选择性功能化的纳米流体生物传感器中的生物分子的快速定量及其方法
【专利摘要】本发明要求保护用于快速定量纳米通道(210)中存在的生物分子(320)的方法和设备。具体地，本发明涉及纳米通道中的液体驱动和选择性功能化表面的新构思，其形成短暂固定化的生物分子(340)跨所述纳米通道的浓度梯度。此构思使得对目的生物分子相互作用(320)的定量成为可能。
【专利说明】选择性功能化的纳米流体生物传感器中的生物分子的快速定量及其方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及使用光学系统检测选择性功能化的纳米流体生物传感器中的荧光标记的生物分子的方法和设备。本发明可以有利地用于生物医学样品和生物样品的快速定量。
【背景技术】
[0002]纳米流体生物传感器被定义为具有纳米尺寸限制件(confinement)和/或侧孔的流体系统，其用于定量溶液中生物分子的存在。目前对纳米流体生物传感器的开发大多数意图用于生物工程和生物技术应用。在本发明的范围内，生物传感器用于定量溶液中生物分子的存在，以用于体外诊断应用。
[0003]瑞士专利申请CH 01824/09公开了具有侧孔的生物传感器，其用于检测生物分子相互作用，PCT申请IB2010/050867公开了其与简单光学系统的应用。生物分子在这些构造中的扩散是缓慢的，需要长的等待时间以获得稳定的测量条件，或需要高度浓缩的溶液用于观察生物分子相互作用。
[0004]生物标志物，也称为生物学标志物，是用作用于检测生物分子的存在的特异性指标的物质。其特征在于作为生物学过程、发病过程或对治疗性干预的药理学反应的指标被客观测量和评估。
[0005]目前对特异性生物分子的检测的实践可以分为两类:(a)标记技术和(b)无标记技术。
[0006]在标记技术中，广泛使用的是荧光、比色法、放射性、磷光、生物发光和化学发光。功能化磁珠也可以被认为是标记技术。标记技术的优点是比无标记法灵敏以及归因于特异性标记的分子识别。
[0007]在无标记技术中，广泛使用的是电化学生物传感器，涉及电流型传感器、电容型传感器、电导型传感器或阻抗型传感器，其优点是快速和廉价。当生物分子陷入或固定化在电极上或附近时，它们测量电极结构的电性能的改变，但所有这些构思缺乏分子特异性对比度、灵敏度和可靠度。
[0008]酶联免疫吸附测定(ELISA)是一种重要的生物化学技术，其主要用来检测血清中可溶性生物分子的存在，因此被广泛用作医学中的诊断工具和多个行业中的质量控制检验。然而ELISA分析是昂贵的，要求大量的溶液并且是耗时的。
[0009]用于生物分子诊断学的其他重要技术是Western和Northern印迹、蛋白电泳和聚合酶链式反应(PCR)。然而，这些方法要求高度浓缩的分析物并且不允许高通量样品测试。
[0010]目的
[0011]本发明的一个目的是提供廉价的和快速的纳米流体生物传感器，其不要求复杂的操作。
[0012]本发明的另一目的是使用纳米流体从几何学上限制光学测量空间，并且选择性地功能化纳米通道表面，以获得生物传感器的高灵敏度。
[0013]本发明的又另一目的是通过迫使形成贯穿纳米尺寸限制件(纳米通道)的对流，以增加生物分子与固定化的生物标志物相互作用的概率，从而增加检测的灵敏度。
[0014]参照下面的附图以及优选实施方案，本发明的这些和其他目的将变得越来越明显。
【发明内容】
[0015]本发明基于下面的发现:迫使生物分子进入具有选择性功能化表面的纳米尺寸限制件，会强烈地增加生物分子与固定化的生物标志物相互作用的概率。这允许对超低浓度的荧光标记的生物分子的存在进行定量。
[0016]本发明还基于下面的发现:监控与生物分子连接的荧光团的光漂白可以用来区分已经与生物标志物相互作用并且被固定化在纳米通道中的生物分子与只是扩散通过检测空间的那些生物分子。
[0017]此外，本发明强调使用驱动组件来迫使待分析的溶液通过纳米通道对流的概率。
[0018]在本文中，术语“驱动组件”必须要被理解为能够用于促进溶液流动通过纳米通道的任何元件，例如，吸收元件。
