聚合物壳纳米微胶囊的制作方法

聚合物壳纳米微胶囊的制作方法
【专利摘要】本发明指的是一个管理活性成分的系统，其活性成分包含油，阳离子表面活性剂及所选择的聚合物，包括聚谷氨酸(PGA)，聚乙二醇-聚谷氨酸(PGA-PEG)，透明质酸(HA)和聚天冬酰胺(PAsn)或它们的组合，以及任选的活性成分，其条件是当所述聚合物包含聚谷氨酸，聚乙二醇-聚谷氨酸时，活性成分不是一种膜海鞘素(Didemnina)或海洋缩酚酞(Tamandarina)。聚谷氨酸的本发明还涉及获得纳米胶囊系统，其药物成分和它们在医学上的运用的方法。
【专利说明】聚合物壳纳米微胶囊
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种含有纳米级纳米胶囊活性成分的施用系统，以及有相同药物和相同制备方法的药物组合物。
【背景技术】
[0002]在纳米级的系统中掺入活性成分，帮助解决了这些分子制剂的限制，进一步增加了它们的治疗潜力。溶解度的改进、降解防范或活性成分更大的渗透，是活性分子的纳米胶囊所提供的一些优势。同时，这些系统跨越外部障碍和访问有机体内部的能力也众所周知，既取决于它们的大小也取决于它们的组合物。相对于较大的颗粒，小颗粒会增加给药的速率:纳米系统，直径小于I微米，以此为标准。
[0003]聚谷氨酸(PGA)
[0004]聚谷氨酸(PGA)是一种可生物降解的聚合物，由带负电荷的谷氨酸组构成。由于它具有无毒性、非免疫原性和生物相容性等生物属性，该聚合物在新的释放药物配方的开发中，已被视作一个重要的生物材料(Buescher&Margaritis, Crit RevBiotech2007)。
[0005]聚谷氨酸的使用被广泛报道，例如，在癌症的治疗中，用于形成药物-聚合物复合物，在其形成过程中寻找一些中晚期的配方。抗癌药物聚谷氨酸紫杉醇ΧΥ0ΤΑΧ，是一种由聚-L-谷氨酸和抑制细胞生长的紫杉醇剂组成的药物配方，目前用在第3阶段的临床试验中。
[0006]该聚合物也已被用在其他抗肿瘤药物的配方设计中，如阿霉素(Shih etal.，2004)。
[0007]此外，在US2006246096专利的申请文件中也曾报道过，用来形成药物释放系统的聚谷氨酸被用来作为遗传物质的制剂护壳。
[0008]另一种由聚谷氨酸开发的释放系统是纳米粒子，如在US2005238678和US6326511专利文件中所述。
[0009]另一方面，聚谷氨酸与聚乙二醇(PEG)形成共轭，目的是实现纳米系统的表面改性，为胶体系统提供更高的稳定性。这种与PEG的改性也最大限度地减少了蛋白质和网状内皮系统的细胞对纳米系统的认可，从而增加了其循环时间。
[0010]聚谷氨酸和PEG联合的效果已经在US2003170201专利的申请中做了研究，评估由该聚合物形成的释放抑制细胞生长药物的复合物的潜力。
[0011]透明质酸(HA)
[0012]透明质酸(HA)是一种天然存在的聚合物。更具体的说，它是一种葡萄糖胺聚糖，存在于结缔组织的细胞外基质，如皮下组织和软骨组织，也存在于眼玻璃体和关节腔的滑膜液中。这是一个能够与内源性受体CD44和RHAMM相互作用的聚合物，位于几乎所有生物体细胞的细胞表面，除了红细胞。透明质酸与这些受体的相互作用，可以调节某些生理过程，如细胞流动性和细胞的增殖。由于这些特性，透明质酸具有治疗用途，它在形态发生和胚胎发育、癌症和炎症过程中起着重要的作用。此外，由于所述性能，透明质酸可用来促进上皮愈合。
[0013]要证明这种生物的活性，在很多的研究中都做了描述，其中包括作为活性生物分子的透明质酸，例如Sand et al.(Acta Ophthalmol.67，1989，181-183)所描述的,透明质酸应用在干燥性角结膜炎的治疗中，Nishida et al.(Exp.Eye Res.53，1991，753-758)描述的作为一个角膜的愈合标准，Blanco et al.(Clin.Exp.Rheumatol.22 (3) 2004, 307-12)描述的，将聚合物用于骨关节炎的治疗，等等。此外，透明质酸及其衍生物，根据不同形式的演示，作为一种活性分子成为无数专利文献的研究主题。在这一点上应该指出的是，在W096/06622专利的申请中，声称使用的透明质酸和衍生物，单独或与另一种治疗剂组合，用来调节这些组织和细胞群的细胞活性，在其表面上表现出透明质酸的受体，以此来治疗或防止炎症、纤维化和发生癌变。US6383478专利保护一种由微粒、纳米粒子或薄膜构成的传送系统，其中加入透明质酸，作为活性分子尽可能促进血管的生成。
[0014]此外，透明质酸也一直被用于众多的研究中，在该研究中建议用作生物材料-赋形剂，用于药物输送系统的发展。在这条线上，它是一种可生物降解的、生物相容性的聚合物，不具备免疫原性、粘膜粘附性和选择性亲和力，如CD44受体。至于选择使用透明质酸作为生物材料的赋形剂来获得纳米制剂，可以提及的原因包括以下内容:
[0015]-在US2007/0224277专利的申请中，描述了由共价交联形成的透明质酸纳米颗粒的制备。
