用于基因表达的纳米粒子和其用途的制作方法
相关申请案的交叉参考
本申请案要求2018年5月1日提交的美国临时专利申请案第62/665,280号的优先权，所述申请案全部内容通过全文引用的方式并入本文中。
本公开提供基于通过基因修饰的所选细胞类型在体内表达治疗蛋白的治疗方案。所述治疗方案可以另外利用细胞引诱剂将所选细胞类型引诱到治疗部位和/或所述治疗部位处之巨噬细胞活化方案。
背景技术：
许多新的医疗疗法涉及对患者的免疫系统的细胞进行基因修饰以对抗疾病或感染。举例来说，过继性t细胞疗法为有力的癌症疗法，其中t细胞是从患者收集并且经基因修饰以靶向并且杀死癌细胞。然而，针对每名患者制造经基因工程改造的t细胞产品，而非以标准化形式批量制备药物，涉及的复杂性和高成本使得难以胜过当前的一线疗法选项，如小分子药物或单克隆抗体。举例来说，用于过继性t细胞疗法的基因修饰t细胞通常需要：
(i)白细胞去除术，以从患者提取t细胞(即，患者通过两个静脉内管连接到单采血液成分机若干小时；这对于患者来说是不舒适的，引发相当大的成本，并且最终自身t疗法的大规模采用可能变得因为单采血液成分术能力的可用性而受到限制)；
(ii)t细胞的活化和基因修饰；
(iii)经基因修饰的t细胞在补充有细胞因子的组织培养基中在两周时间段内的扩增；
(iv)洗涤并且浓缩t细胞，随后投与(和对于在中心设施处制备并且输送到远程治疗中心的t细胞产品，冷冻保存)；以及
(v)对于经基因修饰的t细胞产品的每个配制批料的质量控制(qualitycontrol；qc)释放分析。
进一步增加制造经基因修饰的t细胞产品的成本和复杂性，所有这些程序必须在维持和运行昂贵的环境受控的良好生产规范(goodmanufacturingpractice；gmp)条件下进行。此外，因为每个经基因修饰的t细胞产品是由来自待治疗患者的起始物质(t细胞)制得，所以没有相当大的规模经济。
与许多经基因修饰的细胞类型相关联的另一缺点为细胞可在投与之后存留于患者中，有时导致非所要和/或残留副作用。因此，需要实现有效并且可扩展，但不太持久的疗法的机制。
技术实现要素：
本公开提供基于通过基因修饰的所选细胞类型在体内表达核酸和/或蛋白质(如治疗蛋白)的治疗方案。在一些实施例中，治疗蛋白的表达是短暂的，克服了降低残留副作用的可能性的问题。此外，治疗方案利用可以在体内实现所选细胞类型的基因修饰而无需过继性t细胞疗法(和类似治疗方案)所需的所有广泛细胞处理步骤的纳米粒子。
在特定实施例中，监测投与产生所选细胞类型的基因修饰以表达治疗蛋白的纳米粒子的个体的治疗蛋白表达水平。当表达低于阈值时，治疗医师可以确定是否应该投与后续剂量的纳米粒子以延长个体体内的治疗蛋白表达。可以重复此过程直到实现治疗目标，并且医师确定个体体内的治疗蛋白的持续表达将不提供有益临床目的。
在特定实施例中，本公开提供投与体内基因修饰所选细胞类型以表达核酸或蛋白质(如治疗蛋白)的纳米粒子5-10天。在特定实施例中，在体内暴露于所描述的纳米粒子之后，经纳米粒子程序化的细胞在其表面上瞬时表达治疗蛋白持续平均七天。
在特定实施例中，本公开提供利用细胞引诱剂将所选细胞类型引诱到身体内的治疗部位。在将所选细胞类型引诱到治疗部位之后，可以在治疗部位局部投与基因修饰所引诱的细胞类型以瞬时表达治疗蛋白的纳米粒子。在特定实施例中，在纳米粒子传递之前24小时在治疗部位处投与细胞引诱剂。
在特定实施例中，在纳米粒子的临床上相关的时间窗内向个体投与细胞引诱剂，以便将细胞募集到个体体内的所需部位。举例来说，将t细胞募集到肿瘤部位可以通过将t细胞引诱剂投与到肿瘤中或附近来实现。在t细胞引诱剂的临床上相关的时间窗内投与的纳米粒子治疗随后可以有益地靶向所引诱的t细胞以表达例如针对肿瘤的治疗蛋白。