[0019]在本发明的范围内，使用纳米流体，因为其具有高的表面体积比，这意味着包含在检测空间中的表面使得生物分子与表面上固定化的生物标志物之间的相互作用的概率最大化。由于位于检测空间内的小部分基底，其也强烈地减少了溶液的背景信号。
[0020]本发明因此涉及如权利要求中所限定的生物传感器。
[0021]本发明还涉及使用所述生物传感器的组合件和方法。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1a是含有纳米流体生物传感器200的阵列的密封容器系统101的立体图。含有荧光标记的生物分子的溶液300通过移液管系统400被放置在密封容器101内。基于激光束510的光学系统500用于测量。
[0023]图1b是含有纳米流体生物传感器200的阵列的表面102的立体图。含有荧光标记的生物分子的溶液300通过移液管系统400被放置在表面102上。基于激光束510的光学系统500用于测量。
[0024]图2a显示由两个基底201和202所限定的纳米流体生物传感器的横截面，这两个基底的局部结构由区域211和另一区域203构成，区域211被生物标志物310功能化，区域203阻止该功能化。含有生物分子的试剂溶液300进入纳米通道210并且由外部驱动组件241驱动。激光束510监测检测空间520中的固定化的生物分子340的光漂白。
[0025]图2b显示由两个基底201和202所限定的纳米流体生物传感器的横截面。仅一个基底的局部结构由区域211和另一区域203构成，区域211被生物标志物310功能化，区域203阻止该功能化。含有生物分子的试剂溶液300进入纳米通道210并且由内部驱动组件242驱动。激光束510监测检测空间520中的固定化的生物分子340的光漂白。
[0026]图3图示在纳米通道长度上特异性生物分子的浓度随时间的变化。
[0027]图4显示在纳米通道长度上特异性生物分子在给定时间L的浓度分布曲线。标记的区域代表特异性生物分子的检测部分。
[0028]图5图示在纳米通道长度上非特异性生物分子(背景)的浓度随时间的变化。
[0029]图6显示在纳米通道长度上非特异性生物分子在给定时间h的浓度分布曲线。标记的区域代表特异性生物分子的检测部分，对应于背景噪声。
[0030]图7图示与固定化的特异性生物分子连接的荧光团的标准光漂白曲线。
[0031]图8图示纳米通道内部非特异性生物分子随时间变化的荧光强度曲线，显示仅检测到背景噪声。
[0032]图9显示纳米通道内随时间变化的溶液流速。
【具体实施方式】
[0033]当在本文中使用时，术语“生物分子”意指是通称，其包括例如(但不限于)蛋白诸如抗体或细胞因子、肽、核酸、脂质分子、多糖和病毒。
[0034]当在本文中使用时，术语“纳米通道”意指是通称，其意思是具有至少一个纳米尺寸维度的清楚界定的微制结构。纳米通道的纳米尺寸维度被限定为大于2nm，因为待检测的最小生物分子的尺寸必须进入狭缝并处于相同数量级。本发明限于高度小于I微米的纳米通道，因为光学系统的检测空间的范围通常处于相同数量级。
[0035]本发明旨在通过归因于对功能化表面的限制而增加与特异性生物标志物的相互作用的概率来增强对生物分子的检测。如在图1a和图1b中所示，纳米流体生物传感器200的阵列被固定化在密封容器系统101中或表面102上。含有荧光标记的目的生物分子的混合溶液300通过移液管系统400被放置在密封容器101内或表面102上。密封容器101可以被气密性密封以避免污染。最后，将光学装置500用来通过将激光束510聚焦在生物传感器纳米通道内部来测量生物传感器200内部的生物分子相互作用。