[0016]-在US2003/0166602A1专利的申请中，公开了使用透明质酸修饰的脂质的各种剂型的制备，并且可容纳能抗癌的活性成分以及其它治疗剂或诊断剂。
[0017]-在W02004/112758A1专利的申请中，描述了在含有透明质酸的纳米颗粒的水性介质中的制备，通过透明质酸离子间的相互作用、其他互补负荷的聚合物以及离子交联剂的存在而形成。
[0018]-Luo 和 Prestwich (Bioconjugate Chem.10,1999, 755-763)综合透明质酸和紫杉醇抗癌生物剂之间的结合物，其细胞`毒活性更高，在CD44过量的乳腺癌、肠癌和卵巢癌细胞系中比只用紫杉酚更具选择性。
[0019]-Yenice et al (Experimental Eye Research2008, 87 (3) , 162-7)和Barbault-foucher et al (Journal of Controlled Release2002,83, 365-375)描述了透明质酸涂层的的聚-ε -乙内酯纳米球，作为眼部给药系统。
[0020]聚天冬酰胺(PAsn)
[0021]在文献中描述的L-天冬酰胺是所有类型细胞的增长和发展所必需的一种氨基酸，直接参与蛋白质和DNA的合成，该氨基酸的主要来源是在饮食中。
[0022]L-天冬酰胺是目前在癌症的治疗中使用最多和效果最佳的策略之一，在市场上销售的制剂包括所需要的降解酶。在实施这种酶并将其沉积于肿瘤的周边时，如果降低氨基酸的浓度，导致氨基酸的缺失，细胞会阻止DNA和其他生存所必需的蛋白质的合成。这些制剂被称为Onc—at.?或F.lspm.' L-天冬酰胺则负责对这些酶降解。
[0023]癌细胞在转移的晚期，尤其是对于白血病，对天冬酰胺有很高的认可性，因为其可以快速繁殖。癌细胞是无法有效地满足这种氨基酸的基本需求，这在许多情况下，导致这些细胞从氨基酸浓度较高的地方向肿瘤周边转移。
[0024]上述认可性和必要性，最近已被用来作为治疗许多转移阶段的癌症的一种替代品。我们已经对纳米系统做了大量的研究，如聚合物胶束或天冬酰胺的聚合衍生物涂层的脂质体。
[0025]上述研究在基于聚氨基酸分子的纳米系统的发展中已经显示出巨大的潜力，而聚氨基酸分子是在天冬酰胺的基础上，如聚天冬酰胺(PAsn)或聚羟乙基天冬酰胺。另外，加上天冬酰胺的表面识别所赋予的特异性，基于该氨基酸的聚合物表现出与PEG类似的亲水性的特性和结构及物理化学特性，对正在进行中的药物半衰期做上述系统改善，以及在药代动力学和生物分布方面有显著的效果。
[0026]在与聚天冬酰胺相关的研究中，Storm和合作伙伴(Metselaar, Bruin etal.2003;Garcion, Lamprecht et al.2006;Romberg, Kettenes-Van Den Bosch etal.2006;Romberg, Metselaar et al.2007;Romberg, Oussoren et al.2007;Romberg,Oussoren et al.2007;Romberg, Oussoren et al.2007;Romberg, Flesch etal.2008;Romberg, Hennink et al.2008)评估了在脂质体上两种不同类型涂层的药代动力学，改变聚合物涂层；将PEG与聚羟乙基天冬酰胺进行比较，结果倾向于聚羟乙基天冬酰胺，因为后者呈现出更好的药代动力学和低剂量下更长的循环时间，并能够重复给药。
[0027]根据上述资料，化合物的潜力是显而易见的，并能激起上述化合物-聚谷氨酸和聚乙二醇共聚物的兴趣，透明质酸和聚天冬酰胺一在新的给药系统的开发中作为生物材料-赋形剂。特别是，对于某些稳定的纳米系统的应用，它将适合用来封装和保护各种特性的分子，在所需的生物表面也呈现良好的吸附性和内化性。

【发明内容】

[0028]本发明的
【发明者】通过不同的实验程序，开发出了一种更容易获取的纳米囊系统，其中，所述的纳米胶囊包括聚合物、油和阳离子性表面活性剂。该纳米囊系统能够有效的融合脂溶性活性成分和亲水性成分。这些纳米胶囊的小体积(直径小于I微米)使其能够通过生物屏障，并由细胞内化。同时，聚合物壳的存在，除了赋予纳米胶囊更大的稳定性以外，根据每个特定壳的类型，能够提·供各种有益的功能。
[0029]因此，一方面来说，本发明涉及一种包含纳米胶囊的活性成分的施用系统，包括油、阳离子表面活性剂、以及从由聚谷氨酸(PGA)、聚谷氨酸-聚乙二醇(PGA-PEG)、透明质酸(HA)和聚天冬酰胺(PAsn)组成的群组中选取一种聚合物，任选一种表面活性剂溶于水中。
[0030]条件是，当这样的纳米胶囊系统中包括聚谷氨酸或聚谷氨酸-聚乙二醇(PGA-PEG)时,所述活性成分则不是膜海鞘素(Didemnina)或海洋缩酹酞(Tamandarina)。
[0031]此外，纳米胶囊的发明，也可选用其它组分，如一种水溶性表面活性剂、一种油溶性表面活性剂，或两者兼而有之。
[0032]另一方面，本发明涉及一个药物组合物，该组合物包括上述所定义的系统。
[0033]同时，本发明还涉及到在药物的制备过程中所述系统的使用。在一个特定的实施例中，所述用途涉及癌症的治疗。
