癌症治疗反应分析的制作方法
交叉引用
本专利申请案主张于2018年10月2日提交的编号为62/740,013的美国临时专利申请案以及于2018年3月16日提交的编号为62/644,303的美国临时专利申请案提交日期的优先权，上述专利中的内容以引用方式并入本文中。
联邦资助的研究与开发
本发明专利获得了政府的支持，其中，美国国立卫生研究院的资助项目为ca196585。政府拥有本发明的某些权利。
背景技术：
肿瘤细胞的转化和生长是一个复杂的过程，即使在特定的组织类型内也可以变化。可以定义肿瘤细胞表型的分析方法可用于确定适当的疗法，因此具有临床意义。另外，了解起效疗法相关的机制可以确定这些药剂的最佳配方和剂量；可以筛选有效治疗癌症的药剂；以及在治疗过程中进行患者随访。
蛋白质表达和翻译后修饰的各种变化发生在肿瘤形成和治疗反应过程中，例如可以传递细胞内信号的分子机制，即可逆磷酸化。大量信号蛋白是作用于丝氨酸，苏氨酸和酪氨酸残基的激酶或磷酸酶。预计有超过2000种人类基因编码激酶，并且每种激酶都有可能作用于多个靶点，因此信号网络非常复杂。解决这种复杂性的关键是开发新的蛋白质组学技术，以多重方式定量监测信号蛋白质的磷酸化状态。该技术使我们能够在全球范围内详细分析信号通路，并且快速识别对治疗剂有反应、而先前未认可的信号转导机制。
蛋白质检测中的敏化方法可以追踪对治疗剂反应的蛋白质，特别是亚型蛋白质的变化，具有很大的临床意义。本发明解决了这一需求。
技术实现要素：
在特定实施例中，应用纳米流体蛋白质组学免疫测定(nia)定量来自组织样品的少量裂解物中的分析物，包括但不限于蛋白质数量、亚型蛋白质、参与致癌信号通路的蛋白质磷酸化亚型。nia的目的样品包括但不限于血液及其衍生物，例如来自血液的血浆或细胞，或实体瘤显微活检样品，例如细针抽吸物(fna)或循环肿瘤细胞。可以在单个时间点或多个时间点采样。样品可以是小至100000个、5000个、1000个、100个、50个、25个或更少的细胞。nia的检测方法在纳米流体系统中结合了(分子)大小或蛋白质等电聚焦，以及抗体检测。样品中可以保留血细胞以减少变异性。由于nia只需要少量标本，因此该分析是微创的，这使得在治疗开始之前和之后能获得诸如系列蛋白质谱，以及通过量化收治患者中蛋白质活性的早期变化来确定预测性蛋白质生物标志物；等等。
在一些实施例中，通过细针抽吸获得临床样品。在一些实施例中，临床样品是在体内取样或离体培养的实体瘤的细针抽吸物(fna)。在一些实施例中，该方法还比较了fna与相邻的癌旁组织。在一些实施例中，对象是人类。
在本发明的一些实施例中，nia检测温度维持在高达约25℃，例如4℃至约25℃的样品。磷酸化蛋白质稳定性，例如临床细针抽吸物(fna)样品中的erk磷酸化，的一个重要问题是，fna的储存时间是指在实验室中收集fna的时间间隔还是快速冷冻fna(例如在-80℃或更低的温度下)的时间间隔。fna储存时间可长达12、18、24、36、48小时或更长时间；也可短至4、6、8、12小时。fna可以储存在冷介质中，例如rpmi、dme、pbs等，储存温度约4℃至约10℃之间，通常为4℃。为了解决这些问题，我们进行了基准测试，以验证肾癌患者fna中蛋白质磷酸化的稳定性。erk的磷酸化和非磷酸化亚型的相对丰度非常稳定，表明fna处理的方法没有显著改变测量值，即使储存时间长达2天。在一些实施例中，临床样品在fna储存时间后快速冷冻。
用于分析的蛋白质包括但不限于谷氨酰胺酶1(gls1)的亚型kga和gac；过氧化物酶6(prdx6)；人碳酸酐酶9；人α微管蛋白；人细胞周期蛋白d1；人p21；人p27；人视网膜母细胞瘤蛋白(prb)；人受体酪氨酸激酶axl；人血管内皮生长因子受体2(vegfr2)；人pax8；人pdl1。分析可以针对表达水平和/或亚型分布。
在一些实施例中，nia用于监测癌细胞样品(例如患者样品)对治疗的反应。在一些实施例中，疗法为放射治疗。在一些实施例中，疗法为靶向治疗，例如激酶抑制剂。此处举例说明的特定药物包括，例如卡博替尼、阿西替尼、曲美替尼、rigosertib、iqgap1、ww结构域肽等。放射和/或免疫疗法可以与任何全身疗法结合。治疗后通过nia分析样品以确定目的蛋白质，包括亚型蛋白质，的丰度和分布。尤其是，药物治疗导致nia可检测的亚型蛋白质(包括erk、akt1、akt3、mek2、prdx6、p70s6k1、s6、pcna、细胞周期蛋白d1、裂解parp-1)的差异分布，其在处理和未处理的样品中有不同的分布模式。
在一些实施例中，用药物治疗患者，并在治疗后获得活检样品。在其他实施例中，离体处理活检样品以确定癌症对目的治疗的响应性，其中如果证明单个样品具有响应性，则可以向患者施用治疗。
附图说明
图1a-1b.图1a:两个人类rcc肿瘤(t1和t2)和一个正常肾(n)中erk2磷酸化亚型的相对丰度(通过使用抗erk2抗体[emdmillipore，目录号06-182]以1:300稀释度的电荷分离nia测量，取两次实验的平均值)，比较同一天(组织收集后1小时内，“第0天”)与24小时之后(“第1天”)的fna处理。图1b：同一人rcc肿瘤的两个区域(t1和t2)和相邻正常肾(n)中erk2磷酸化亚型的相对丰度(通过nia测量，取两次实验的平均值)，比较组织收集当天(组织收集后1小时内，“第0天”)与2天后(收集后40小时，“第2天”)的fna处理。
图2.通过使用抗erk2抗体[emdmillipore，目录号06-182]以1:300稀释度的电荷分离nia测量erk2磷酸化亚型的相对丰度，在同一人rcc肿瘤的两个区域(区域t1，左图；区域t2，右图)，比较室温下与冰上的fna运输和处理。收集后1小时内处理fna。
图3.从4例肾癌患者获取rcc肿瘤的两个区域(t1和t2)和相邻肾组织(n)的细针抽吸物。电荷分离nia用于测量这些样品中谷氨酰胺酶1(gls1)的亚型kga和gac水平，以抗gls1(epitomics，目录号t3472)为抗体。左：来自fna的nia谷氨酰胺酶迹线的例证。右：4例患者的图形数据，每例患者有2个来自肿瘤的fna(t1和t2)，以及来自癌旁组织(n)的一个fna。
图4.使用mag-sifter技术从10例患者中分离循环肿瘤细胞：冷冻每位患者的细胞沉淀。使用电荷分离nia分析每位患者的细胞沉淀，以测量过氧化物酶6(prdx6)亚型，用抗prdx6为抗体(abcam，目录号73350)。患者有egfr突变(mut)，野生型(wt)或未知的egfr状态(a，b，c，d)。
图5a:通过人碳酸酐酶9(ca9)和人α-tublin(微管蛋白)的大小分离进行纳米免疫测定(nia)。在全细胞蛋白裂解物的nia大小分离后，用抗ca9(genetex，克隆gt12，目录号gtx70020)或抗微管蛋白抗体(emdmillipore，克隆dm1a，目录号mabt205)在指定稀释度下探测缺乏vonhippel-lindau肿瘤抑制因子(vhl)的人肾癌细胞系786-o(786-o，阳性对照)，或与vhl重组的786-o(786-ovhl，阴性对照)。预期分子量：ca9：55-60kda；微管蛋白：55kda。图5b.通过nia大小分离来自人肾癌组织的组织切片培养物(tsc)的蛋白质裂解物检测作为患者衍生的异种移植物在小鼠中扩增的微管蛋白。在体外培养来自pdx小鼠的肿瘤组织切片，并用iqgap1ww结构域肽(ww)，杂乱肽(scr；ww的阴性对照)，曲美替尼(mek抑制剂)或载体(dmso；曲美替尼的阴性对照)处理2天。用抗微管蛋白抗体(emdmillipore，克隆dm1a，目录号mabt205，稀释度1:100)探测组织蛋白质裂解物。k562：细胞系对照，未处理或用10μm伊马替尼(+imat)处理29小时。图5c.通过人细胞周期蛋白d1的大小分离进行纳米免疫测定(nia)。用抗细胞周期蛋白d1抗体(tthermoscientific，克隆sp4，目录号rm-9104-s1，稀释度1:50)探测指定蛋白质浓度的人htertrpe-1全细胞裂解物。左图：参照蛋白质浓度的nia化学发光信号，以证明测定的线性关系。r2:相关系数。右图：nia信号的凝胶视图。