，但是以增加阻力为代价。

根据一个实施例，所述方法还包括通过温度导向运动控制装置(tegmcm)获得目标温度，所述温度引导运动控制装置基于在热循环期间由反应器温度传感器感测的实时温度来操作。该方法以更高的精度提供热循环，并且不需要用户校准，但由于需要非常快速的温度采样和信号处理电子器件，与反应器转移装置的快速数据通信以及非常敏感的机械运动部件，例如反应器转移装置内的电机与致动器，所以设备的成本和复杂度较高。在一个替代实施例中，该方法还包括通过时间导向运动控制装置(tigmcm)获得目标温度，该时间引导运动控制装置基于反应器允许在浴槽中的时间周期进行操作。该方法可以进一步包括在该时间周期内校准tigmcm。这个实施例要求装置的复杂性较低，因为它按时间持续工作，因此虽然需要用户校准，但不需要高敏感度的设置。该方法可以进一步包括校准转移装置以在反应器达到低于tht的第一提离温度时，和在高于tlt的第二提离温度时，开始将反应器从浴槽中提离，以弥补由操作电机延迟所造成对反应器不必要的过度加热或过度冷却。

根据第二方面，本发明提供了对应于方法权利要求的设备权利要求。该装置可以进一步包括摇动装置，用于在反应器进入浴槽时摇动以下组合里的最少一件：浴槽、反应器和a)与b)，以使反应器被加热的分段保持不变，以及减少反应器进入粉末时所承受的阻力。

根据第三方面，本发明提供了反应器防护装置，此装置包含了围护装置以局部围护反应器，以便防止反应器在进入含有高导热率的浴槽介质时因阻力和tht而变形。防护装置可以由金属、玻璃、高温塑料或陶瓷等所组成材料制成，这些材料具有足够的强度以易于穿透粉末，并在反应器进入粉末浴槽时为反应器开路。为了较低复杂性的方便，反应器护罩可以是反应器握持架的延伸部分。

根据第四方面，当以管或孔板形式存在时，反应器设置有至少一个由以下组成的组合的特征：位于反应器底端的金属层以及反应器底端的横切面积比反应器其余部分小，从而使反应器底端较为尖锐，以在高热导率粉末接收反应器时降低摩擦阻力。