[0034]进一步说，本发明涉及了一个用于获得上述定义系统的程序(以下在实施例中简称一个阶段的溶剂扩散过程)，包括:
[0035]a)制备一份水溶液，包括从聚谷氨酸(PGA)、聚谷氨酸-聚乙二醇(PGA-PEG)、透明质酸(HA)和聚天冬酰胺(PAsn)组成的群组中选取一种聚合物，任选一种表面活性剂溶于水中；
[0036]b)制备一份有机溶液，包括油和阳离子性表面活性剂，任选一种额外的表面活性剂溶于油中；
[0037]c)将a)和b)步骤中制备的溶液搅拌混合，将自发获得纳米胶囊；
[0038]d)将前一步骤的混合有机溶剂全部或者部分进行蒸发，直到得到恒定的体积。
[0039]根据特定的实施方式，脂溶性活性成分(疏水性活性成分)或两亲性活性成分，通过将其添加到步骤b)中进行封装。亲水性质的活性成分可以添加到步骤a)中或在步骤d)之后通过一个孵化过程完成封装。
[0040]从另一方面来说，本发明涉及了一个用于获得上述定义系统的程序，其中就包括一种纳米乳液涂层，这种涂层至少由一种油、一种阳离子表面活性剂、并任选一种表面活性剂溶于油中、以及含有一种任选的水溶性表面活性剂的水相、从聚谷氨酸(PGA)、聚谷氨酸-聚乙二醇(PGA-PEG)、透明质酸(HA)和聚天冬酰胺(PAsn)组成的群组中选取一种聚合物或几种的组合物。
[0041]在特定的实施例中，上述过程还包括添加一种活性成分。如上述定义，如果该聚合物是聚谷氨酸或聚谷氨酸-聚乙二醇(PGA-PEG)时，所述活性成分则不是膜海鞘素(Didemnina)或海洋缩酌酚酞(Tamandarina)。
[0042]根据一个更具体的实例，如果活性成分具有亲脂性，所述活性成分将加入到纳米乳形成的过程中，最好是溶解于乙醇中。
【专利附图】

【附图说明】
[0043]图1:聚谷氨酸(1.a)和聚谷氨酸-聚乙二醇(l.b)纳米胶囊在37°C，48小时内粒径的演进和多分散性。
[0044]图2:经过各种浓度(0.025-1 % w/v的海藻糖冷冻保护剂(5%和10% w/v)冷冻干燥后，聚谷氨酸-聚乙二醇(2.a)和聚谷氨酸(2.b)纳米胶囊的粒径。
[0045]图3:苯扎氯铵阳离子表面活性剂制备的透明质酸纳米胶囊的TEM图像。
[0046]图4:从苯扎氯铵阳离子表面活性剂(BKC)和十六烷基三甲基溴化铵的阳离子表面活性剂(CTAB)制备的透明质酸纳米胶囊中获取的多西他赛(DCX)的释放曲线。
[0047]图5:苯扎氯铵阳离子表面活性剂(5.a)和十六烷基三甲基溴化铵的阳离子表面活性剂(5.b)制备的透明质酸纳米胶囊的粒径演进。
[0048]图6:经过各种浓度(0.025-1 % w/v)的海藻糖冷冻保护剂(5%和10% w/v)冷冻干燥后，苯扎氯铵阳离子表面活性剂制备的透明质酸纳米胶囊的粒径。
[0049]图7:经过与白色透明质酸纳米胶囊(NCs HA) 2个小时(7.a)和48个小时(7.b)的接触，NC1-H460癌症细胞系的成活能力。将多西他赛(DCX)融入溶液中，制备成含有多西他赛的透明质酸的纳米胶囊，形成各种抗肿瘤的浓度。在纳米囊的制备过程中使用的阳离子表面活性剂是十六烷基三甲基溴化铵。
[0050]图8:苯扎氯铵阳离子表面活性剂(8.a)或十六烷基三甲溴化铵的阳离子表面活性剂(8.b)制备的聚天冬酰胺纳米胶囊的TEM图像。
[0051]图9:从十六烷基三甲基溴化铵的阳离子表面活性剂制备的聚天冬酰胺纳米胶囊中获取的多西他赛(DCX)的释放曲线。
[0052]图10:十六烷基三甲基溴化铵阳离子表面活性剂制备的聚天冬酰胺纳米胶囊，在40C (10.a)和37°C (10.b)的储存过程中，粒径和zeta电位的演进，以及苯扎氯铵阳离子表面活性剂制备的聚天冬酰胺纳米胶囊，在4°C (10.c)和37°C (10.d)的储存过程中，粒径和zeta电位的演进。
[0053]图11:经过与白色聚天冬酰胺纳米胶囊(NCs PAsn)2个小时(ll.a)和48个小时(11.b)的接触，NC1-H460癌症细胞系的成活能力。将多西他赛(DCX)融入溶液中，制备成含有多西他赛的聚天冬酰胺纳米胶囊，形成各种抗肿瘤浓度。在纳米囊的制备过程中使用的阳离子表面活性剂是十六烷基三甲基溴化铵。
[0054]图12:100纳米的聚谷氨酸-聚乙二醇纳米胶囊给药后，在不同时间段内:(a)6小时，(b)24小时，(c)48小时，以fotones/seg/cm2/sr为单位的不同器官和组织的突光强度
(ES皮下注射，_静脉注射)。
[0055]图13:200纳米的聚谷氨酸-聚乙二醇纳米胶囊给药后，在不同时间段内:(a)6小时，(b)24小时，(c)48小时，以fotones/seg/cm2/sr为单位的不同器官和组织的突光强度(皮下注射，_静脉注射)。
[0056]图14:通过对瑞士白鼠进行静脉注射给药后，与PAsn( ▲ )，PGA ( ?)和PGA-PEG( )纳米囊相关的等离子荧光裂解动力学。注射剂量百分比(与零时间的浓度相关的每个时间点的动物总重量毫克/公斤的DID浓度)以时间函数表示。纳米溶液(籲)作为对照点。每个点代表一个组中注射剂量的平均百分比，公式为n=3土D.E。