细胞周期蛋白d1的预期分子量：36kda。图5d.通过人p21的大小分离进行纳米免疫测定(nia)。用抗p21抗体cellsignalingtechnology，克隆12d1，目录号2947，稀释度1:200)(探测指定蛋白质浓度的人htertrpe-1全细胞裂解物。左图：参照蛋白质浓度的nia化学发光信号，以证明测定的线性关系。r2:相关系数。右图：nia信号的凝胶视图。p21的预期分子量：21kda。图5e.通过人p27的大小分离进行纳米免疫测定(nia)。用抗p27抗体(cellsignalingtechnology，克隆69c12，目录号3686，稀释度1:100)探测指定蛋白质浓度的人htertrpe-1全细胞裂解物(2dss：从培养基中取出血清2天后制备)。左图：参照蛋白质浓度的nia化学发光信号，以证明测定的线性关系。r2:相关系数。右图：nia信号的凝胶视图。p27的预期分子量：27kda。图5f.通过人视网膜母细胞瘤蛋白(prb)的大小分离进行纳米免疫测定(nia)。用抗prb抗体(cellsignalingtechnology，克隆d20，目录号9313，稀释度1:50)探测指定蛋白质浓度的人htertrpe-1全细胞裂解物。左图：参照蛋白质浓度的nia化学发光信号，以证明测定的线性关系。r2:相关系数。右图：nia信号的凝胶视图。prb的预期分子量：110kda。图5g.通过人受体酪氨酸激酶axl的大小分离进行纳米免疫测定(nia)。用抗axl抗体探测人肾癌细胞系sn12l1全细胞裂解物。axl的预期分子量：138kda和更高分子量的形式。图5h.通过人血管内皮生长因子受体2(vegfr2)的大小分离进行纳米免疫测定(nia)。用抗vegfr2抗体(cellsignalingtechnology，克隆55b11，目录号2479，稀释度1:100)探测指定蛋白质浓度的人肾癌细胞系786-o全细胞裂解物。左图：参照蛋白质浓度的nia化学发光信号，以证明测定的线性关系。r2:相关系数。右图：nia信号的凝胶视图。vegfr2的预期分子量：210和230kda。图5i.通过人pax8的大小分离进行纳米免疫测定(nia)。人肾癌细胞系786-o(阳性对照)和人细胞系hek293(阴性对照)的全细胞裂解物，用三种不同的抗pax8抗体(p12：novusbiologicals，目录号nbp1-32440；p13：genetex，目录号gtx101583；p14：abcam，克隆epr18715，目录号ab191870)探测。pax8的预期分子量：48kda。
图6a.在细胞裂解，nia电荷分离蛋白质，以及用抗pan-erk抗体(emdmillipore，目录号06-182，稀释度1:300)探测786-o细胞之前，用卡博替尼(1μm)或dmso(阴性对照)处理786-o细胞1天，并用vegf或hgf(10ng/ml)刺激10分钟，786-o细胞中erk1和erk2磷酸化亚型的相对丰度。误差条形图：三次实验的标准差(sd)。图6b.与先前数据相同，但无主导的未磷酸化erk亚型。红框：用hgf刺激后，卡博替尼和对照处理的细胞之间特异性erk磷酸化亚型的丰度呈最显著差异。
图7a.用抗akt2抗体(cellsignalingtechnology，克隆d6g4，目录号3063)探测来自人肾癌和人正常肾的组织蛋白质裂解物，并用nia电荷分离。鉴定出不同电荷的akt2亚型，可能代表未磷酸化，单磷酸化和多磷酸化的akt2。图7b.用抗mek2抗体(cellsignalingtechnology，目录号9125，稀释度1:50)探测来自人肾癌和人正常肾的组织蛋白质裂解物，并用nia电荷分离。鉴定出不同电荷的mek2亚型，可能代表未磷酸化，单磷酸化和多磷酸化的mek2。图7c.从人肾癌中分离组织蛋白质裂解物，在手术期间体内活检，在手术切除肿瘤后再次离体，用抗pan-erk抗体(emdmillipore，目录号06-182，稀释度1:300)探测细胞，并用nia电荷分离。在两个组织样品中，总体erk磷酸化谱相似，其中未磷酸化的erk2(erk2)和单磷酸化的erk2(perk2)是主要的erk亚型。图7d.从肾癌患者血细胞中分离全细胞裂解物，并用nia电荷分离。在手术肾肿瘤切除当天抽取的血液中分离细胞，并在手术后第1天再次从血液中分离细胞。培养细胞，并在vitaassay板上扩增，用抗pan-erk抗体(emdmillipore，目录号06-182，稀释度1:300)探测裂解物。图7e.从非小细胞肺癌患者血细胞中分离全细胞裂解物，并用nia电荷分离。在放射疗法开始当天抽取的血液中分离细胞，并在放射疗法后第3天再次从血液中分离细胞。培养细胞，并在vitaassay板上扩增，用抗prdx6抗体(abcam，目录号73350)探测裂解物。鉴定了不同电荷的多种prdx6亚型，处理前后的谱不同。
图8a.nia电荷分离来自人淋巴瘤组织的全细胞裂解物，作为患者衍生的异种移植物在小鼠中扩增，并用卡博替尼或载体(阴性对照)处理2天。用抗pan-erk抗体(emdmillipore，目录号abs44，稀释度1:50)探测组织蛋白质裂解物。图8b.nia电荷分离来自人淋巴瘤组织的全细胞裂解物，作为患者衍生的异种移植物在小鼠中扩增，并用卡博替尼或载体(阴性对照)处理2天。用抗akt3抗体(emdmillipore，目录号07-383，稀释度1:50)探测组织蛋白质裂解物。图8c.nia电荷分离全细胞裂解物，作为患者衍生的异种移植物在小鼠中扩增。用特异性akt1(r&dsystems，目录号af1775，稀释度1:50)，akt2(cellsignalingtechnology，克隆d6g4，目录号3063，稀释度1:50)，以及akt3(emdmillipore，目录号07-383，稀释度1:50)抗体探测组织蛋白质裂解物，鉴定每种akt亚型的差异电荷(可能是磷酸化)亚型。图8d.nia电荷分离全细胞裂解物，作为患者衍生的异种移植物在小鼠中扩增。用抗p70s6k1抗体(santacruzbiotechnologies，克隆h-8，s目录号c-8418，稀释度1:50)探测组织蛋白裂解物，鉴定p70s6kinase1的两种不同电荷的亚型，可能代表该蛋白的不同磷酸化状态。图8e.nia电荷分离全细胞裂解物，作为患者衍生的异种移植物在小鼠中扩增。用抗phosphos6抗体(cellsignalingtechnology，克隆d68f8，目录号5364，稀释度1:50)探测组织蛋白裂解物，鉴定出三种不同电荷的磷酸化s6蛋白亚型。图8f.通过nia电荷测定定量相对erk磷酸化亚型丰度。人淋巴瘤作为患者衍生的异种移植物(cdx第1代)在小鼠中扩增，并传代至第二代pdx小鼠(cdx第2代)。然后用卡博替尼、阿西替尼或载体(阴性对照)处理第二代pdx小鼠2天，收集组织，通过nia电荷测定分离蛋白质裂解物，并用抗pan-erk抗体(emdmillipore，目录号abs44，稀释度1:50)探测。erk1和erk2的每种磷酸化亚型的相对丰度分别定量为总erk1或erk2的分数。误差条形图：三次重复实验的平均值的标准差。图8g.通过nia电荷测定定量phospho-erk表达水平。将人淋巴瘤中erk1和erk2磷酸化亚型的定量erk测量值(“标准化区域”)作为患者衍生的异种移植物在小鼠(与先前样品相同)中扩增，归一化到hsp70(“管家”基因，抗体：santacruzbiotechnology,克隆w27,目录号sc-24，稀释度1:500)。误差条形图：三次重复实验的平均值的标准差。图8h.通过nia电荷测定定量总erk表达水平。将人淋巴瘤中erk1和erk2总量的定量erk测量值(“标准化区域”)作为患者衍生的异种移植物在小鼠(与先前样品相同)中扩增，归一化到hsp70(“管家”基因，抗体：santacruzbiotechnology,克隆w27,目录号sc-24，稀释度1:500)。误差条形图：三次重复实验的平均值的标准差。