特定实施例另外利用纳米粒子来再程序化所选细胞类型的活化状态。举例来说，特定实施例利用纳米粒子以在治疗部位处活化巨噬细胞。
本公开展示治疗方案提供针对例如淋巴瘤、前列腺癌、乙型肝炎病毒(hepatitisbvirus；hbv)诱发的肝细胞癌、卵巢癌、胶质母细胞瘤和肺癌的治疗上有效的治疗。
本文所描述的治疗方案导致使用负担得起的现成的试剂来治疗患有恶性疾病或感染的患者，其中克服关于残留副作用的问题。这类产品可在诊断当天并且在医疗必要时尽可能频繁地制得。
附图说明
本文中所提交的图式中的至少一个以彩色形式更好理解。申请人考虑一或多个图式的彩色版本作为原始提交的一部分并且保留在后续过程中呈现图式的彩色图像的权利。
图1：代表性实施例的图示。纳米粒子100包括围绕核的包衣105，所述核包括与一或多种聚合物120结合的一或多个乘客mrna核酸110。嵌入包衣105的外部中和/或与包衣105的外部相关联的是一种或多种细胞靶向配体140。纳米粒子100通过一或多种细胞靶向配体140与目标细胞160的表面上的一或多个分子150之间的相互作用特异性地靶向目标细胞160(如t细胞)。在纳米粒子的内含物释放到目标细胞160的细胞质中(例如通过受体诱导的内吞作用)后，翻译乘客mrna核酸(在细胞140内部展示为110')以表达蛋白质170，例如在目标细胞160的表面上。
图2：概述，说明用于使用由聚合纳米粒子携带的体外转录(invitrotranscribed；ivt)mrna原位再程序化t细胞以表达疾病特异性嵌合抗原受体(chimericantigenreceptors；car)或t细胞受体(tcellreceptor；tcr)的组合物和方法的实施例。这些纳米粒子涂布有将其靶向细胞毒性t细胞的配体，因此一旦其输注到患者的循环中，其将其携带的一或多种核酸转移到淋巴细胞中并且短暂地程序化所述一或多种核酸以在其表面上表达治疗蛋白(例如疾病特异性car、tcr或car/tcr杂合体)。
图3a、3b：额外实施例和传递模式的图示。使用靶向mrna纳米粒子将腹膜内(图3a)肿瘤相关的巨噬细胞(tumor-associatedmacrophage)和颅内(图3b)肿瘤相关的巨噬细胞基因上再程序化到杀肿瘤巨噬细胞中。图3a说明通过导管传递(通过导管输注)；图3b说明通过直接肿瘤注射传递(瘤内传递)。通过如此处所说明的经引导的局部输注的传递，患者可以免去全身毒性，因为由治疗诱发的炎症保持局限于治疗部位处。局部输注的粒子靶向肿瘤环境中的细胞，(2)传递核苷酸(如所说明)，所述核苷酸选择性地再程序化控制巨噬细胞极化的信号传导路径，和(3)通过生理学路径局部可降解。图3a和3b中所描绘的投与途径还可用于传递包括导致治疗蛋白(如car、tcr或杂合car/tcr)表达的核酸的纳米粒子。
图4a、4b：淋巴细胞编程纳米粒子的设计和制造。(图4a)代表性靶向t细胞的ivtmrna纳米粒子的示意图。为了产生可简单地通过接触来基因修饰原代t淋巴细胞(其对非病毒转染方法来说是非常难治的)的试剂，将聚合纳米粒子生物工程改造，其包括以下四个功能组分：
(i)表面锚定的靶向配体，其将纳米粒子选择性地结合到t细胞并且引发快速受体诱导的内吞作用以使其内化。在代表性实验中，使用抗cd8结合域；
(ii)负带电包衣，其通过减少纳米粒子的表面电荷来遮蔽所述纳米粒子以最小化偏离目标结合。聚谷氨酸(pga)用以在代表性实验中实现这一点；