[0057]图15: (a)在 PAsn (A), PGA-PEG (B),泰索帝 ? (- -X--)和生理盐水(X)制备的
纳米胶囊对小白鼠给药后，随着时间的推移肿瘤的大小(U87MG皮下肿瘤神经胶质瘤)；(b)相对于初始体积，在注射各种制剂18和21天后小白鼠身上肿瘤。
[0058]体积的增加。使用泰索帝翁和生理盐水的制剂进行控制。统计分析表明，与单纯的控制相比，使用纳米胶囊的制剂和泰索帝?治疗后，18天和21天后动物身上的肿瘤大小有明显差异(*P〈0.05**P〈0.01—F test AN0VA)。
[0059]图16:与泰索帝_给药和生理盐水控制相比较，施用添加多西紫杉醇的不同制剂的纳米胶囊(PAsn(.)，PGA-PEG ( )，泰索帝⑩(?)和生理盐水(+))后，动物的Kaplan-Meier生存曲线图。
【具体实施方式】
[0060]本发明是针对添加活性成分的纳米胶囊给药而进行设计和开发的，其中，所述系统中的纳米胶囊，直径小于I微米，其特征在于含有(a) —种从聚谷氨酸、聚谷氨酸-聚乙二醇、透明质酸、聚天冬酰胺或它们的组合物中选取的聚合物壳，以及(b) —个由油和阳离子性表面活性剂构成的核心。本发明的纳米胶囊最好包含至少一种活性成分，其条件是，如果该聚合物是聚谷氨酸或聚谷氨酸-聚乙二醇(PGA-PEG)时，所述活性成分则不是膜海鞘素(Didemnina)或海洋缩酚酞(Tamandarina)。
[0061]纳米胶囊:性质和大小
[0062]与乳液系统相比，纳米囊系统的优点是用一种聚合物壳包裹住油性核心，可以赋予其更高的稳定性并防止聚集，能够获取药物释放的曲线变化，更高的细胞内化以及与特定的细胞类型特异性的互动功能。
[0063]相对于其它系统，如通常在有限载药条件下的脂质体或纳米粒子，纳米胶囊特别是亲脂性药物，由于其油性核心的存在，具有更大的载药可能性。纳米胶囊的另一大优势是能够结合不同性质的药物，如封装在胶囊核心的亲脂性药物，也可以是能够结合到所述囊壳的亲水性药物；同时，聚合物壳具备稳定性、保护性和特异性特点。
[0064]相对于其他较大体积的系统(微粒、颗粒、薄膜、海绵等)，本系统在其生物应用中也具有优势。事实上，我们知道，生物表面药物释放系统的相互作用非常受其大小限制。因此，纳米囊能够穿透黏膜并被细胞内化，作为药物运输系统，而微粒却不具有该功能。同样地，这些系统中的生物分布也受大小的限制。近年来，从世界上的纳米医学和药物输送纳米系统中获取的认知，已经在纳米级系统(例如，纳米粒子和纳米胶囊的直径小于I微米)和微系统(微粒和微胶囊)之间设置了一个明确定义。除了在细胞内化和克服复杂生物屏障方面功能的差异，在用于静脉注射抗癌药物的制剂中，纳米给药系统是必不可少的，以防止毛细血管的堵塞。同时，抵达肿瘤组织的纳米系统的可能性，与其大小及其表面的亲水性有严格的关系。
[0065]本发明系统中的纳米胶囊的平均直径小于I微米，因此,对相应的纳米结构体系的定义是，基于尺寸小于I微米的聚合物的胶体系统，也就是说，I至999纳米之间的大小，优选在30至500纳米之间。纳米囊的大小主要是受化学成分和形成条件的影响，可以采用本领域技术人员已知的标准方法进行测量，并在下面实验部分描述。如果在制剂中改变囊壳化合物的比例，从所有纳米系统中获取的纳米胶囊的大小并不会发生明显的变化。
[0066]同样重要的是，要注意纳米胶囊系统和“复合”系统之间的差异。人们所知的“复合”系统是由聚电解质或相反电荷的聚电解质和表面活性剂的相互作用而形成的纳米结构。而本发明的纳米胶囊系统则不同于聚谷氨酸-紫杉醇的复合物(US2003170201)或透明质酸复合物(Kim et al.J.Gene Med.(2009) 11:791),它作为一个油藏类型的纳米载体系统，在其核心部分可容纳 大量的分子数，因为脂质(封装)具有较大或较小的亲和力，而起囊壳中可以加入具有亲和性(吸附性)的亲水性分子。这些功能能够保持纳米结构体的完整性和功能性，以及在生物体液的存在下提供更大的稳定性。
[0067]成分
[0068]聚谷氨酸(PGA)和聚谷氨酸-聚乙二醇(PGA-PEG)
[0069]正如前面发明背景中提到的，在活性分子释放系统的设计中，聚谷氨酸和PEG的共轭组成了非常有趣的生物材料。
[0070]在本文中所用的PGA包括PGA水溶性盐，如铵盐，以及PGA金属盐，如锂盐、钠盐、钾盐、镁盐等。此外，在一个实施例中，PGA从聚-D-谷氨酸、聚-L-谷氨酸、聚-D，L-谷氨酸、聚-α -谷氨酸、聚-a -D-谷氨酸、聚-a -L-谷氨酸、聚-a -D, L-谷氨酸、聚-Y -谷氨酸、聚-Y -D-谷氨酸、聚-Y -L-谷氨酸、聚-Y -D，L-谷氨酸以及它们的混合物中选取。在另一个实施方案中，PGA的优选方式是选择聚-L-谷氨酸，更优选的是聚-L-谷氨酸中的钠盐。还有在其他实施例中，优选聚- α -谷氨酸，更优选的是聚- α -谷氨酸中的钠盐。