本发明也让基于pcr的核酸分析-从浴槽加热准备到反应器热循环和荧光信号采集-能在短短几分钟内完成。

附图说明

在以下附图中，相同的参考号码通常始终指代相同部件。图纸并不是按比例绘制的，而是着重描述概念。

图1是根据本发明的一个实施例，以铜粉为浴槽介质，为包含核酸的反应材料进行热循环的设置的示意图。

图2是如图1所示用于热循环过程的装置的一个实施例的等距视图。

图3是具有图2中的设备的光学模块的反应器阵列和浴槽的实施例的等距视图。

图4a和4b是典型的2步和3步pcr过程以及熔解曲线分析的示例性图形表示。

图5是根据本发明的实施例的由反应器握持架握持的管状反应器阵列以及反应器的底端被金属层涂覆的横截面图。

图6是被部分围护在反应器防护装置内的管状反应器阵列的横截面图。

图7是图6的一个反应器以及反应器保护装置和反应器握持架的俯视图。

图8a和8b是容纳在用于粉末浴槽介质的生物芯片内的反应器的透视图。

图9显示了根据一个实施例的具有特别适用于粉末浴槽介质的不透明管状反应器的照明和荧光发射检测模块的横截面图。

图10是示出根据一个实施例的具有粉末浴槽的照明和荧光发射检测模块的侧视图。

具体实施方式

下面的描述足够详细地呈现了本发明的几个优选实施例，使得本领域技术人员可以制造和使用本发明。

图1显示用于pcr或扩增核酸或核酸片段的其他酶促反应的热循环设备的一部分的实施方案的示意图。该装置具有两个含有铜粉作为浴槽介质75的浴槽50和51。浴槽50或51各自具有浴槽加热器17和沿浴槽表面安装的浴槽温度传感器39，以能够控制浴槽介质75的温度。根据另一个实施例，浴槽温度传感器39的位置可以是在浴槽50,51内部。浴槽50的温度被设置在适于变性工序的温度，而浴槽51的温度被设置在适于退火和/或延伸工序的温度。当浴槽51需要被主动冷却到室温以下时，冷却器16是有用的。铜粉浴槽介质75能比液体浴槽介质更快和更准确地升温和降温。在一些实施例中，如果浴槽51不必被加热，则低温浴槽51上的浴槽加热器17是可选的。为了进行热循环，反应器15多次在浴槽50,51之间交替转移。为了使反应器15能够快速地插入浴槽介质75中，细长反应器15是优选的，例如玻璃毛细管。反应器15用密封剂或盖77密封，而反应器15的一部分是透明的，以在反应器不处于铜粉浴槽介质75中时允许光通过以进行染料或探针激发和荧光成像。温度监测单元34被安装在反应器握持架33上，并与反应器15一起在浴槽50,51之间移动。温度监测单元34内部包含快速响应温度传感器38。温度监测单元34具有与反应器15相似的形状，并被构造成具有与反应器15相似或相同的稳态和瞬态热特性，以使温度读数和热响应与反应器15类似或相同，除非其它反应器15已被用于该目的。例如，温度监测单元34可以将快速响应温度传感器38插入水，或油，或一层覆盖在水上的油层22并密封。尽管仅示出了一个反应器15，但根据其他实施例，反应器握持架33可容纳多个反应器15。反应器15可以是如图所示的一个或多个管的形式，或者可以是多孔板、芯片或卡盒。反应器转移装置85将反应器15和温度监测单元34高速转移到浴槽50和51中，以按照热循环所需的方式交替地将它们暴露于浴槽50和51中的不同温度。反应器转移装置85有许多可能的设计。其中一个机械设计包括一个沿着x轴直线导轨移动的x台86以让反应器15和温度监测单元34抵达浴槽50和51上方，以及沿着z轴直线导轨移动的z台以让反应器15向下进入浴槽介质75或从浴槽介质75中抽离。这样的转移装置85也能包括旋转臂(未示出)，此旋转臂将反应器15和温度监测单元34沿角向移动以及z台88沿z轴直线导轨移动。反应器15具有用于从内部装载和回收反应材料21的开口，而开口是可密封的。密封剂77可以由硅橡胶或uv固化的聚合物、在热循环过程中处于固相的热熔和/或蜡和/或凝胶制成。也可以使用液体如油、粘性聚合物和凝胶来实现密封。高粘性液体可以被施用在反应器15的开口和/或顶部，它能够阻止从反应材料21产生的蒸汽泄漏出去。

在热循环的另一个实施方案(未示出)中，在浴槽50和51之间，具有监测单元34的反应器15可以插入含有处于中等目标温度的浴槽介质的第三浴槽中或置于热空气中一段时间，此时间为退火和/或延伸的所需时间。在此，热循环通过在每个热循环内将反应器15插入三个浴槽中以三步进行。

根据另一个实施方案(未示出)，第四浴槽被保持在预定温度tap，并且在热循环之前，具有温度监测单元34的反应器15被插入第四浴槽中，以允许设备进行由逆转录聚合酶链式反应(rt-pcr)和等温扩增反应所组成的组合中的至少一项附加处理。在用于核酸扩增的热循环之前，设备先进行rt-pcr。

为了使反应器15停留在浴槽50至54中直到达到相应的目标温度，装置中可以优选采用温度导向运动控制装置(tegmcm)(未示出)以更好地维持(一个或多个)反应器所能达到预定目标温度的准确度。当反应器15即将达到由温度监测单元34感测到的目标温度时，tegmcm可以被提供提前信号，以避免反应器15被过度加热或过度冷却。这种方法的热循环提供了更高的精度并且不需要用户校准，但由于需要非常快速的温度采样和信号处理电子器件，与反应器传送机构的快速数据通信以及非常敏感的机械运动部件，例如转移机械内的电机和致动器，所以设备的成本和复杂度都较高。或者，设备可使用根据反应器被允许处于浴槽中的时间长度而操作的时间导向运动控制装置(tigmcm)。使用者可校准tigmcm的时间长度。此实施例仅需低复杂程度的设备，因为它依时间长度操作，所以不需要高敏感度的设置，但需要使用者校准。