图9a.通过nia大小分离来自人肾癌组织的组织切片培养物(tscs)的蛋白质裂解物,检测作为患者衍生的异种移植物在小鼠中扩增的裂解parp-1(凋亡标志物)。在体外培养来自pdx小鼠的肿瘤组织切片，并用iqgap1ww结构域肽(ww)，杂乱肽(scr；ww的阴性对照)，曲美替尼(mek抑制剂)或载体(dmso；曲美替尼的阴性对照)处理2天。用抗裂解parp-1抗体(emdmillipore，目录号abc26，稀释度1:100)探测组织蛋白质裂解物。k562：细胞系对照，未处理(阴性对照)或经10μm伊马替尼(+imat.；阳性对照)处理29小时。图9b.通过nia大小分离来自人肾癌组织的组织切片培养物(tsc)的蛋白质裂解物，检测pcna(增殖细胞核抗原；细胞周期s/g2期增殖细胞的标志物)，作为患者来源异种移植物在小鼠中扩增。在体外培养来自pdx小鼠的肿瘤组织切片，并用iqgap1ww结构域肽(ww)，杂乱肽(scr；ww的阴性对照)，曲美替尼(mek抑制剂)或载体(dmso；曲美替尼的阴性对照)处理2天。用抗pcna抗体(cellsignalingtechnology,克隆pc10,目录号2586，稀释度1:50)探测组织蛋白质裂解物。k562：细胞系对照，未处理(阳性对照)或经10μm伊马替尼(+imat.；阴性对照)处理29小时。图9c.通过nia大小分离来自人肾癌组织的组织切片培养物(tsc)的蛋白质裂解物，检测细胞周期蛋白d1(细胞周期g1期增殖细胞的标志物)，作为患者来源异种移植物在小鼠中扩增。在体外培养来自pdx小鼠的肿瘤组织切片，并用iqgap1ww结构域肽(ww)，杂乱肽(scr；ww的阴性对照)，曲美替尼(mek抑制剂)或载体(dmso；曲美替尼的阴性对照)处理2天。用抗细胞周期蛋白d1抗体(thermoscientific，克隆sp4，目录号rm-9104-s0)探测组织蛋白质裂解物。k562：细胞系对照，未处理或用10μm伊马替尼(+imat)处理29小时。图9d.通过nia电荷测定在来自人肾癌组织的组织切片培养物(tscs)中定量erk磷酸化亚型的表达水平，作为患者来源的异种移植物在小鼠中扩增。在体外培养来自pdx小鼠的肿瘤组织切片，并用iqgap1ww结构域肽(ww)，杂乱肽(scr；ww的阴性对照)，曲美替尼(mek抑制剂)或载体(dmso；曲美替尼的阴性对照)处理2天。用抗pan-erk抗体(emdmillipore，目录号abs44，稀释度1:50)探测组织蛋白质裂解物。量化erk1和erk2的每种磷酸化亚型的表达水平，归一化到hsp70(“管家”基因，抗体：santacruzbiotechnology,克隆w27,目录号sc-24，稀释度1:500)。误差条形图：三次重复实验的平均值的标准差。图9e.通过nia电荷测定在来自人肾癌组织的组织切片培养物(tscs)中定量erk磷酸化亚型的相对丰度，作为患者来源的异种移植物在小鼠中扩增。在体外培养来自pdx小鼠的肿瘤组织切片，并用iqgap1ww结构域肽(ww)，杂乱肽(scr；ww的阴性对照)，曲美替尼(mek抑制剂)或载体(dmso；曲美替尼的阴性对照)处理2天。用抗pan-erk抗体(emdmillipore，目录号abs44，稀释度1:50)探测组织蛋白质裂解物。erk1和erk2的每种磷酸化亚型的相对丰度分别定量为总erk1或erk2的分数。误差条形图：三次重复实验的平均值的标准差。图9f.通过nia大小测定法在来自人肾癌组织的组织切片培养物(tscs)中量化裂解parp-1(凋亡标记物)的表达水平，作为患者衍生的异种移植物在小鼠中扩增。在体外培养来自pdx小鼠的肿瘤组织切片，并用iqgap1ww结构域肽(ww)，杂乱肽(scr；ww的阴性对照)，曲美替尼(mek抑制剂)或载体(dmso；曲美替尼的阴性对照)处理2天。用抗裂解parp-1抗体(emdmillipore，目录号abc26，稀释度1:100)探测组织蛋白质裂解物，量化的表达水平归一化到微管蛋白(“管家”基因)。k562：细胞系对照，未处理(阴性对照)或经10μm伊马替尼(+imat.；阳性对照)处理29小时。图9g.通过nia大小测定法在来自人肾癌组织的组织切片培养物(tscs)中量化pcna和细胞周期蛋白d1(增殖标记物)的表达水平，作为患者衍生的异种移植物在小鼠中扩增。在体外培养来自pdx小鼠的肿瘤组织切片，并用iqgap1ww结构域肽(ww)，杂乱肽(scr；ww的阴性对照)，曲美替尼(mek抑制剂)或载体(dmso；曲美替尼的阴性对照)处理2天。用抗pcna(cellsignalingtechnology,克隆pc10，目录号2586，稀释度1:50)或抗细胞周期蛋白d1抗体(thermoscientific,克隆sp4,目录号rm-9104-s0)探测组织蛋白裂解物，量化的表达水平归一化到微管蛋白(‘管家'基因)。k562：细胞系对照，未处理(阳性对照)或用10μm伊马替尼(+imat；阴性对照)处理29小时。nia可用于测量离体处理的人类癌症组织中的一组凋亡和增殖标志物，以比较药物是否起效：曲美替尼降低了细胞周期增殖(pcna)，不改变细胞凋亡(裂解parp-1)，而ww肽诱导了细胞凋亡和增加了细胞周期(pcna)。
图10a-b.f图10a.myc失活在t-all4188细胞系中增加了perk1,pperk2和erk2水平。与高myc(蓝色)相比，四环素(tetracycline)处理过的t-all小鼠来源的细胞系4188(绿色)中myc24小时失活，表明通过nia电荷测定检测到了phospho-erk变化。图10b.在burkittp493-6细胞系中，myc失活降低了erk1水平。与高myc(蓝色)和hela细胞(灰色)相比，经过tetracycline处理的人burkitt淋巴瘤细胞系p493-6(绿色)中myc24小时失活，纳米免疫大小测定检测到myc失活降低了erk1。
图11：nia可用于测量药物靶点pdl1和vegfr2。左：用人抗pdl1抗体(abcam，克隆28-8，目录号ab205921，稀释度1:50)探测su-dhl-1细胞系(阳性对照，“+”)和rcc-4细胞系(阴性对照，“-”)中的pd-l1。在阳性对照细胞系中特异性检测pd-l1。右：用人抗vegfr2抗体(cellsignalingtechnology，克隆55b11，目录号2479，稀释度1:50)探测time细胞系(vegfr2强表达，“+”)和rcc-4细胞系(vegfr2弱表达，“-”)中的vegfr2。与rcc-4相比，在time细胞中检测到更高水平的vegfr2。
定义
应当理解，本发明不限于所述的特定方法，方案，细胞系，动物物种或属，以及试剂，因为在实际实施中可能会存在差异。还应当理解，本文中使用的术语仅用于描述特定实施例，而无意限制本发明构思，本发明的范围将仅由所附权利要求书限定。还应当理解，本文中使用的术语仅用于描述特定实施例，而无意限制本发明构思，本发明的范围将仅由所附权利要求书限定。
本文中使用的单数形式的“一”、“一个”和“所述/该”包括复数指代对象，除非上下文另有明确说明。因此，举例而言，“一个化合物”的指代对象包括多个此类化合物，而“所述药剂”指的是一种或多种药剂及所属领域技术人员已知的等效物，等等。除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。
nia.在一些实施例中，提供了用于纳米免疫测定(nia)的方法，包括癌症的系列分析。nia检测准确测量有限临床标本中的癌蛋白表达和活化，包括磷酸化不同的蛋白质亚型。nia的检测方法在微流体系统中结合了蛋白质等电聚焦，以及抗体检测。蛋白质，包括蛋白质亚型，可以通过nia等电聚焦或大小分离来检测。
可以在单个时间点或多个时间点采样,例如至少2个时间点。样品可以是小至100000个、5000个、1000个、500个、100个、50个或更少的细胞。在一些实施例中，样品可以小于1000个细胞，例如小于500、400、300、200、100、90、80、70、60、50、40、30、20或10个细胞。在一些实施例中，样品是细针抽吸物(fna)。fnas的进行由医生决定。该过程需要将小号针头，通常是21至25号针头，插入肿块中以去除细胞样品，用于显微镜评估。该过程应使用一种或多种类似于缝纫机的漂移，同时施加最小的负压。在一些实施例中，需要使用不超过0.5cc的吸力。