[0071 ] 此外，本发明的纳米胶囊可以由PGA或PGA-PEG的水溶性衍生物组成，其中，PGA可以取代一个或多个可用的位置，例如，胺基团和/或羧酸，具有一个或多个合适的基团。PGA和PGA-PEG的衍生物包括聚(烷基谷氨酰胺)衍生物和PEG-聚(烷基谷氨酰胺)衍生物，如聚(N-2- (2’ -羟基乙基)乙基-L-谷氨酰胺)(PEEG)、PEG_PEEG、聚(N-3-(羟基丙基)-L-谷氨酰胺)(PHPG)、PEG-PHPG、聚(N-2-(羟基乙基)-L-谷氨酰胺)(PHEG)、PEG-PHEG、聚(Y -苄基-L-谷氨酰胺)(pBG)、PEG-pBG、聚(Y -三氯乙烯-L-谷氨酸)(pTCEG)、PEG-pTCEG、聚(二甲基氨基乙基-L-谷氨酰胺)(pDMAEG)、PEG-pDMAEG、聚(吡啶基乙基-L-谷氨酰胺)(PPyAEG)、PEG-pPyAEG、聚(氨乙基-L-谷氨酰胺)(pAEG)、PEG-pAEG、聚(组胺酶-L-谷氨酰胺)(pHisG)、PEG-pHisG、聚(胍基丁胺-L-谷氨酰胺)(pAgmG)和PEG-pAgmG，以及它们的混合物(Hoste et al.J.Control.Release, 2000,64, 53-61; Dekie J.Control.Release,2000,65,187-202; Dubruel et al.Biomacromolecules, 2003,4,1168-1176) ? 在任何情况下，本领域的任何一位技术人员必须能够识别正在配制的PGA的变化，以便得到水溶性的衍生物。
[0072]基于聚乙二醇的聚合物壳的存在，为纳米胶囊血浆提供了更大的稳定性，并增加了在体内的停留时间，更快速的为治疗目标给药。因此，与PEG链条的纳米材料的表面改性通过所谓的屏蔽系统(“隐形系统”)或长时间循环系统(“长循环系统”)(Park J.H.et al,2008)，能够减少单核吞噬细胞系统的获取。由于其长期在血液中存在，可以观察到这些系统能够更方便的为器官给药。此改性对抑制细胞生长的药物的运输和靶向性产生兴趣，其靶组织通常表现为乏血供和增加血管的通透性。
[0073]聚乙二醇(PEG)其最常见的形式是(I)公式的聚合物:
[0074]H- (O-CH2-CH2)p-OH
[0075](I)
[0076]其中P为整数，代表的PEG的聚合度。
[0077]聚谷氨酸-聚乙二醇·共轭的形成是采用一种改性聚乙二醇，其中一个或两个末端羟基均是改性的。可以用来获取PGA-PEG共轭改性的聚乙二醇包括公式(II)中提出的:
[0078]X1-(O-CH2-CH2)P-X2
[0079](II)
[0080]其中:
[0081]X1是一种氢原子或一种羟基自由基的保护基团，用于锁定OH功能，看其随后的反应。羟基自由基的保护基团在本领域中是广为人知的；代表性的保护基团(包括要保护的氧气)是甲硅烷基醚，如三甲基甲硅烷基乙醚、三乙基甲硅烷基醚、叔丁基二甲基甲硅烷基醚、叔丁基二苯基甲硅烷基醚、三异丙基甲硅烷基醚、二甲基三甲硅烷基醚、三苯基甲硅烷基醚、二叔丁基二苯基甲硅烷基醚；烷基醚，如甲基醚、叔丁基醚、苄基醚、对甲氧基苄基醚、3'，4' -二甲氧基苄基醚、三苯甲基醚、烯丙醚；烷氧基，如甲氧基甲基醚、2-甲氧基乙氧基、苄氧基甲基醚、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基醚；四氢吡喃基醚及相关的醚；甲硫基甲基醚；酯，如乙酸酯、苯甲酸酯、新戊酸酯、甲氧基酯、氯乙酸酯、乙酰丙酸酯；碳酸盐，如苄基碳酸酯、对硝基苄基碳酸酯、叔丁基碳酸酯、碳酸酯、2，2，2-三氯乙基碳酸酯、2-(三甲基甲娃烷基)乙基碳酸稀丙基。羟基保护基的其它实例可以参考书籍，如Greene和Wuts,John ffiley&Sons, Inc., Nueva York, 1999 “有机合成中的保护基团”。在一个优选的实施方案中，保护基团是烷基醚，优选是甲基醚。
[0082]X2是一个桥接组，用于锚定聚谷氨酸组和它们的衍生物组。另外，Xl也可以作为一个将其与其他的PGA或PGA衍生物锚定的桥接组。
[0083]换句话说，PEG是通过胺基团和/或羧酸与PGA及它的衍生物连接在一起的。
[0084]聚合物的聚乙二醇化可以利用任何一种在本领域中允许使用的合适的方法进行(例如 Veronese et al.DDT, 2005,10 (21), 1451-1458; Nishiyama et al.CancerResearch2003,63,8977-8983;Cabrera et al.J.Control.Release,2005, 101,223-232 ;US2003/0170201 中所描述)。
[0085]这些聚合物可以选中多种不同的分子重量，对于给定用途，适合的分子重量由本领域技术人员可以很容易地确定。因此，举个例子来说，在PGA和PGA-PEG聚合物中PEG合适的分子重量大约在1-1OOkDa之间，优选为约5-80kDa之间，更优选为10_50kDa之间，甚至更确切的说，更优选为约IOkDaJ^J 15kDa，约20kDa，约25kDa，约30kDa，以及约35kDa。