图2示出了具有转移装置的设备的等距视图，浴槽模块204、光学模块206、205、207和208。此图示出了浴模块204包括彼此相邻放置并且各自保持在预定温度的五个浴槽50、51、52、53、54。当反应器15位于具有空气或透明液体的低目标温度槽51中作为此实施例里的浴槽介质75时，光学模块206对反应器15内部的核酸进行荧光检测。温度控制器模块205控制浴槽温度。运动控制器模块207控制所有运动，而系统控制器模块208利用数据通信和处理、图像处理和数据分析来控制系统。逆转录-聚合酶链式反应(rt-pcr)、热启动处理和等温扩增反应等附加过程也可以在热循环之前在任何可被设定为所需温度的浴槽中进行，再在以上附加处理完成之后重新设置为热循环的所需温度。

图3示出了浴槽模块204和光学模块206的放大图。光学模块206包括了照明器44和荧光检测器43。入射光束46到达反应器15内的反应材料21。然后从反应材料21反射的光束47就被捕获。具有温度监测单元34的反应器阵列15在浴槽50至54之间转移。在此实施例中，浴槽51具有空气或透明液体作为浴槽介质75以及底部的透明窗口25以将照明光和发射光传递到反应器15和从反应器15传出。浴槽加热器17或冷却器16被连接到浴槽的侧壁。该设备可以进一步包括用于放置反应器15的热空气区(未示出)，特别是在成像期间。这简化了设备。该方法可以采用电加热器或红外加热器来形成浴槽上方或浴槽内的热空气区域。加热器可以与反应器握持架33一起安装，使得只有反应器15附近的空气被加热，同时反应器15在浴槽之间移动。此机制节省了能源，以及避免设备的其它部件受到不合期望的加热。

图4a和4b是典型的时间-温度图形代表2步和3步热循环处理(用于pcr、引物延伸之类)，然后进行熔解曲线分析。图4a只示出采用了两个浴槽的三个循环，此循环包含处于温度tht的变性过程和处于温度tlt的退火过程，而图4b示出的循环采用了三个浴槽以包含处于温度tmt，附加的延伸步骤。在热循环之后，反应器15被置于至少部分透明的浴槽介质中，此介质在进行熔解曲线分析的同时被逐渐加热。来自反应器15的荧光信号在处于多个不同温度时被采集，以形成用于熔解曲线分析的荧光-温度曲线。

图5是根据本发明的一个实施例的由反应器握持架33握持的管状反应器15阵列的横截面图，并且反应器15的底端由金属层5涂覆。当至少一个浴槽中的浴槽介质75是金属粉末时，为了提高反应器15对金属粉末的插入能力，反应器15在底端处设有金属层5，而且底端较尖，横截面积比其它反应器15小。

图6是部分地限制在可任选使用的反应器防护装置7内的管状反应器阵列15的横截面图。反应器防护装置7提供了物理支撑以防止塑料反应器15因阻力和tht而变形，或防止玻璃反应器在插入粉末浴槽介质75时因阻力而断裂。一般上，当反应器15插入粉末浴槽介质时，反应器底端所承受的这种力是处于最大值的。反应器护罩7可以由包含金属、玻璃、高温塑料或陶瓷的材料制成。图7示出了具有反应器防护装置7和反应器握持架33的一个反应器15的俯视图。如图所示，反应器护罩7仅覆盖反应器15的一小部分，因此不妨碍荧光成像。

图8(a)是生物芯片31，其仅由不具有通道315的井形式的反应器15组成。反应材料21从反应器15的开口被注入，并且由盖或密封流体30密封。然后，生物芯片31就被安装到反应器握持架33上。图8b是容纳在用于浴槽的生物芯片31中的反应器15的透视图。在此，多个反应器15被布置在生物芯片31中。当与粉末浴槽介质一起使用时，生物芯片31的边缘可与一种能在高tht时保持刚性的材料设置在一起。至少有一个入口313通过通道网络315与反应器15流体连通。待测试的反应材料21可以被装载入随后流入反应器15的入口315中。用于在粉末浴槽介质75内移动。

图9示出了一个实施例，其中反应器15由金属管制成，使之适用于以金属粉末为浴槽介质75。为达到荧光成像，光纤309将来自诸如led(未示出)的照明光源的光传输到反应器15内部的反应材料21中。光纤310的用途是将光从反应材料21传输到光检测器(未示出)。密封剂或盖77握持着光纤309,310。这有利于非透明反应器15的光学检测。