[0036]图2a和图2b图示出本发明生物传感器的检测原理和横截面。该系统包含将输入侧口 220与输出侧口 230连接在一起的纳米通道210。可以是外部的(241)或内部的(242)驱动组件位于输出侧口 230附近。首先，生物标志物310被固定化在基底201和202的一个或两个的选择性功能化的纳米通道表面上。其他纳米通道表面和侧口表面可以通过放置非功能化层203而被保护。检测空间520必须集中在纳米通道210内，诸如由纳米通道210的空间所限定的相交空间，并且检测空间520是最大的，并且紧靠输入侧口 220。下一步，将含有荧光标记的特异性生物分子320和非特异性生物分子330的溶液300通过毛细管作用从输入侧口 220填充至系统中。当到达驱动组件241或242时，溶液300通过例如吸收填充驱动组件，导致形成贯穿生物传感器的强制对流。当驱动组件241或242达到其最大填充容量时，对流停止并且系统达到平衡。在对流期间，由于布朗运动，生物分子320与固定化在纳米通道210内部的生物标志物310相互作用，并且可以形成分子复合物340。获得了跨纳米通道210的浓度梯度。非特异性生物分子330将在纳米通道210中扩散，但不与固定化的生物标志物310形成分子复合物。非特异性生物分子331将出现在输出侧口 230中，一些332也可以出现在驱动组件241或242内部。当由激光束510激发时，固定化的荧光发射复合物340和扩散通过光学检测空间的扩散的荧光发射生物分子330均被光学系统检测到。
[0037]本发明区别于目前用来检测分子相互作用的技术。本发明的独特方法测量跨选择性功能化的纳米通道的固定化的复合物的浓度，所述纳米通道与侧口连接，该独特方法不同于基于测量单个表面或储器上的相互作用的当前技术。这些当前技术的解决方案并未受益于出现在本专利中给出的独特设计中的增加的相互作用事件概率。
[0038]图3显示了当溶液含有特异性生物分子时，跨生物传感器的浓度随时间的变化。在毛细管填充后立即(时间h)，在输入侧口内部存在荧光标记分子的背景浓度C(l。进入纳米通道的特异性生物分子与纳米通道功能化表面迅速相互作用，导致浓度增加(短划线)。最大浓度Csat对应于下面的情况，对于给定的X位置，所有生物标志物均已经与特异性生物分子发生了相互作用。随着时间的变化，浓度梯度将趋向于tinf点线，对应于纳米通道生物标志物的总饱和度(点线)。
[0039]图4图示了在时间h时跨生物传感器的浓度梯度，对应于当溶液已经充满了生物传感器以及吸收组件时的情况。由于布朗运动，生物分子继续进入纳米通道并且继续与生物标志物相互作用，但取决于背景浓度Ctl,向饱和tinf的过渡可能非常长。这允许对跨纳米通道的浓度分布曲线的稳定测量。测量空间(画有阴影线的区域)对应于宽度为b的激光束与纳米通道的相交区域。
[0040]图5显示当溶液仅含有非特异性生物分子时，跨生物传感器的浓度随时间的变化。在毛细管填充后(时间&)，在输入侧口和纳米通道内部立即存在荧光标记分子的背景浓度(V预期没有进一步的浓度增加，因为不存在与功能化表面的相互作用。在此情况下，对于所有X位置并且随时间的变化，浓度Ctl均保持恒定。
[0041]图6图示在时间h时跨生物传感器的浓度梯度，对应于当溶液不含特异性生物分子并且已经充满了生物传感器以及吸收组件时的情况。测量空间(画有阴影线的区域)对应于宽度为b的激光束与纳米通道的相交区域。
[0042]图7显示了对于纳米通道内的给定位置，当溶液含有特异性生物分子时，在测量期间荧光强度随时间的变化。当光学系统的快门打开时测量开始。获得了含有关于存在于测量空间内的固定化和荧光标记的分子的数目的定量信息的标准光漂白曲线。
[0043]图8显示了对于纳米通道内的给定位置，当溶液不含有任何特异性生物分子时，在测量期间荧光强度随时间的变化。当光学系统的快门打开时测量开始。没有获得光漂白曲线，因为在测量空间内仅存在扩散的荧光标记的生物分子，导致恒定的背景信号。
[0044]图9显示纳米通道内溶液对流随时间的变化。首先，在时间tMp期间通过毛细管作用填充纳米通道，导致流速的增加。当到达吸收组件时，溶液完全填充纳米通道，并且流动不再由毛细管作用驱动而是由吸收驱动。这导致在时间tac;t期间流速的改变。最后，在纳米通道内的溶液流动趋于0，并且生物分子仅由于布朗运动而移动。测量时间tm应当出现在对流停止后。