[0086]PEG在PGA-PEG聚合物和水溶性衍生物中的分子重量可以在大约lkDa_50kDa之间，优选为约2kDa_40kDa之间，更优选为约3kDa_30kDa之间，甚至更确切的说，更优选为约4kDa,约 5kDa，约 6kDa，约 7kDa,约 8kDa，约 IOkDa,约 15kDa，约 20kDa，约 21kDa，约 22kDa，约 23kDa，约 24kDa，约 25kDa，以及约 30kDa。
[0087]另外，PGA-PEG聚合物和它们的水溶性衍生物可供选择各种程度的聚乙二醇，对于给定用途，适合的聚乙二醇级由本领域技术人员可以很容易地确定。此聚乙二醇化的程度被定义为与PEG共同作用的PGA功能组的比例或PGA衍生物功能组的比例。因此，适合PGA-PEG聚合物和其水溶性的衍生物的聚乙二醇级大约在0.1 % -10%之间，优选为约0.2%-5%之间，更优选为约0.5%-2%之间，甚至更确切的说，更优选为约0.5%，约0.6%，约0.7%,约 0.8%,约 0.9%,约 1%，约 1.1%，约 1.2%,约 1.3%,约 1.4%,约 1.5%,约 1.6%,约 1.7%,约1.8%,约1.9%,以及约2%。
[0088]此外，PEG在PGA-PEG聚合物和水溶性衍生物中的比例可以在大约10%和90%(p/p)之间，相对于该聚合物的总重量，优选为约15 %和80 %之间，更优选为约20 %和70 %之间，甚至更确切的说，更优选为约20%，约22%，约24%，约26%，约28%，约30%，约32%，约34%,约 36%，约 38%,约 40%，约 42%，约 44%，约 46%，约 48%，约 50%，约 52%，约 54%，约 56%，约58%,以及约60%。
[0089]诱明质酸(HA)
[0090]纳米胶囊的表面上存在的透明质酸，因其知名的粘附性能，使它们能够牢固的粘附在粘膜表面。另一方面，透明质酸有很大的潜力，能够为细胞供给活跃的赋形药，呈现快速增长和⑶44受体的过度承受，使其形成组织；这种细胞活动的一个很明显例子是能够在各种类型的肿瘤细胞中明显的表现出来。
[0091]本文中所用的HA，包括能够溶于HA液体中的可溶性盐类和HA水溶性衍生物。在一个特定的实施案例中，透明质酸盐从钠盐、钾盐、镁盐、钙盐和锌盐的组合中选取。透明质酸盐的优选方式是钠。
[0092]天冬酰胺(PAsn)
[0093]中性聚天冬酰胺在表面上的存在为纳米胶囊提供稳定性，能够在身体器官内保存很长的寿命，保护单核吞噬细胞系统和与特定靶细胞的特异性。
[0094]纳米胶囊表面聚天冬酰胺的存在，也为系统的癌细胞提供更大的特异性，因为这些细胞需要更多的天冬酰胺，来维持其发展。癌细胞无法自我满足这种氨基酸的需要，与正常细胞发生的情况相反。
[0095]如本文所用，PAsn包括PAsn水溶性盐和PAsn水溶性衍生物.[0096]纳米胶囊包括由油和阳离子表面活性剂组成的核心。
[0097]油可以是挥发性的或非挥发性的，在一个特定的实施例中，从天然油、半合成和合成的药物或它们的组合中选定，如如动物油、植物油、碳氢油、硅氧烷。适合的油包括但不限于矿物油、角鲨烯油、调味油、硅氧烷油、精油、不溶于水的维生素、硬脂酸异丙酯、硬脂酸丁酯、棕榈酸辛酯、棕榈酸十六酯、十三烷基、十四烷基二十二烷酸、己二酸二异丙酯、癸二酸二辛酯、基邻氨基苯甲酸酯、辛酸鲸蜡酯、水杨酸辛酯、肉豆蘧酸异丙酯、新戊二醇酮醇、Cemmo,、C12-C15烷基乳酸盐、乳酸十六烷基酯、乳酸月桂酯、乳酸肉豆蘧酯、异硬脂醇新戊酸酯、肉豆蘧酸根、异鲸蜡醇硬脂酸、辛基十二烷基硬脂酰硬脂酸酯、碳氢油、异构烷烃、流体石蜡、異十二烷，、矿脂、坚果油、菜子油、辣椒油、椰子油、玉米油、棉籽油、亚麻籽油、葡萄籽油、芥子油、橄榄油、棕榈油、棕榈分提油、花生油、蓖麻油、松树种子油、罂粟籽油、，南瓜籽油、米糠油、红花油、茶油、松露油、植物油、杏仁油、霍霍巴油、澳洲坚果、小麦胚牙油、扁桃油、大?油、之麻油、棒子油、癸花杆油、麻油、布瓦油、夏威夷果油、鳄梨油、核桃油、鱼油、浆果油、五香粉油、杜松油、种子油、杏仁籽油、茴香种子油、芹菜种子油、孜然油、肉豆蘧种子油、紫苏叶油、月桂叶油、肉桂叶油、普通鼠尾草叶油、桉树叶油、柠檬叶油、白千层叶油、牛至油、广藿香叶油、薄荷叶油、松针油、迷迭香叶油、留兰香油、茶树叶油、百里香叶油、加拿大茶叶油、花油、甘菊油、罗马鼠尾草油、丁香精油、天竺葵花油、牛膝草花油、茉莉花油、薰衣草花油、马乌卡花油、马郁兰花油、橙花油、玫瑰花油、许依兰花油、树皮油、桂树皮油、檫树皮油、木油、樟木油、雪松油、帕洛玫瑰油、檀香油、姜油木油、妥尔油、蓖麻油、没药油、皮油、贝尔加莫果皮油、柚子皮油、柠檬果皮油、酸橙皮油、橙果皮油、陈 皮油、根油、缬草油、油酸、亚油酸、油醇、异硬脂醇、油酸乙酯、Miglyol?、LabrailI?.Labrafac?、Peeeol?和Maisine?+,合成或半合成衍生物以及它们的组合物。
[0098]在一个更具体的实施例中，油从花生油、棉花油、橄榄油、蓖麻油、大豆油、红花油、棕榈油；维生素E、肉豆蘧酸异丙酯德、角鲨烯、Miglyol1, Labrafif、
Labrafacs、Pcccolft #P Maisincf或它们的组合物中选定。油的首选形式是Miglyol8。