(iii)载体基质，其在核酸在内体中时，冷凝并且保护所述核酸免于酶降解，但在将粒子转运到细胞质中时，释放所述核酸，从而使得能够转录经编码蛋白质。对于此表示，使用在水溶液条件中具有1与7小时之间的半衰期的生物可降解聚(β-氨基酯)(pbae)聚合物调配物；以及
(iv)核酸(例如，ivtmrna)，其囊封在载体内并且产生例如疾病特异性car或tcr的表达。
(图4b)描述如何制造纳米粒子的图式。冻干和水化步骤是任选的。
图5a-5j：使ivtmrna纳米粒子高效转染具有car编码的核酸或tcr编码的核酸的人类t细胞。经分离的人类cd8+t细胞用涂布有针对tcr/cd3的抗体和共刺激cd28受体的珠粒刺激。24小时后，去除珠粒并且将含有编码白血病特异性1928zcar(图5a-5e)或hb核18-27tcr(图5f-5j)的靶向cd8的np以3μgmrna/106个细胞的浓度混合到细胞悬浮液中。(图5a)在t细胞暴露于1928zcar纳米粒子之后，随时间推移相对于1928zcarmrna表达的qpcr测量结果。(图5b)在与携带1928zcar编码mrna的纳米粒子一起培育之后，在指定时间点处t细胞的流式细胞测量。(图5c)体外囊封的核酸转移效率的概述曲线图。(图5d)比较针对raji淋巴瘤细胞的纳米粒子相对于逆转录病毒转染的t细胞的体外分析。使用incucyte活细胞分析系统以定量随时间推移1928zcar转染的t细胞对rajinuclight红细胞的免疫细胞杀死。数据表示两个独立实验。每个点表示平均值±s.e.m.，从两个一式三份地进行的独立实验汇集。(图5e)由经转染的细胞分泌的il-2(在24小时处)和tnf-α以及ifn-γ(在48小时处)的elisa测量结果。(图5f)在t细胞暴露于hb核18-27tcr纳米粒子之后，随时间推移相对于hb核18-27tcrmrna表达的qpcr测量结果。(图5g、5h)囊封的核酸转移效率，(图5i)随时间推移经hb核18-27tcr转染的t细胞对hepg2-核nuclight红细胞的细胞杀死，(图5j)由经转染的细胞分泌的细胞因子的elisa测量结果。
图6a-6e：经纳米粒子程序化的car淋巴细胞引起具有与过继性t细胞疗法类似的功效的白血病消退。(图6a)时间线和纳米粒子给药方案。(图6b)将萤火虫荧光素酶表达的raji淋巴瘤细胞系统地注射到nsg小鼠中的连续生物成像。展示来自每个群组(n＝10)的五只代表性小鼠。(图6c)在疗法之后动物的存活率，描绘为卡普兰-迈耶(kaplan-meier)曲线。展示从三个独立实验汇集的十只小鼠/处理组。ms，中值存活期。使用对数秩测试进行经处理实验与未经处理对照组之间的统计分析；p<0.05视为显著的。(图6d)在注射传递编码1928zcar的ivtmrna的纳米粒子之前和之后周围t细胞的流式细胞测量。此处展示的每个时间点的三个分布表示由每组十只小鼠组成的两个独立实验。(图6e)概述图，其显示在重复输注1928zcar纳米粒子之后经car转染的cd8+t细胞的百分比。每条线表示一只动物。展示从两个独立实验汇集的十只动物。
图7a-7g：编码前列腺肿瘤特异性car的ivt-mrna纳米粒子改进具有现有疾病的小鼠的存活率。(图7a)跨越展示抗原表达的多样性的140个前列腺癌转移组的psca、psma和ror1抗原表达的热图。(图7b)流式细胞测量数据的热图表示，其展示由lncapc42前列腺癌细胞表达的psca、psma和ror1的变异性。颜色指示350个随机选择的细胞中的表达水平。(图7c)植入后3周，由体内生物发光成像观测到lncapc42前列腺肿瘤。右侧展示前列腺的背叶(白色箭头)中的现有肿瘤的代表性照片。