关于患者的术语“样品”包括生物来源的血液和其他液体样品，固体组织样品如活检标本，组织培养物或由其衍生的细胞及其后代。该定义还包括在采购后以任何方式处理过的样品，例如通过试剂、清洗或富集某些细胞群(例如癌细胞)而处理过的样品。该定义还包括富含特定类型分子的样品，例如核酸，多肽等。术语“生物样品”包括临床样品，还包括通过手术切除获得的组织，通过活检获得的组织，培养细胞，细胞上清液，细胞裂解物，组织样本，器官，骨髓，血液，血浆，血清等。“生物样品”包括从患者癌细胞获得的样品，例如包含从患者癌细胞获得的多核苷酸和/或多肽的样品(例如，细胞裂解物或包含多核苷酸和/或多肽的其他细胞提取物)；和包含患者癌细胞的样品。包含患者癌细胞的生物样品也可以包括非癌细胞。
活检样品。样品，特别是细针抽吸物(fna)，可以维持在约4℃和室温之间的温度，例如，从患者获得样品后，可在约25℃维持长达3天，2天，1天，12小时，和6小时。可以维持样品而不裂解细胞或红细胞。当在约-80℃下冷冻储存较长时间时，样品或其裂解物是稳定的。因此，在本发明的一些实施例中，会对先前冷冻的样品进行分析。
在分析之前，先裂解暴露于目的试剂或研究条件后的细胞。本领域已知的裂解方法，包括超声处理，非离子表面活性剂等。非离子表面活性剂包括tritontm家族洗涤剂，例如tritontmx-15；tritontmx-35；tritontmx-45；tritontmx-100；tritontmx-102；tritontmx-114；tritontmx-165等。brijtm洗涤剂的结构与tritontmx洗涤剂类似，都具有不同长度附着于疏水链的聚环氧乙烷链。tweentm洗涤剂是非变性非离子洗涤剂，是脂肪酸的聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯。tweentm80衍生自具有c18链的油酸，而tweentm20由具有c12链的月桂酸衍生。两性离子洗涤剂chaps是胆酸磺基甜菜碱衍生物。bicine(二乙基甘氨酸)是可以用chaps配制的两性离子氨基酸缓冲液。当蛋白质活性至关重要时，该两性离子去污剂和缓冲液可用于膜蛋白溶解。表面活性剂与细胞接触一段时间，足以裂解细胞并从系统中去除多余的贴壁细胞。
细胞分级分离的方法在本领域中也是已知的。亚细胞分级分离包括两个主要步骤，细胞组织的破坏(裂解)和匀浆的分级分离以分离不同的细胞器群。然后可以通过差速离心将这种匀浆分解成几个部分，主要包含(1)细胞核，重线粒体，细胞骨架网络和质膜；(2)轻线粒体，溶酶体和过氧化物酶体；(3)高尔基体，内体和微粒体，和内质网(er)；和(4)胞质溶胶。每个细胞器群体的特征在于分离所依赖的大小，密度，电荷和其他性质。
等电聚焦或大小分离的蛋白质与特定的成员结合。相对比率测量中，可以使用识别蛋白质所有亚型的单一泛特异性抗体，例如泛特异性抗体等。确定蛋白质的总量，例如erk2，erk1等，并使用nia计算磷酸化的百分比。nia生成峰值，每个峰值的面积通过计算峰值开始和结束时纵坐标下降到基准，并将起点和终点之间的面积相加。标准化值测量使用类似的过程，但是该测定还利用目的蛋白质的抗体(例如泛特异性抗体)和上样对照抗体(例如hsp-70抗体，微管蛋白等)进行归一化。nia用于区分不同的亚型。
可以比较疑似肿瘤组织的组织和配对的正常或肿瘤对照组织，例如疑似肿瘤样品，与相邻的非肿瘤皮肤样品等相比。还可以比较参考肿瘤组织和具有时间序列的样品，例如治疗之前和之后等。比率可以是非肿瘤/肿瘤，或肿瘤/非肿瘤。在一些实施例中，比率是比单一的肿瘤或正常组织测量更具预测性或诊断性的生物标志物。
在一些实施例中，nia用于监测磷酸化的变化。大多数磷酸化是调节蛋白质生物活性的机制，因此是短暂的。在动物细胞中，丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸是磷酸化的氨基酸。最大的群激酶是磷酸化丝氨酸或苏氨酸的激酶，因此被称为丝氨酸/苏氨酸激酶。丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸三种不同氨基酸的磷酸化比率约为1000/100/1。尽管酪氨酸磷酸化的水平较低，但是该氨基酸的磷酸化有深远意义。例如，许多生长因子受体的活性受酪氨酸磷酸化控制。
本发明中的“患者”包括人和其他动物，特别是哺乳动物，包括宠物和实验动物，例如小鼠，大鼠，兔等。因此，该方法适用于人类治疗和兽医应用。在一个实施例中，患者是哺乳动物，优选灵长类动物。在其他实施例中，患者指人类。
术语“受试者”、“个体”和“患者”在本文中可互换使用，指的是正在评估治疗和/或正在治疗的哺乳动物。在一个实施例中，哺乳动物指人类。术语“受试者”、“个体”和“患者”包括但不限于患有癌症的个体。受试者可以是人，但也包括其他哺乳动物，特别是那些可用作人类疾病实验室模型的哺乳动物，例如小鼠，大鼠等。
术语“癌症”、“赘生物”和“肿瘤”在本文中可互换使用，指的是呈自主的，不受调节生长的细胞，因此它们表现出异常生长表型，以丧失控制细胞增殖为特征。在本申请中用于检测，分析或治疗的目的细胞包括癌前(例如良性)、恶性、转移前、转移性和非转移性细胞。几乎每个组织的癌症都是已知的。“癌症负担”一词是指受试者中癌细胞的数量或癌症体积。相应地，减少癌症负担是指减少受试者中癌细胞的数量或癌症体积。本文所用术语“癌细胞”是指任何癌细胞或衍生自癌细胞，例如癌细胞克隆的细胞。本领域技术人员已知许多类型的癌症，包括实体瘤，例如癌、肉瘤、成胶质细胞瘤、黑素瘤、淋巴瘤、骨髓瘤等，以及循环癌症，例如白血病。癌症的例子包括但不限于卵巢癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌、前列腺癌、肝细胞癌、胃癌、胰腺癌、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、尿路癌、甲状腺癌、肾癌、恶性上皮肿瘤、黑素瘤、头颈癌，和脑癌。
癌症的“病理学”包括所有损害患者健康的现象。这包括但不限于异常或无法控制的细胞生长，转移，对邻近细胞正常功能的干扰，异常水平的细胞因子或其他分泌产物的释放，炎症或免疫反应的抑制或加重，瘤形成，恶变前，恶性肿瘤，侵入周围或远处的组织或器官，如淋巴结等。
本文所用术语“癌症复发”和“肿瘤复发”及其语法变体，是指在诊断出癌症后肿瘤或癌细胞的进一步生长。尤其是，当癌组织中发生进一步的癌细胞生长时，可能发生复发。类似地，当肿瘤细胞扩散到局部或远处的组织和器官中时会发生“肿瘤扩散”；因此肿瘤扩散包括肿瘤转移。当肿瘤生长局部扩散以通过压缩，破坏或预防正常器官功能而损害相关组织的功能时，就会发生“肿瘤侵袭”。
本文所用术语“转移”是指器官或身体部位中癌性肿瘤的生长，其与原始癌性肿瘤的器官无直接联系。应理解的转移包括微转移，微转移是在器官或身体部位中存在不可检测量的癌细胞，其与原始癌性肿瘤的器官无直接联系。转移也可以定义为过程的几个步骤，例如癌细胞离开原始肿瘤部位，以及癌细胞迁移和/或侵袭身体的其他部位。
本文所用术语“诊断”是指分子或病理状态，疾病或病症的鉴定，例如鉴定乳腺癌，前列腺癌或其他类型癌症的分子分型。
本文所用术语“预后”是指预测诸如卵巢癌的肿瘤疾病的癌症归因性死亡或进展，包括复发，转移性扩散和耐药性，的可能性。本文所用术语“预测”是指基于观察，经验或科学推理的预言或估计行为。在一个示例中，医生可以预测患者在手术切除原发性肿瘤和/或化疗一段时间后没有癌症复发的可能性。
本文所用术语“疗法”，“治疗”等是指为了获得效果而施用药剂或执行步骤。预防作用指的是对疾病或其症状的完全或部分预防，治疗作用指的是疾病和/或疾病导致的症状实现部分或完全治愈。本专利中使用的“治疗”包括了哺乳动物、特别是人类疾病的任何治疗，包括：(a)防止对象发生疾病或疾病症状，其中对象可能易发生该疾病或症状但尚未确诊(例如，可能与原发性疾病相关或由其引发的疾病；(b)抑制该疾病，即阻止其发展；和(c)缓解该疾病，即，使疾病消退。