图10是个根据一实施例显示照明和荧光发射检测模块206与不透明粉末浴槽介质的侧视图。光学模块206由照明器44，荧光检测器43，光学滤波器81和分色镜82生成入射光束46，到达反应器15内的反应材料21，并在此后从反应物质21捕获反射光束47。成像机制从光学装置中显而易见。反应器15在浴槽介质75内时的反应器15的荧光成像是重要的，因为当多个不同波长的多个图像被用于多重检测或获取对照基因的荧光图像时，反应器15可能不得不在退火或延伸温度下保持延长的时间段。反应器盖32是透明的，以让成像的光通过。

根据需要，不同的浴槽可以盛有不同的浴槽介质75以获得特定的优点。反应器15可以由塑料，弹性体，玻璃，金属，陶瓷及其组合组成，其中塑料包括聚丙烯和聚碳酸酯。玻璃反应器15可以制成小直径的玻璃毛细管的形式，例如外径为0.1mm-3mm和内径为0.02mm-2mm，并且金属可以是薄膜形式的铝，薄的空腔和毛细管。反应器材料可以由具有化学或生物稳定性的非生物活性物质制成。反应器15的至少一部分优选为透明的。在另一个实施例中，反应器15可以是反应器阵列芯片或微流体反应器芯片或阵列芯片的形式。例如，反应器15可以处于基板的孔或通道的形式，并且可选地被固体材料层覆盖以形成反应流体或反应系统位于其中的封闭反应室。反应器握持架33中的所有反应器15中的反应材料21可以不相同。如果浴温适合，人们可以针对不同材料21有利地进行同步pcr。反应器壁的至少一部分可以由厚度为1μm-2mm的金属片制成。该特征提高了浴槽和反应材料21之间的传热速率。反应器壁的至少一部分可以由厚度为0.5μm-500μm的塑料或玻璃片制成。反应器壁的至少一部分由透明材料制成以实现成像和检测处理。当使用上述用于核酸分析和处理的设备时，反应材料21包含反应组分，所述反应组分包含至少一种酶，含有至少一种核酸的核酸和/或颗粒，用于pcr的引物，用于等温扩增的引物，其它核酸扩增和加工的引物，dntp，mg²⁺，荧光染料和探针，对照dna，对照rna，对照细胞，对照微生物以及核酸扩增，加工和分析所需的其他试剂。上述含核酸颗粒包含至少一种细胞病毒，白细胞和基质细胞，循环肿瘤细胞，胚细胞。一种应用可能是使用该装置针对相同的一组引物和探针测试不同种类的反应材料21，例如测试多于一个样品。为了这种应用，不含目标引物和/或探针的各类的反应材料21各自被装载到反应器阵列中的一个反应器15中，所有反应器15都预先装有相同的一套或相同组的pcr引物和/或探针。对于相同的应用，与各自的pcr目标引物和/或探针预混合的不同种类的反应材料21被各自装载到反应器阵列中的一个反应器15中，所有反应器15不被预先加载相同的一组pcr引物和或探针。反应材料21可以包括对照基因和/或细胞和相应的荧光染料或探针。在上述情况下，不同的探针发出不同波长的光。此法与此设备的另一项应用为针对不同组的引物和探针测试相同的反应材料21。这种应用的一个例子是为了多个目的测试一种类型的样品。对于此应用，单一反应材料21被加入各个装载有至少一种不同组pcr引物和/或探针的反应器15中。反应材料21可以包括对照基因和/或细胞和相应的荧光染料或探针。在上述情况下，不同的探针发出不同波长的光。上述反应物质21用于聚合酶链式反应、逆转录pcr、终点pcr、连接酶链式反应、核酸测序的预扩增或模板富集或聚合酶链式反应(pcr)的变异、等温扩增、线性扩增、用于测序的文库制备、用于测序的桥扩增。上述聚合酶链反应的变化包括反转录pcr、实时荧光定量聚合酶链式扩增反应和实时荧光定量逆转录聚合酶链式扩增反应、反向聚合酶链式扩增反应、锚定聚合酶链式扩增反应、不对称聚合酶链式扩增反应、多重pcr、色彩互补聚合酶链式扩增反应、免疫聚合酶链式扩增反应、巢式聚合酶链式扩增反应、预扩增或核酸测序的模板富集、elisa-pcr。

从前面的描述中，本领域技术人员将会理解，在不脱离如权利要求书中限定的本发明的情况下，可以对设计，构造和操作的细节进行许多变化或修改。