(图7d)将萤火虫荧光素酶表达lncapc42前列腺癌细胞原位移植到ngs小鼠的前列腺中的连续生物成像。展示来自每个群组(n＝8)的四只代表性小鼠。(图7e)时间线和纳米粒子给药方案。(图7f)在疗法之后动物的存活率，描绘为卡普兰-迈耶曲线。展示从三个独立实验汇集的八只小鼠/处理组。ms，中值存活期。使用对数秩测试进行经处理实验与未经处理对照组之间的统计分析；p<0.05视为显著的。n.s.，不显著。(图7g)在car-t细胞疗法或ror14-1bbzcarnp疗法之后，在lncapc42前列腺肿瘤细胞上表达ror1抗原的流式细胞测量定量。展示从5个肿瘤汇集的350个随机选择的细胞。
图8：实例2中所描述的用于骨髓和淋巴免疫表型组中的抗体的清单。
图9a-9k：携带编码irf5和ikkβ的mrna的纳米粒子可以影响促炎性m1样表型。(图9a)用编码巨噬细胞极化的关键调节因子的mrna调配的靶向巨噬细胞的聚合np的设计。粒子是由涂布有一层pga-二-甘露糖的pbae-mrna聚合复合体核组成，所述pbae-mrna聚合复合体核将粒子靶向到由m2样巨噬细胞表达的甘露糖受体(cd206)。还描绘了囊封在np中的合成mrna，其经工程改造以编码再程序化转录因子。(图9b)np群(比例尺200nm)和单一np(插图，比例尺50nm)的透射电子显微镜术。(图9c)使用nanosightns300仪器测量的np的大小分布。(图9d)在1小时暴露之后np展现骨髓源性巨噬细胞(bonemarrow-derivedmacrophage；bmdm)的高度转染(46％)。(图9e)在纳米粒子转染24小时之后，由流式细胞测量术测量的到骨髓衍生巨噬细胞(bmdm)的基因转移效率。(图9f)经np转染和未经转染的巨噬细胞的相对活力(由用膜联蛋白v(annexinv)和pi染色来评估)。n.s.；不显著。(图9g)通过qrt-pcr测量的经密码子优化的irf5mrna(蓝色，左y轴)和内源性irf5mrna(黑色，右y轴)的表达动力学，对于每个时间点n＝3。(图9h)描绘用于图9i-9k中所使用的bmdm的np转染方案和培养条件的时间线。(图9i)与用toll样受体6促效剂mpla刺激的标签m1细胞相比，经irf5/ikkβnp转染的巨噬细胞的基因表达谱。结果描绘为展示基因表达中的倍数变化的分布的火山图(volcanoplot)。指示m1标签基因。通过gsea确定经irf5/ikkβnp转染的巨噬细胞与m1标签基因组之间的重叠的p值。(图9j)在il-4中培养的巨噬细胞中相对于在il-4培养并且用irf5/ikkβnp转染的细胞中m1标签基因表达的热图。(图9k)展示指示基因和s.e.m的平均计数的盒形图。
图10a-10j：将传递irf5和ikkβ基因的mrna纳米载体重复腹膜内注射到巨噬细胞中，使患有播散性卵巢癌的小鼠的平均值生存率增加一倍以上。(图10a)时间线和给药方案。箭头指示腹膜内注射的时间。(图10b)对照和经处理小鼠中肿瘤生长的连续生物发光成像。(图10c)经处理小鼠相对于对照小鼠的卡普兰-迈耶存活率曲线。使用对数秩测试进行统计分析。(图10d)作为对照的单次腹膜内剂量的携带gfpmrna的涂布有d-甘露糖的np之后48小时，不同免疫细胞亚群中的体内转染速率的流式细胞测量术定量：测量巨噬细胞(cd45+、cd11b+、mhcii+、cd11c、ly6c-/低、ly6g-)、单核细胞(cd45+、cd11b+、mhcii+、cd11c-、ly6c+、ly6g-)、嗜中性粒细胞(cd45+、cd11b+、mhcii+、cd11c-、ly6g+)、cd4+t细胞(cd45+、tcr-β链+、cd4+、cd8)、cd8+t细胞(cd45+、tcr-β链+、cd4-、cd8+)和自然杀手(naturalkiller；nk)细胞(cd45+、tcr-β链、d49b+)。