疗法指治疗或改善或预防癌症成功的任何指标，包括任何客观或主观参数，例如症状的消除；缓解；减轻或使疾病状况对患者更耐受；减缓退化或衰退率；或减少退化晚期的衰弱。症状的治疗或改善可以基于客观或主观参数；包括医生的检查结果。因此，术语“治疗”包括施用本发明的化合物或药剂以预防或延迟，缓解，阻止或抑制与癌症或其他疾病相关的症状，或病症的发展。术语“治疗效果”是指疾病的减少，消除或预防疾病症状或疾病在受试者中的副作用。
本领域中鉴定为可用于治疗肿瘤疾病的治疗剂的例子包括但不限于阿比曲沙、阿霉素、阿霉素、阿霉素、氨苄青霉素、天冬酰胺酶、蒽环类、阿扎胞苷、硫唑嘌呤、bicnu、硫酸博来霉素、白消安、博来霉素、喜树碱、喜树碱、卡铂、卡莫司汀、盐酸佐柔比星、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、更生霉素、阿糖胞苷、赛德萨、环磷酰胺、环磷酰胺、放线菌素、多西紫杉醇、多柔比星、柔红霉素、表阿霉素、爱施巴、表柔比星、依托泊苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、氟达拉、吉西他滨、吉扎尔、美新、羟基脲、爱治、伊达霉素、伊达比星、异环磷酰胺、环磷酰胺、伊立替康、兰维斯、白细胞介素、亮抑素、甲基苄肼、氮芥、巯基嘌呤、甲氨蝶呤、丝裂霉素、米托蒽醌、光神霉素、密吐霉素、马勒兰、阿托胞苷、诺维本、喷司他丁、盐酸米托恩醌、长春碱、奥沙利铂、紫杉醇、伯尔定、脱氧助间型霉素、顺氯氨铂、普卡霉素、甲苄肼、乐疾宁、雷替曲塞、泰索帝、泰素、替尼泊甙、硫鸟嘌呤、雷替曲塞、拓扑替康、戊柔比星、长春花碱、凡毕士、长春碱、长春地辛、长春新碱、长春瑞滨、vp-16和足叶噻吩昔。
靶向治疗可能包括酪氨酸激酶抑制剂，如甲磺酸伊马替尼(gleevec，也称为sti-571)、吉非替尼(iressa，也称为zd1839)、厄洛替尼(市售tarceva)、索拉非尼(nexavar)、舒尼替尼(sutent)、达沙替尼(sprycel)、拉帕替尼(tykerb)、尼洛替尼(tasigna)和硼替佐米(velcade)，鲁索替尼(ruxolitinib)；janus激酶抑制剂，如托法替尼；alk抑制剂，如克唑替尼；bcl-2抑制剂，如甲磺酸盐，维奈妥拉和棉酚；flt3抑制剂，如米哚妥林(rydapt)，idh抑制剂，如ag-221，parp抑制剂，如iniparib和奥拉帕尼；pi3k抑制剂，如哌立福新；vegf受体2抑制剂，如阿帕替尼；与[d-lys(6)]-lhrh连接的an-152(aezs-108)多柔比星；braf抑制剂，如维罗非尼，达拉菲尼和lgx818；mek抑制剂，如曲美替尼；cdk抑制剂，如pd-0332991和lee011；hsp90抑制剂，如盐霉素；和/或小分子药物缀合物，如长春瑞滨；丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂，如替西罗莫司(torisel)、依维莫司(afinitor)、维罗非尼(zelboraf)、曲美替尼(mekinist)和达拉菲尼(tafinlar)。
本领域鉴定的用于治疗肿瘤疾病的生物制剂的实例包括但不限于细胞因子或细胞因子拮抗剂如il-12、infα或抗表皮生长因子受体、放射疗法、伊立替康；四氢叶酸抗代谢物如培美曲塞；抗肿瘤抗原的抗体、单克隆抗体和毒素、t细胞佐剂、骨髓移植或抗原呈递细胞(例如树突细胞疗法)，抗肿瘤疫苗、具有复制能力的病毒、信号转导抑制剂(例如，
肿瘤特异性单克隆抗体包括但不限于利妥昔单抗(市售mabthera或rituxan)、阿仑单抗、帕尼单抗、伊匹单抗(yervoy)等。
在一些实施例中，疗法包括免疫检查点治疗。免疫检查点疗法的实例包括pd1与pdl1和/或pdl2结合的抑制剂。pd1与pdl1和/或pdl2抑制剂在本领域中是众所周知的。干扰pd1与pdl1和/或pdl2结合的市售单克隆抗体的例子包括纳武单抗(
值得注意的是靶向治疗剂，其可以包括以商品名cabometyx和cometriq出售的卡博替尼，是用于治疗甲状腺髓样癌和肾细胞癌的二线治疗等的药物。它是酪氨酸激酶c-met和vegfr2的小分子抑制剂，也抑制axl和ret。阿西替尼是辉瑞公司开发的一种小分子酪氨酸激酶抑制剂。已经显示它在动物(异种移植)模型中显著抑制乳腺癌的生长，并且在肾细胞癌(rcc)和几种其他肿瘤类型的临床试验中显示出部分反应。曲美替尼是一种具有抗癌活性的mek抑制剂药物。它能抑制mek1和mek2。曲美替尼对携带brafv600e突变的转移性黑色素瘤具有良好的效果。rigosertib是一种小分子药物，据信它通过靶向ras效应通路来阻断细胞信号传导。
在某些实施例中，“联合”，“联合治疗”和“联合产品”是指在患者中同时施用第一治疗剂和本文所用化合物。当组合施用时，每种组分可以在不同时间点以任何顺序同时施用或按顺序施用。因此，每种组分可以分开施用，但施用时间须足够接近，以达到预期的治疗效果。
癌症治疗药物，免疫肿瘤剂，肿瘤定向抗体等与另一种药剂的“同时施用”意味着此时施用本发明的药物，抗体和组合物都将具有治疗效果。这种同时给药可能涉及本发明化合物的同时(即同一时间)、之前或随后给予药物或抗体。本领域普通技术人员将难以确定本发明的特定药物和组合物的适当给药时间，顺序和剂量。
本文所用的治疗终点将具有本领域已知的和食品和药物管理局使用的含义。
总生存期定义为从任意原因随机化到死亡的时间，并在意向治疗人群中测量。生存被认为是最可靠的癌症终点，当可以进行研究以充分评估生存时，其通常是首选终点。该终点精确且易于测量，以死亡日期记录。偏差不是终点测量的因素。生存改善应作为风险-效益分析进行分析，以评估临床获益。总生存率可以在随机对照研究中进行评估。如果毒性特征可接受，则总体存活率显著改善可被认为具有显著的临床意义，并且是支持新药批准的。本发明方法的益处包括增加患者的总体生存率。
基于肿瘤评估的终点包括dfs，orr，ttp，pfs和治疗失败时间(ttf)。时间依赖性终点数据的收集和分析是基于间接的评估，计算和估计(例如，肿瘤测量)。无病生存期(dfs)定义为从随机化到肿瘤复发或任何原因导致死亡的时间。该终点最常用于确定性手术或放疗后的辅助治疗。当大部分患者对化疗有完全缓解时，dfs也可能是一个重要的终点。
客观缓解率。orr定义为患者肿瘤大小减少预定量和最短时间段的患者比例。反应持续时间通常从初始反应时间开始测量，直至记录肿瘤进展。一般来说，食品及药物管理局将orr定义为部分缓解和完全缓解的总和。当以这种方式定义时，orr是药物抗肿瘤活性的直接量度，其可以在单臂研究中评估。
进展时间和无进展生存期。ttp和pfs是药物批准的主要终点。ttp定义为从随机化时间到客观肿瘤进展的时间；ttp不包括死亡。pfs定义为从随机化时间到客观肿瘤进展或死亡的时间。肿瘤进展的确切定义很重要，应在方案中详细说明。
本文所用术语“关联”或“与之关联”以及类似术语是指两个事件之间的统计关联，事件包括数字，数据集等。例如，当事件涉及数字时，正相关(在本文中也称为“直接相关”)意味着随着一个事件增加，另一个事件也增加。负相关(在本文中也称为“逆相关”)意味着随着一个事件增加，另一个事件减少。
“剂量单位”是指适合特定待治疗个体的单一剂量的物理离散单位。每个单位含有预定量的活性化合物，所述活性化合物经计算以产生与所需药物载体相关的治疗效果。剂量单位形式的规格受(a)活性化合物的特征和待实现的治疗效果，以及(b)本领域这种复合活性化合物的局限性影响。
“药学上可接受的赋形剂”是指可用于制备安全、无毒、预期的药物组合物的赋形剂，包括兽医用途以及人类药物用途可接受的赋形剂。这种赋形剂可以是固体，液体，半固体，或者在气溶胶组合物的情况下为气态。