[0045]根据本发明，所述装置对与其他固定化的生物分子相互作用或不相互作用的生物分子的检测、计数、鉴定和表征提供了极大的改进。本发明的应用可以涵盖生物医药分析、生物学分析或食品分析，以及分析化学和生物分析化学中的基础研究。
【权利要求】
1.一种用于检测和定量荧光标记的生物分子(320)的生物传感器(200)，所述生物传感器(200)包含纳米通道(210)，所述纳米通道在两个基底(201，202)之间限定并且含有一个或数个选择性功能化的区域(211)，所述选择性功能化的区域(211)上有固定化的生物标志物(310)，所述纳米通道还由输入侧口(220)和输出侧口(230)限定，所述输入侧口(220)适于使含有生物分子(320)的溶液进入所述纳米通道(210)中，并且所述输出侧口(230)适于通过毛细管作用驱动所述溶液通过所述纳米通道(210)。
2.根据权利要求1所述的生物传感器(200)，其中所述生物标志物(310)适于与特异性生物分子(320)以生物学或化学方式相互作用，和/或不与所述溶液(300)中包含的非特异性生物分子(330)相互作用。
3.根据权利要求1或2所述的生物传感器(200)，其中所述基底(201，202)由选自由硅、玻璃、塑料和氧化物化合物构成的组中的材料制成。
4.根据前述权利要求中任一项所述的生物传感器(200)，其中所述输出侧口(230)容纳驱动组件(241或242)或与驱动组件(241或242)接触，所述驱动组件(241或242)适于驱动所述溶液通过所述纳米通道(210)。
5.根据前述权利要求中任一项所述的生物传感器(200)，其中所述纳米通道(210)和所述侧口(220，230)内的非功能化表面含有厚度为1nm至1000nm的薄层材料，所述材料选自由金属、塑料和氧化物化合物构成的组。
6.根据前述权利要求中任一项所述的生物传感器(200)，其中所述侧口(220，230)的面积为1OOnm2至20mm2,且所述纳米通道(210)的高度为2nm至1000nm,宽度为2nm至20mm,且长度为2nm至20nm。
7.—种阵列，其包括数个如前述权利要求中任一项所述的生物传感器(200)，所述生物传感器(200)被固定在密封容器系统(101)内或被固定在表面(102)上。
8.一种组合件，由一个或数个前述权利要求中任一项所述的生物传感器(200)组成，并且包含用于荧光激发和检测的光学装置(500)。
9.根据权利要求8所述的组合件，其中所述光学装置(500)是包含检测器的荧光测量部件，所述检测器是单光子检测器，诸如检测器阵列(CMOS或CCD)、雪崩光电二极管(APD)或光电倍增管(PMT)。
10.一种用于检测和定量溶液(300)中荧光标记的生物分子(320)的存在的方法，包括: a.至少一个如权利要求1至6中任一项所述的生物传感器(200)； b.从输入侧口(220)至输出侧口(230)、贯穿纳米通道(210)的所述生物传感器(200)的填充机构，通过放置含有荧光标记的生物分子(320和或330)的水溶液(300)，所述荧光标记的生物分子(320和或330)可以对固定化在所述纳米通道中并且未固定化在密封容器系统(101)中或表面(102)上的生物标志物(310)特异； c.光学系统(500)； d.借助于与所述生物分子(320)连接的荧光团的光漂白对固定化在所述纳米通道(210)内部的生物标志物(310)上的特异性生物分子(320)的检测，以及跨所述纳米通道(210)的长度的浓度梯度的测定。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述生物分子(320)是蛋白质、DNA、RNA、抗体、氨基酸、核酸、酶、脂质分子 、肽、多糖或病毒。
【文档编号】B82Y15/00GK103502795SQ201280012408
【公开日】2014年1月8日 申请日期:2012年2月6日 优先权日:2011年3月9日
【发明者】N·杜兰德, I·梅尔基, S·布罗伊莱特, A·梅尔, T·拉瑟 申请人:阿比奥尼克公司