(图10e)患有播散性id8卵巢癌的小鼠腹膜中的巨噬细胞表型的流式细胞测量分析。用4次剂量的irf5/ikkβnp或pbs处理动物。(图10f)概述ly6c-、f4/80+和cd206+(m2样)巨噬细胞的相对百分比(左图)和绝对数目(右图)。(图10g)ly6c-、f4/80+和cd206-(m1样)巨噬细胞的对应数目。(图10h)从pbs对照(顶部图)或经irf5/ikkβnp处理的动物(底部图；比例尺100μm)分离的卵巢瘤浸润的系膜的代表性苏木精和曙红染色的切片。代表性恶性病变的10倍放大展示在右侧(比例尺50μm)。(图10i)测量由来自每个治疗组的经分离腹膜巨噬细胞产生的细胞因子的路明克斯(luminex)分析。通过荧光激活细胞分选来分离和离体培养cd11b+、f4/80+腹膜巨噬细胞。24小时后，收集细胞培养物上清液。在平行实验中，通过prt-pcr直接分析facs分选的cd11b+、f4/80+腹膜巨噬细胞以确定巨噬细胞表型的四种主调节因子(serpinb2、retnla、ccl11和ccl5)的表达水平。结果概述为图10j中的盒形图。
图11a-11f：巨噬细胞程序化mrna纳米载体对于重复给药是高度生物相容和安全的。(图11a)在腹膜内投与之后，靶向巨噬细胞的irf5/ikkβnp的体内生物分布。在单次注射含有50μgmrna的粒子之后24小时，通过qpcr检测np传递(密码子优化)的mrna。(图11b)实验时间线的示意性表示。*最后一次剂量后二十四小时，小鼠通过co2吸入来安乐死。通过眼眶后出血将血液收集到经肝素涂布的管中用于血清化学分析和全血细胞计数。进行尸体解剖以对肝、脾、胰腺、系膜和网膜、胃和膀胱进行组织学分析。(图11c)从对照动物或经np处理的动物分离的各种器官的代表性苏木精和曙红染色切片。比例尺，100μm。基于比较病理学家的分析，此处展示和描述在经np处理的动物中发现的病变。对于每个经编号图像的相关发现为：[1]大部分由与少量粒细胞掺合的单核细胞构成的细胞浸润的离散病灶；轻度骨髓外造血。[2]在少数局部广泛区域中，肝细胞轻度到中度肿胀。[3]红髓内中度髓系(主导)、红系和巨核细胞增生。[4]白髓的轻度细胞缺乏。[5]在系膜内，存在巨噬细胞、淋巴细胞、血浆细胞和粒细胞的中度多灶性浸润。[6]与淋巴细胞、血浆细胞和粒细胞掺合的巨噬细胞的轻度到中度浸润；腺泡轻度解离和腺泡损耗；来自腺泡细胞的酶原颗粒的轻度弥漫性损耗。[7]与脂肪组织周围的巨噬细胞掺合的淋巴细胞的致密聚集体。[8]胃粘膜内的主细胞和壁细胞的轻度多灶性空泡变性。(图11d)血清化学分析和血液计数。(图11e、11f)在单次腹膜内注射irf5/ikkβnp之后4天或8天，血清il-6(图11e)和tnf-α(图11f)细胞因子的路明克斯分析测量结果。
图12a-12i：静脉内输注的irf5/ikkβ纳米粒子可以控制肺中的肿瘤转移。(图12a)在静脉内投与之后，靶向巨噬细胞的irf5/ikkβnp的体内生物分布。在单次静脉内注射含有50μgmrna的粒子24小时之后，通过qpcr测量经密码子优化的mrna。(图12b-12h)c57bl/6白化病小鼠通过尾静脉注射1×106个b16f10荧光表达黑素瘤细胞以确立肺癌转移。7天后，将动物随机分配到irf5/ikkβnp处理组、对照gfpnp组或pbs对照组。