“药学上可接受的盐和酯”是指药学上可接受并具有所需药理学性质的盐和酯。这些盐包括可以在化合物中存在的酸性质子，能够与无机或有机碱反应下形成的盐。合适的无机盐包括用碱金属形成的无机盐，例如钠、钾、镁、钙、铝。合适的有机盐由有机碱如胺碱形成，例如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、氨丁三醇、n-甲基葡糖胺等。此类盐还包括用无机酸(例如盐酸和氢溴酸)和有机酸(例如乙酸、柠檬酸、马来酸以及烷烃和芳烃磺酸如甲磺酸和苯磺酸)形成的酸加成盐。药学上可接受的酯包括由化合物中存在的羧基，磺酰氧基和磷酸氧基形成的酯，例如c1-6烷基酯。当存在两个酸性基团时，药学上可接受的盐或酯可以是单酸单盐或酯或二盐或酯；类似地，当存在两个以上酸性基团时，可以盐化或酯化一些或全部的这些基团。本发明中的化合物可以以未盐化或未酯化的形式或以盐化和/或酯化的形式存在，化合物的命名旨在包括原始(未酯化和未酯化)化合物及其药学上可接受的盐和酯。此外，本发明中某些化合物可以以多种立体异构形式存在，这些化合物的命名旨在包括所有单一立体异构体和这种立体异构体的所有混合物(包括外消旋或其他形式)。
术语“药学上可接受的”、“生理上可耐受的”及其语法变体是指组合物、载体、稀释剂和试剂可互换使用，这些材料可以施用于人，且不产生阻止组合物施用的不良生理效应。
“治疗有效量”是指治疗疾病时，施用于受试者且足以治疗该疾病的量。
方法
此方法用于分析，诊断和治疗或减少原发性或转移性癌症生长。通过检测细胞中存在的蛋白质的特定模式，包括不同亚型的模式，例如蛋白质的磷酸化形式，可以将癌细胞与正常对应组织区分开来。该蛋白质可以是调节细胞生长，复制，转移等的信号通路的组分。
可以通过确定癌细胞的表型来监测和/或选择用于治疗的个体。在一个实施例中，应用纳米流体蛋白质组学免疫测定(nia)来量化来自肿瘤的少量裂解物中的磷酸化亚型。
在一些实施例中，亚型的特定变化与对治疗剂的反应相关。通过在疾病早期阶段显示可能需要的治疗举措，评估反应性可以改善护理。在分析个体并发现对治疗有反应的情况下，可以继续治疗，患者可以在适当的反应后恢复。在对个体进行治疗并且发现无反应的情况下，施用替代疗法。
在一些实施例中，通过施用治疗剂量的药剂，例如癌症化学治疗剂来评估个体对治疗剂的反应性。在足以反应的一段时间之后，例如12小时、至少18小时、至少24小时、最多3周或更长时间、最多2周、最多10天、最多7天、最多5天、最多3天、最多48小时、最多24小时，获得活检样品。在分析之前，活检样品可冷冻并储存在-80℃。
然后通过nia分析样品中目的蛋白质亚型。可以将处理过的肿瘤细胞中的亚型分布模式与正常细胞，参考癌细胞等比较。在一些实施例中，获得相邻的组织样品，例如两个肿瘤样品，一个肿瘤样品和对应的正常组织等。在一些实施例中，获得肿瘤组织的时间序列，例如来自单个肿瘤的2个、3个、4个或更多样品。在一些实施例中，比较样品与参考样品，例如已知对治疗有反应的细胞的亚型模式。
随着时间的推移，可以从个体获得并分析多个样品，包括用接受治疗癌症方案的个体。也可以在患者组群中获得和分析多个样品，例如在临床试验的背景下。
在一些实施例中，通常用匹配的对照确定处理前和处理后匹配样品的亚型分布。已知疾病病例的样品可分为治疗后的时间间隔和逻辑回归分析，以确定亚型分布与哪个时间间隔最密切相关。
可以使用适当的nia方案从生物样品中产生蛋白质分布模式。读数可以是与测量相关的平均值、平均数、中值、方差或其他统计学或数学导出的值。通过直接比较相应的参考或控制模式，可以进一步细化读数信息。可以在多个点上评估的模式：确定数据矩阵中的任一点是否存在统计学上显著变化；亚型患病率是增加还是减少等等。绝对值将显示活生物系统固有的变异性。
从待测样品中获得蛋白质分布模式后，将其与参考或对照谱进行比较，以分析获得/衍生样品的患者的表型，例如个体是否对治疗有反应。通常，与上述样品或一组样品进行比较。另外，参考或对照签名模式可以是从已知有反应的样品处获得的签名模式，因此可以是阳性参考或对照概况。
在某些实施例中，将获得的蛋白质分布模式与单个参考/对照谱进行比较，以获得关于被测定患者的表型信息。在其他实例案中，将获得的蛋白质分布模式与两个或更多不同的参考/对照谱进行比较，以获得关于患者表型更深入的信息。例如，可以将获得的蛋白质分布模式与阳性和阴性参考谱进行比较，以确认患者是否具有目的表型。
算法可以在不同分类的个体之间对治疗的反应性进行强有力的区分，并控制混杂变量和评估潜在的相互作用，用于预后目的。
通过上述方法确定蛋白质分布模式。然后对由此获得的定量数据进行分析分类。这一过程中，根据算法操纵原始数据，其中算法已由数据训练集预先定义，如本文的示例所述。算法可以利用本文提供的数据训练集或者准则来生成具有不同数据集的算法。
分析分类过程可以使用任一统计分析方法来操纵定量数据并分类样品。有用方法实例包括线性判别分析、递归特征消除、微阵列的预测分析、逻辑回归、cart算法、flextree算法、lart算法、随机森林算法、mart算法、机器学习算法等。使用这些方法中的任何一种，可以使用蛋白质分布模式来生成预测模型。在这种模型的生成中，包括对照，患病，对治疗有反应或无反应等的数据集可以用作训练集。训练集将包含一个或多个目的亚型分布的数据。
可以根据预测建模方法进行分类，所述预测建模方法设定阈值以确定样本属于给定类别的概率，即响应性，非响应性等。概率优选为至少50％，或至少60％，或至少70％，或至少80％或更高。还可以通过确定获得的蛋白质分布模式和参考蛋白质分布模式之间的比较是否有统计学上显著差异来进行分类。如果这种比较与参考蛋白质分布模式在统计学上没有显著差异，则将从中获得蛋白质分布模式的样品归类参考蛋白质分布模式。
可以根据其特定值或值域(例如auc或准确度)来评估模型的预测能力。在一些实施例中，预期的质量阈值是预测模型，其将以至少约0.7，至少约0.75，至少约0.8，至少约0.85，至少约0.9，至少约0.95或更高的准确度来分类样品。作为替代测量，预期的质量阈值可以指至少约0.7，至少约0.75，至少约0.8，至少约0.85，至少约0.9或更高的auc(曲线下面积)来分类样品。
本领域已知，可以“调整”预测模型的相对灵敏度和特异性以支持选择性度量或灵敏度度量，其中两个度量具有反比关系。可以调整如上所述的模型中的限制以提供选定的灵敏度或特异性水平，这取决于所执行的测试的特定要求。灵敏度和特异性中的一项或两项可以是至少约0.7，至少约0.75，至少约0.8，至少约0.85，至少约0.9或更高。
原始数据最初可以通过测量每个标志的值来分析，通常是重复三次或多次重复三次。可以操纵数据，例如，使用标准曲线转换原始数据，以及使用三次重复测量的平均值来计算每个患者的平均值和标准偏差。这些值在用于模型之前可以转换，例如对数转换，box-cox转换(参见boxandcox(1964)j.royalstat.soc.,seriesb,26:211-–246)等。然后将数据输入到预测模型中，该模型将根据状态分类样品。所得信息可以传输给患者或卫生专业人员。
在一个实施例中，在预测模型的推导中执行分层聚类，其中pearson相关性被用作聚类度量。一种方法是在“监督学习”问题中将患者的蛋白质分布模式视为“学习样品”。cart是医学应用的标准((singer(1999)recursivepartitioninginthehealthsciences,springer)，可以通过将任何定性特征转换为定量特征进行修改；通过达到显著水平对其进行排序，通过hotellingt2统计的样本复用方法进行评估；并适当应用lasso算法。预测中的问题在不忽视预测的情况下变成回归问题，实际上是通过在评估回归质量时适当使用gini分类标准。
这种方法导致了flextree(huang(2004)pnas101:10529-10534)。flextree在仿真以及应用于snp和其他形式的数据时表现非常好。已经开发了软件自动化flextree。可以替代使用lartree或lart，参见turnbull(2005)classificationtreeswithsubsetanalysisselectionbythelasso,stanforduniversity。该名称反映了二叉树，如所述的cart和flextree，lasso算法，其通过efron等人(2004)annalsofstatistics32:407-451.命名。可参见huang等人(2004)tree-structuredsupervisedlearningandthegeneticsofhypertension.procnatlacadsciusa.101(29):10529-34.