[0099]在本发明中，“阳离子表面活性剂”指的是拥有功能性构架和/或组织的组件，能同时与制剂的亲脂性和亲水性部分相互作用，对于阳离子功能性器官性官的存在，这是最优选的相互作用。在特定实施例中，阳离子表面活性剂是从油胺、硬脂胺、苯扎氯铵、苄索氯铵、氯化十六烷基吡啶鎗、十二烷基三甲基溴化铵、十六烷基三甲基溴化铵、和泊洛沙胺
(例如Tetronicli )或它们的混合物。阳离子表面活性剂优选溴化苯扎氯铵或十六烷基三甲
基溴化铵。
[0100]此外，本发明的纳米胶囊可选包含一种油溶性表面活性剂、一种水溶性表面活性剂或两者都含有，以促进系统的稳定，允许纳米胶囊表面电荷的模块化，并带来系统的稳定。
[0101]在本发明中，“油溶性表面活性剂”或“水溶性表面活性剂”指的是拥有功能性构架和/或组织的成分，能同时与制剂的亲脂性和亲水性部分相互作用，相对于油溶性表面活性剂的亲脂性部分或水溶性表面活性剂的亲水性部分，这是最优选的相互作用。
[0102]对于这些可选的表面活性剂，根据其水溶性/油溶性的特性，本文中涉及的表面活性剂包括磷脂如卵磷脂、磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、双磷脂酰甘油、磷脂酸、磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺；胆固醇；甘油单硬脂酸酯；聚氧乙烯聚丙烯共聚物(泊洛沙姆);聚乙二醇；聚丙二醇；鲸蜡醇；十六十八醇；硬脂醇；烷基芳基聚醚醇；脱水山梨糖醇
的脂肪酸酯(如Span8卿Arlaed8:);聚氧乙烯脂肪酸酯(_ Myijs ) t聚氧乙烯脂肪酸酯
(聚山梨醇酯)，氧乙烯烷基醚(聚乙二醇醚)；脂肪醇醚(如Brif),以及它们的混合物。
[0103]根据一个优选的实施例，油溶性表面活性剂是选自卵磷脂、磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、双磷脂酰甘油、磷脂酸、磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺中的一种磷脂，优选卵磷脂。
[0104]在其他更好的实施例中，水溶性表面活性剂是聚氧乙烯亲水性衍生物，优选泊洛沙姆或聚山梨酯。在本发明中“泊洛沙姆”是指由一个聚氧丙烯中央疏水链连接到2个聚氧乙烯亲水链组成的非离子三嵌段共聚物。优选形式是泊洛沙姆188。
[0105]如上所定义，本发明的纳米胶囊还包含任选至少一种活性成分。“活性成分”术语是指用于处理、治疗、预防或诊断疾病或用于改善人类和动物的生理和心理健康的任何物质。活性成分可以是一种药物、维生素等。本发明的纳米胶囊系统对象是适用于掺入亲脂性或亲水性的活性成分。在一个优选的实施方案中，所述活性成分是多西他赛。
[0106]掺入的活性成分的比例取决于要加入的每一种活性成分的具体情况，例如使用说明以及给药效率。
[0107]纳米胶囊包含油、阳离子表面活性剂、一种PGA或PGA-PEG聚合物以及选自的一种didemnin或tamandarina的活性成分,这不在本专利申请范围内，而是EP11382003.9欧洲专利申请的涉及对象，主题为“纳米胶囊剂在药物组合物中的使用”，与本申请是同一天施行法律保护。didemninas和tamandarinas是环缩酹酸肽,能够表现出多种生物活性，如抗肿瘤、免疫抑制和抗病毒。这类化合物的实例(不含本发明涉及的PGA或PGA-PEG纳米胶囊)属于下述通式:
[0108]
【权利要求】
1. 一种施用活性成分的系统，其活性成分包含油、阳离子表面活性剂及所选择的聚合物，包括聚谷氨酸、聚乙二醇-聚谷氨酸、透明质酸和聚天冬酰胺或它们的组合，以及任选的活性成分，其条件是当所述聚合物包含聚谷氨酸、聚乙二醇-聚谷氨酸时，活性成分不是一种膜海鞘素或海洋缩酚酞。
2.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述阳离子型表面活性剂选自苯扎氯铵、苄索氯铵、西吡氯铵、十二烷基三甲基溴化铵、十四烷基三甲基溴化铵、十六烷基三甲基溴化铵和泊洛沙胺或它们的混合物。
3.根据权利要求2所述的系统，其特征在于，所述阳离子表面活性剂是苯扎氯铵或十六烷基三甲基溴化铵。
4.根据上述权利要求中任何一项所述的系统，其特征在于，所述油选自矿物油、角鲨烯油、香料油、硅氧烷油、精油、水不溶性维生素、硬脂酸异丙酯、硬脂酸丁酯、棕榈酸辛酯、棕榈酸十六酯、十三烷基山嵛酸酯、二异丙基己二酸酯、水杨酸辛酯、癸二酸二辛酯、邻氨基苯甲酸基、辛酸鲸蜡酯、肉豆蘧酸异丙酯、新戊二醇，二丙酮醇、Cerafflos'油酸癸酯、C12-C15烷基、乳酸、乳酸十六烷基酯、乳酸月桂酯、新戊酸异硬脂、乳酸肉豆蘧酯、新戊基酮醇硬脂酸异鲸蜡硬脂酰硬脂酸酯、辛基十二烷基硬脂酰硬脂酸酯、烃油、异链烷烃、液体链烷烃、异十二烷、凡士林、坚果油、菜子油、辣椒油、椰子油、玉米油、棉子油、亚麻子油、油葡萄籽、芥子油、橄榄油、棕榈油、棕榈分提油、花生油、蓖麻油、松树种子油、罂粟籽油、南瓜籽油、油米糠、红花子油、茶油、松露油、植物油、杏油、霍霍巴油、澳洲坚果油、小麦胚芽油、杏仁油、大豆油、芝麻油、榛子油油、葵花籽油、麻油、木油、石栗果