(图12b)时间线和给药方案。(图12c)健康肺(左图)和b16f10肿瘤浸润性肺(右图)的共聚焦显微术。浸润巨噬细胞群发绿色荧光。(图12d)连续生物发光肿瘤成像。(图12e)每个处理组的卡普兰-迈耶存活率曲线。ms指示中值存活期。使用对数秩测试进行统计分析，并且p<0.05视为显著的。(图12f)含有b16f10黑素瘤癌转移的肺的代表性相片(顶行)和显微图，表示处理2周之后的每一组。(图12g)肺肿瘤病灶的计数。(图12h)来自每个处理组的支气管肺泡灌洗液中的单核细胞/巨噬细胞群的表型特征。(图12i)抑制和活化巨噬细胞的相对百分比的概述。
图13a-13f：巨噬细胞再程序化改进胶质瘤放疗的结果。(图13a)在诱发后第21天，rcas-pdgf-b/巢蛋白-tv-a；ink4a/arf-/-；pten-/-转基因小鼠中的pdgfβ驱动的胶质瘤引发之后，进行t2mri扫描和组织学染色。(图13b)cd68+tam浸润胶质瘤边缘的共聚焦显微术。比例尺300μm。(图13c)健康脑部组织相对于胶质瘤中的巨噬细胞(f4/80+，cd11b+)的流式细胞测量分析。(图13d、13e)接受irf5/ikkβ处理作为单一疗法(图13d)或与脑瘤放疗组合(图13e)的患有现有胶质瘤的小鼠的卡普兰-迈耶存活率曲线。时间线和给药方案在顶部示出。ms，中值存活期。使用对数秩测试进行统计分析，并且p<0.05视为统计学上显著的。(图13f)肿瘤进展的连续生物发光成像。
图14a-14e：编码人类irf5/ikkβ的携带ivtmrna的纳米粒子高效地再程序化人类巨噬细胞。(图14a)将人类thp-1单核细胞系分化为抑制性m2样巨噬细胞的时间线和培养条件。(图14b)在24个孔中培养并且用指定浓度的携带人类irf5/ikkβmrna的np转染的m2分化的thp1-lucia细胞相对于对照gfpmrna的生物发光成像。在转染之后24小时使用quanti-luc测定irf诱导的lucia荧光素酶的含量。(图14c)生物发光计数的概述。(图14d、14e)il-1β细胞因子的差异(图14d)和m1巨噬细胞标记cd80的表面表达(图14e)。
图15.示例性支持序列：seqidno:1：抗人类1928zcar；seqidno:2：抗人类ror1car；seqidno:3：hbv特异性tcr；seqidno:4：抗人类1928zcar；seqidno:5：抗人类ror1(4-1bbz)car；seqidno:6：抗hbv特异性tcr(hb核18-27)；seqidno:7：抗cd19scfv(vh-vl)fmc63；seqidno:8：抗cd19scfv(vh-vl)fmc63；seqidno:9：cd28效应子域；seqidno:10：p28zcar；seqidno:11：igg4-fc；seqidno:12：铰链-ch2-ch3；seqidno:13：铰链-ch3；seqidno:14：仅铰链；seqidno:15：cd28跨膜域；seqidno:16：cd28细胞质域(ll变为gg)；seqidno:17：4-1bb细胞质域；seqidno:18：cd3-ζ细胞质域；seqidno:19：t2a；seqidno:20：tegfr；seqidno:21：strep标签ii；seqidno:22：myc标签；seqidno:23：v5标签；seqidno:24：flag标签；seqidno:25：人类irf5同工型1(uniprot登录号q13568-1)；seqidno:26：人类irf5同工型2(uniprot登录号q13568-2)；seqidno:27：