可以使用的其他分析方法包括逻辑回归。一种逻辑回归的方法见ruczinski(2003)journalofcomputationalandgraphicalstatistics12:475-512.逻辑回归类似于cart，因为它的分类器可以显示为二进制树。不同之处在于，每个节点都有比cart生成的简单“and”语句更通用的特征的boolean语句。
另一种方法是最近的质心收缩法(tibshirani(2002)pnas99:6567-72)。该技术类似于k-means，但其优点是通过缩小集群中心，可以自动选择功能(如lasso算法中的功能)，以便将注意力集中在少数信息丰富的功能上。该方法可用作pam软件并被广泛使用。另外两组算法是随机森林(breiman(2001)machinelearning45:5-32)和mart(hastie(2001)theelementsofstatisticallearning，springer)。这两种方法已经是“委员会方法”因此，它们涉及对结果“投票”的预测因子。
为了排序显著性，可以确定错误发现率(fdr)。首先，生成一组相异值的零分布。在一个实施例中，对观察到的蛋白质分布模式的值进行置换以创建偶然获得的相关系数的分布序列，从而创建相关系数的适当零分布集(参见tusher等人。(2001)pnas98，5116-21，在此引用并入)。通过以下方式获得零分布集：排列所有可用蛋白质分布模式的每种蛋白质分布模式的值；计算所有蛋白质分布模式的成对相关系数；计算该排列的相关系数的概率密度函数；并重复该过程n次，其中n是大数目，通常为300。使用n分布，计算相关系数值计数的适当度量(平均值，中值等)，其值超过具有显著性的实验观察到的相似性分布获得的(相似)值。
fdr是预期的错误显著相关性的数量(估计大于从随机数据集中选择的pearson相关性)与经验数据中大于该选择的pearson相关性(显著相关性)数量的比率。该分界相关性值可以应用于实验蛋白质分布模式之间的相关性。
使用上述分布，选择一个置信水平以计算显著性。该方法用于确定相关系数的最低值，该值超过偶然获得的结果。使用这种方法，可以获得正相关，负相关或两者的阈值。使用该阈值，用户可以过滤成对相关系数的观察值并消除那些不超过阈值的值。此外，可以针对给定阈值估计假阳性率。对于每个单独的“随机相关”分布，可以找到观察值超出阈值范围的数量。此过程提供了一系列计数。序列的平均值和标准差提供了潜在假阳性的平均数及其标准差。
选择构建分类模型的信息亚型，可以利用性能度量的定义和用户定义的阈值来建立有预测能力的模型，以基于该度量预测对治疗的反应性。例如，性能指标可以是auc，预测的灵敏度和/或特异性以及预测模型的总体准确度。
还提供了用于分析的数据库和计算机系统。数据库通常可以包含来自各种条件的分布模式信息，例如细胞对各种处理的反应。结果及其数据库可以在各种介质中提供以便于其使用。
“介质”可以指包含分销模式信息的制造商；以及如上所述的分析方法。数据库和比较算法可以记录在计算机可读介质上，例如可以由计算机直接读取和访问的任何介质。这些介质包括但不限于：磁存储介质，例如软盘，硬盘存储介质和磁带；光存储介质，例如cd-rom；电存储介质，例如ram和rom；以及混合这些类别，如磁/光存储介质。本领域技术人员可以容易地理解如何使用任何目前已知的计算机可读介质来创建包括记录当前数据库信息的制造体。“记录”是指使用本领域已知的任何这样的方法将信息存储在计算机可读介质上的过程。基于用于访问存储信息的装置，可以选择任何合适的数据存储结构。可以使用各种数据处理器程序和格式来存储，例如文字处理文本文件，数据库格式等。
如本文所用，“基于计算机的系统”是指用于分析本文提供的信息的硬件装置，软件装置和数据存储装置。本发明的基于计算机的系统的最小硬件包括中央处理单元(cpu)、输入装置、输出装置和数据存储装置。本领域技术人员可以容易地理解，目前可用的任一计算机的系统都适合用于分析。数据存储装置可以包括如上所述记录本信息的任何制造商，或者可以访问这种制造商的存储器访问装置。
用于输入和输出装置的各种结构格式可用于本发明基于计算机的系统中输入和输出信息。这种情况为技术人员提供了相似性排序，并识别了包含在测试表达库中的相似程度。
数据分析可以在硬件或软件中，或者两者的组合中实现。在一个实施例中，提供了一种机器可读存储介质，该介质包括由机器可读数据编码的数据存储材料，当使用用所述数据的指令编程的机器时，该数据存储材料能够显示任何数据集和本发明的数据对比。这些数据可以用于多种目的，例如药物发现，细胞组分之间相互作用的分析等。在一些实施例中，分析在可编程计算机上执行的计算机程序，所述计算机程序包括处理器，数据存储系统(包括挥发性和非挥发性存储器和/或存储元件)，至少一个输入设备和至少一个输出设备。程序代码应用于输入数据以执行上述功能并生成输出信息。以已知方式将输出信息应用于一个或多个输出设备。计算机可以是例如常规设计的个人计算机，微型计算机或工作站。
每个程序都可以用高级程序或面向对象的编程语言实现，以便与计算机系统通信。但是，在需要的情况下，程序可以用汇编或机器语言实现。在任何情况下，该语言都可以是编译或解释型语言。每个这样的计算机程序可以存储在通用或专用可编程计算机可读的存储介质或设备(例如rom或磁盘)上，用于在计算机读取存储介质或设备以执行本文所述的程序时配置和操作计算机。该系统也是为配置有计算机程序的计算机可读存储介质，其中配置的存储介质导致计算机以特定和预定义的方式操作以执行本文所述的功能。
输入和输出装置的各种结构格式可用于在基于计算机的系统中输入和输出信息。用于输出的一种格式测试与可信库具有不同程度相似性的数据集。这种情况为技术人员提供了相似性排序，并识别了包含在测试曲目中的相似程度。
本文进一步提供了通过计算机存储和/或传输通过本文公开的方法收集的数据的方法。包括但不限于软件和存储设备的任何计算机或计算机附件可用于实施本发明。数据可以由用户直接或间接输入计算机。另外，可以用于执行或分析nia的任何设备都可以连接到计算机，使得能将数据传输到计算机和/或计算机兼容的存储设备。数据可以存储在计算机或合适的存储设备(例如cd)上。数据也可以通过本领域公知的方法(例如，互联网、地面邮件、航空邮件)从计算机发送到另一台计算机或数据收集点。因此，通过本文所述方法收集的数据可以在任何点或地理位置收集并发送到任何其他地理位置。
还提供了用于实施一种或多种上述方法的试剂及其试剂盒。受试者试剂及其试剂盒可能差异很大。目的试剂包括专门设计用于生产与癌细胞相关的上述蛋白质分布模式及其对治疗的反应性的试剂。
实验
提出以下示例是为了向本领域普通技术人员完整地公开并叙述构建及使用本发明的方法，并且无意限制本发明的范围。已经努力确保所使用数字(例如数量、温度、浓度等)的准确性，但是应该允许存在一些实验误差和偏差。除非另有说明，否则份数为重量份数，分子量为平均分子量，温度为摄氏度，压力指大气压或接近大气压。
示例1
标本储存时间和温度对erk磷酸化的影响
标本储存时间对erk磷酸化的影响。临床细针抽吸(fna)标本中erk磷酸化稳定性的一个重要问题是，fna采集和实验室中fna快速冷冻之间的时间间隔。我们将此间隔称为fna存储时间。另外，fna储存的温度可能影响erk磷酸化。为了解决这些问题，我们进行了基准测试，以验证肾癌患者fna中erk磷酸化的稳定性(见下文)。磷酸化和非磷酸化erk亚型的相对丰度非常稳定，这表明我们的测量结果并没有被fna处理方法显著改变，即使存储时间长达2天。
对于来自不同患者的三个fna，一部分fna在组织收集的同一天进行处理和快速冷冻，另一部分在4°℃下在培养基中储存并在收集后隔天或第二天进行处理。nia在两次重复实验中测量erk2磷酸化亚型的相对丰度。整个实验中，erk1几乎没有磷酸化，因此被排除在本分析之外。
总结:即使在冷培养基中储存fna2天后，erk2磷酸化亚型的相对丰度也几乎没有变化。
图1a和图1b显示了标本储存温度对erk磷酸化的影响。来自一个肿瘤的两个fna，在室温和冰上并排进行运输和加工(重悬，等分和离心)。通过nia在两次重复实验中测量erk2磷酸化亚型的相对丰度，并进行比较。整个实验中，erk1几乎没有磷酸化，因此被排除在本分析之外。
总结:erk2磷酸化亚型的相对丰度在收集后至少1小时内，在室温下与在冰上放置，其fna转运和加工之间几乎没有差异。
方法
组织采集和临床参数。对斯坦福大学癌症研究所泌尿肿瘤诊所的所有接受肾脏肿块根治性或部分肾切除术的患者进行筛查，并选择代表所有临床肿瘤分期(t1至t4)和细胞减灭性肾切除术的组织收集病例。给予知情同意的患者参加了斯坦福大学irb批准的研究方案，可以进行组织的采集，储存和分子分析。接受部分或根治性肾切除术的患者的肾肿瘤在肾脏手术摘除后立即在病理学家的帮助下进行双壳化。使用21号针头在10ml注射器上进行fna，其在温和的负压下通过组织20次。将fna收集到rpmi-1640培养基(gibco/thermofisherscientific，waltham，ma)中，离心，弃去上清液。如上所述，fna在室温或冰上运输。测试了不同的运输次数。批次分析前，将沉淀在液氮中快速冷冻并储存在-80°℃。
纳米免疫测定(nia)。将fna在含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂(proteinsimple，sanjose，ca)的bicine/chaps缓冲液中裂解，并使用等电聚焦在nanopro1000或peggysue仪器(proteinsimple)上的微流体毛细管中进行电荷分离，实验重复两次或三次。通过化学发光检测erk亚型，使用pan-erk抗体(emdmillipore，目录号06-182,hayward,ca)和hrp偶联的兔抗二抗(proteinsample)。在一系列曝光时间(30s至960s)内测量化学发光强度。
定量化学发光信号强度。用compass软件(proteinsimple)进行化学发光信号强度的定量。首先，确定在测定的动态范围内最佳信噪比的曝光时间，并使用基线拟合减去背景强度。然后，针对每个拟合峰计算毛细管上拟合的化学发光强度分布下的面积，并借助内部等电点(pi)标准品(proteinsimple)确定其pi。最后，根据pi分配峰值给特定的erk亚型。通过确定拟合峰面积的比率来确定erk2磷酸化亚型的相对丰度。fna运输和加工在室温和冰上等效
示例2.