油、鳄梨油、核桃油、鱼油、果油、五香粉油、杜松油、种子油、油杏仁籽油、茴香、芹菜种子油、香菜种子油、种子油、豆蘧、紫苏叶油、月桂叶油、肉桂叶油、油常见的鼠尾草叶、桉树叶油、朽1檬叶油、茶树叶油、牛至油、广藿香叶油、薄荷叶油、松针油、迷迭香叶油、薄荷油、叶油、茶树叶油百里香油、茶叶加拿大花油、甘菊油、鼠尾草油、丁香油、油、天竺葵花牛膝花油、茉莉油、薰衣草油、花油马乌卡、马郁兰花油、橙花油、玫瑰的花油、依兰花、皮油、桂皮油、桂皮油、油黄樟树皮、木油、樟木油、雪松油、花梨木油、檀香油、油姜木、妥尔油、蓖麻油、没药油、皮肤油、皮肤油贝加莫、柚子皮油、柠檬果皮油、酸橙皮油、橘皮油、陈皮油、根油、纟颜草油、油酸、亚油酸异硬脂醇、油醇、油酸乙酯、Miglyo丨8, Labrafil8、LabrafacB\ PeceolB'y Maisines或人工合成或半合成的衍生物，以及它们的组合。
5.根据要求4所述的系统，其特征在于，所述油指的是Miglyrf8ft
6.根据上述权利要求中任何一项所述的系统，其特征在于，所述系统中还另外包括了油溶性表面活性剂。
7.根据权利要求6所述的系统，其特征在于，所述油溶性表面活性剂是磷脂，选自卵磷月旨、磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、二磷脂、磷脂酸、磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺。
8.根据权利要求7所述的系统，其特征在于，所述磷脂是卵磷脂。
9.根据上述权利要求中任一项所述的系统，其特征在于，所述系统中还另外包括了水溶性表面活性剂。
10.根据权利要求9所述的系统，其特征在于，所述水溶性表面活性剂选自泊洛沙姆和聚山梨醇酯。
11.根据权利要求10所述的系统，其特征在于，所述泊洛沙姆为泊洛沙姆188。
12.根据上述权利要求中的任何一项所述的系统，其特征在于，所述活性成分选自肽、蛋白质、脂肪或亲脂性化合物、糖类化合物、核酸、核苷酸化合物或它们的组合。
13.根据权利要求12所述的系统，其特征在于，所述活性成分为多西紫杉醇。
14.根据权利要求12所述的系统，其特征在于，所述活性成分选自寡核苷酸、RNA干扰、DNA质粒或核苷酸。
15.根据权利要求14所述的系统，其特征在于，所述活性成分是一种DNA的质粒。
16.根据上述权利要求中任何一项所述的系统，其特征在于，它是冻干形式的。
17.如权利要求1至16中任何一项所述的系统的制备步骤，包括: 制备的水溶液含有的聚合物选自聚谷氨酸、聚乙二醇-聚谷氨酸、透明质酸和聚天冬酰胺或它们的组合，以及任选一种水溶性表面活性剂； a)制备的水溶液含有选自聚谷氨酸、聚乙二醇-聚谷氨酸、透明质酸和聚天冬酰胺或由它们的组合组成的聚合物，以及任选的一种水溶性表面活性剂； b)制备包含油和阳离子性表面活性剂，和任选的油溶性表面活性剂的有机溶液； c)在搅拌下，混合步骤a)和b)中制备的溶液，便自发地获得了纳米胶囊； d)任选完全或部分蒸发在前一阶段获得的体积恒定的混合有机溶剂。
18.根据权利要求17所述的制备步骤，其特征在于，所述制备步骤还包括添加一种活性成分，其条件是当所述聚合物包括聚谷氨酸或聚乙二醇-聚谷氨酸，其活性成分不是一种膜海鞘素或海洋缩酚酞。
19.如权利要求1至16中任何一项所述的系统的制备步骤，包括涂覆纳米乳剂，纳米乳剂至少由一种油状物，阳离子表面活性剂，任选一种油溶性的表面活性剂和任选的包含一种水溶性的表面活性剂的油相，通过用聚谷氨酸、聚谷氨酸-聚乙二醇、透明质酸、聚天冬酰胺或它们的混合物的水溶液进行温育过程处理。
20.根据权利要求19所述的制备步骤，其特征在于，所述制备步骤还包括添加活性成分，其条件是当所述聚合物包括聚谷氨酸或聚谷氨酸-聚乙二醇，其活性成分不是一种膜海鞘素或海洋缩酚酞。
21.根据权利要求17至20中的任一项所述的制备步骤，其特征在于，所述制备步骤包括在冷冻保护剂的作用下，将所得到的系统进行冷冻干燥操作。
22.根据权利要求21所述的制备步骤，其特征在于，所述制备步骤包括恢复冷冻干燥的系统。
23.包含如权利要求1至16中任何一项所述的系统的药物组合物。
24.根据权利要求23所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物中所述的成分是用于局部、肠胃外或通过粘膜的施用。
25.如权利要求1至16中任何一项所述的系统在制备药物中的应用。
26.如权利要求1至16中任何一项所述的系统在制备用于治疗癌症的药物中的应用。
【文档编号】B82Y5/00GK103596558SQ201280012254
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2012年1月9日 优先权日:2011年1月10日
【发明者】玛丽亚·乔斯·阿朗索·费尔南德斯, 德洛丽丝·托里斯·洛佩斯, 古斯塔沃·里韦拉·罗德里格斯, 费莉佩·安德烈斯·奥亚尔赞·安普埃罗, 乔凡娜·洛洛, 特丽萨·贡萨洛·拉萨罗, 马克仕·加西亚·富恩特斯 申请人:圣地亚哥德孔波斯特拉大学