人类irf5同工型3(uniprot登录号q13568-3)；seqidno:28：人类irf5同工型4(uniprot登录号q13568-4)；seqidno:29：人类irf5同工型5(uniprot登录号q13568-5)；seqidno:30：人类irf5同工型6(uniprot登录号q13568-6)；seqidno:31：鼠类irf5蛋白(pi＝5.19，mw＝56005，uniprot登录号p56477)；seqidno:32：人类irf1(uniprot登录号p10914)；seqidno:33：人类irf3同工型1(uniprot登录号q14653-1)；seqidno:34：人类irf7同工型a(uniprot登录号q92985-1)；seqidno:35：人类irf8(uniprot登录号q02556)；seqidno:36：鼠类irf1(uniprot登录号p15314)；seqidno:37：鼠类irf3(uniprot登录号p70671)；seqidno:38：鼠类irf7(uniprot登录号p70434)；seqidno:39：鼠类irf7/irf35(d)蛋白(pi＝4.72，mw＝58456)；seqidno:40：鼠类irf8(uniprot登录号p23611)；seqidno:41：鼠类irf8(k310r)蛋白(pi＝6.38，mw＝48265)；seqidno:42：人类ikkβ同工型1(uniprot登录号o14920-1)；seqidno:43：人类ikkβ同工型2(uniprot登录号o14920-2)；seqidno:44：人类ikkβ同工型3(uniprot登录号o14920-3)；seqidno:45：人类ikkβ同工型4(uniprot登录号o14920-4)；seqidno:46：鼠类ikkβ蛋白(pi＝6.20，mw＝84387.61，genbank登录号np_034676.1)；seqidno:47：人类irf5同工型1cds；seqidno:48：人类irf5同工型2cds；seqidno:49：人类irf5同工型3cds(genbank登录号u51127)；seqidno:50：人类irf5同工型4cds(genbank登录号ay504946或ay504947)；seqidno:51：人类irf5同工型5cds；seqidno:52：人类irf5同工型6cds；seqidno:53：鼠类if5cds(1494nt)；seqidno:54：人类irf1cds；seqidno:55：人类irf3同工型1cds(nm_001571.5)；seqidno:56：人类irf7同工型acds(nm_001572.3)；seqidno:57：人类irf8cds；seqidno:58：鼠类irf1cds(nm_001159396.1)；seqidno:59：鼠类irf3cds(nm_016849.4)；seqidno:60：鼠类irf7cds(nm_016850.3)；seqidno:61：鼠类irf-7/irf-35(d)cds(1578nt)；seqidno:62：鼠类irf8cds；seqidno:63：鼠类irf8k310rcds(1275nt)；seqidno:64：人类ikkβ同工型1cds；seqidno:65：人类ikkβ同工型2cds；seqidno:66：人类ikkβ同工型3cds；seqidno:67：人类ikkβ同工型4cds；seqidno:68：鼠类ikkβcds(2217nt)。
具体实施方式
成功的基因疗法取决于成功的基因传递机制到所关注的所选细胞中。