如图3所示，从4名患有肾癌的患者获得相同人rcc肿瘤(t1和t2)和相邻肾组织(n)的两个区域的细针抽吸物，并提供样品之间谷氨酰胺酶水平的分布。电荷分离nia用于使用抗gls1抗体测量这些样品中谷氨酰胺酶1(gls1)的kga和gac亚型的水平。这证明了蛋白质亚型的nia分析参与了代谢。
如图4所示，nia可以测量来自冷冻样品的抗氧化蛋白过氧化物酶6(prdx6)亚型的分布。用抗prdx6抗体(abcam，目录号73350)分析每位患者的细胞。患者有egfr突变(mut)，野生型(wt)或未知的egfr状态(a，b，c，d)。
图5a-5i中显示了人碳酸酐酶9，人α-tublin(微管蛋白)的亚型分布一系列nia分析。一些条件下，在体外培养来自pdx小鼠的肿瘤组织切片，并用iqgap1ww结构域肽(ww)，杂乱肽(scr；ww的阴性对照)，曲美替尼(mek抑制剂)或载体(dmso；曲美替尼的阴性对照)处理2天，并测定对微管蛋白的作用。c中显示的是人细胞周期蛋白d1；d.人p21；e.人p27；f.人视网膜母细胞瘤蛋白(prb)；g.人受体酪氨酸激酶axl；h.人血管内皮生长因子受体2(vegfr2)；i.人pax8的分析。这些数据显示了nia对一系列不同蛋白质的适用性。
图6a显示了用卡博替尼(1μm)或dmso(阴性对照)处理癌细胞1天并在细胞裂解前用vegf或hgf(10ng/ml)刺激10分钟，定量癌细胞中erk1和erk2磷酸化亚型的相对丰度。图6b中显示了相同的数据，但是在没有最丰富的亚型的情况下调整了比例。这些数据显示特定的erk亚型在处理和未处理的样品之间具有特定的分布模式。
图7a中显示了来自癌症和对应的癌旁组织中未磷酸化，单磷酸化和多磷酸化akt2的akt2亚型的nia分析。图7b中鉴定出了不同电荷的mek2亚型，可能代表未磷酸化和磷酸化的mek2。图7c和7d显示了erk磷酸化谱，其在两种组织样品中相似，其中未磷酸化的erk2(erk2)和单磷酸化的erk2(perk2)是主要的erk亚型。图7e显示了放射治疗后不同电荷的多种prdx6亚型的分析，其特征在治疗前后不同。
图8a-8h中显示了来自作为异种移植物扩增，并用卡博替尼或载体(阴性对照)处理2天的淋巴瘤组织的nia分析。用抗pan-erk抗体，抗akt3抗体，特异于akt1的抗体探测组织蛋白裂解物，鉴定每种akt亚型的差异带电(可能磷酸化)亚型；抗p70s6k1抗体；抗磷酸s6抗体，鉴定三种不同电荷磷酸化s6蛋白的亚型。然后用卡博替尼、阿西替尼或载体(阴性对照)处理第二代pdx小鼠2天，然后通过nia电荷测定分离，并用抗pan-erk抗体探测。erk1和erk2的每种磷酸化亚型的相对丰度分别定量为总erk1或erk2的分数。将人淋巴瘤中erk1和erk2磷酸化亚型的定量erk测量值(“标准化区域”)作为患者衍生的异种移植物在小鼠中扩增，归一化到hsp70。
图9a-9g中，通过nia大小分离来自人肾癌组织的组织切片培养物(tscs)的蛋白质裂解物,检测作为患者衍生的异种移植物在小鼠中扩增的裂解parp-1(凋亡标志物)。在体外培养来自pdx小鼠的肿瘤组织切片，并用iqgap1ww结构域肽(ww)，杂乱肽(scr；ww的阴性对照)，曲美替尼(mek抑制剂)或载体(dmso；曲美替尼的阴性对照)处理2天。用抗裂解parp-1抗体探测组织蛋白裂解物。检测pcna，细胞周期蛋白d1，erk磷酸化亚型的检测，归一化至hsp70进行定量。
这些数据显示nia可用于测量体内或离体处理的人癌组织中的一组细胞凋亡和增殖标志物，以及信号传导蛋白亚型，以比较各个样品对目的药物的反应。曲美替尼降低细胞周期增殖(pcna)，不改变细胞凋亡(裂解parp-1)，而ww肽诱导细胞凋亡和增加细胞周期(pcna)。
如图10a和图10b所示，myc失活增加t-all4188细胞系中的perk1、pperk2和erk2水平。在burkittp493-6细胞系中，myc失活降低了erk1水平。
如图11所示，nia可用于测量药物靶点pdl1和vegfr2。
方法
纳米流体蛋白质组学免疫分析(nia)。nia实验使用peggysue仪器(proteinsimple，inc。)进行。根据制造商的说明，细胞或组织的蛋白质裂解物用25mmbicineph7.6/0.6％chaps裂解缓冲液(proteinsimple,inc.)制备，包括蛋白酶和磷酸酶抑制剂(水性抑制剂和dmso抑制剂，proteinsimple,inc.)。然后根据制造商的说明，将蛋白裂解物与已知等电点(电荷测定)或分子量(大小测定)(proteinsimple，inc.)的荧光标准品预混合，最终浓度为0.025-0.8mg/ml。简而言之，每个毛细管分析中，400纳升(用于电荷分离测定)或40纳升(用于大小分离测定)蛋白质裂解物荧光标准混合物(对应于8-24ng总蛋白质)自动加载到微毛细管中，并通过电荷或大小分离电泳。分离并在毛细管固定中光活化后，用抗体检测蛋白质，并通过化学发光显现。
nia峰面积定量。使用compass峰分析软件(proteinsimple，inc。)进行特定峰的定量。软件会自动选择拟合的峰和拟合的基线(用于背景扣除)，并在需要时手动确认和调整。通过确定每个拟合峰下的面积来量化信号强度。
nia伪印迹生成。通过将信号强度线性映射到灰度图像来创建伪印迹。每种伪印迹泳道代表单个毛细管，并且由与毛细管的该位置处存在的信号强度成比例对应的水平条带组成。没有信号是白色的，而增加的信号看到的则是增加的暗带。
人肿瘤样品。根据斯坦福大学irb批准的方案，从患者处获得组织，并从所有受试者获得知情同意。将组织样品和培养的细胞沉淀，在液氮中快速冷冻，并储存在-80℃。为了分析，在裂解前立即将样品在冰上解冻。
数据和统计分析。如前所述，使用具有可变宽度的高斯峰，使用compass(proteinsimple)进行nia多峰拟合和峰面积计算。为了获得r2相关系数，在excel(microsoft,inc.)中进行了线性拟合。
nia大小分离数据的标准化。nia数据的标准化是通过定量与上样对照/“管家”蛋白相同的裂解物中的微管蛋白信号，并将目标蛋白的测量峰面积除以微管蛋白的测量峰面积并以比率表示来进行的。在不同的实验中，使用标准化的裂解物对照来校准仪器和运行。
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