本公开提供组合物和快速且选择性地修饰细胞以通过提供平均持续七天的一或多种核酸的表达来实现治疗目标的方法。在一些情况下，产生核酸或蛋白质的瞬时表达。瞬时表达任选地可以通过组合物的一或多个重复应用来延伸，因此提供可以重叠或不可以重叠的重复(连续)表达时间段。因为仅需要瞬时表达来实现一或多个所要治疗效果，所以克服关于进行中的副作用和/或随时间推移减少的治疗蛋白表达的问题。
在一些实施例中，本文所公开的组合物和方法展现与通过过继性细胞疗法投与的离体转导细胞一样大或更大的体内治疗效果。有利的是，在向个体投与纳米粒子之后，本公开的组合物和方法实现体内t细胞的至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％表达治疗蛋白；引起个体的癌症的至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％或至少70％根除；引起复发个体的存活率提高平均至少10天、至少15天、至少20天、至少25天、至少30天、至少35天或至少37天；产生与离体接触纳米粒子的t细胞的移植至少约相同的功效；和/或产生与离体转导的car+t细胞的移植至少约相同的功效。
本文特别考虑是包括将纳米粒子组合物重复传递到患者的实施例，其中纳米粒子靶向患者体内所选细胞并且通过所选细胞产生治疗蛋白的瞬时表达。在特定实施例中，每5-10天(例如，每7天)进行重复传递。
定义
如本文所用，“纳米粒子”和“纳米载体”可以互换地使用，并且通常是指用于传输另一物质(称为“货物”，如蛋白质、多核苷酸或药物)的模块。常用纳米载体包括胶束、聚合物、基于碳的材料、脂质体和其它物质。本公开的纳米载体大体上包括至少带正电载体基质和中性或带负电包衣。包衣在载体基质的外表面上，任选地具有或不具有插入中间层。货物通常是编码治疗蛋白(例如，嵌合抗原受体(car)、t细胞受体(tcr)、car/tcr杂合体、细胞受体、转录因子、巨噬细胞活化因子或信号传导分子，或编码治疗性多核苷酸(例如，mrna、shrna、grna或sgrna)的多核苷酸。
如本文所用，纳米载体的“包衣”是指纳米载体的最外层，但细胞靶向配体可能遮蔽包衣的一部分。包衣可以包括中性或带负电包衣，如带负电的聚谷氨酸(pga)、聚(丙烯酸)、海藻酸或胆固醇基半琥珀酸酯/1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺或带中性电荷的两性离子聚合物。
如本文所用，“载体基质”是指将货物介导并入纳米载体中的纳米载体的成分，不包括包衣和任何中间层。一般来说，当货物是多核苷酸时，载体基质是带正电的载体基质，其适用于将多核苷酸并入载剂中，因为多核苷酸是带负电的。脂质或聚合物可以是带正电的聚(β-氨基酯)、聚(l-赖氨酸)、聚(乙烯亚胺)(pei)、聚(酰氨基胺)树枝状聚合物(pama)、聚(胺-共聚-酯)、聚(甲基丙烯酸二甲氨基乙酯)(pdmaema)、壳聚糖、聚(l-丙交酯-共聚-l-赖氨酸)、聚[α-(4-氨基丁基)-l-乙醇酸](paga)或聚(4-羟基-l-脯氨酸酯)(php)；前述的组合；或同等物。
如本文所用，“包衣表面延伸”意谓配体直接或间接附着到包衣，并且从包衣延伸足够远距离以准许配体与其目标的相互作用。可以通过化学偶合、通过将脂质结合成分并入配体中(例如，配体的基因融合到蛋白质的跨膜域)、通过电荷间相互作用或通过其它方式来实现附着。
如本文所用，“所选细胞”是指由纳米载体的制造商或使用者选择作为纳米载体组合物的目标的细胞或细胞类型。举例来说，所选细胞可以是免疫细胞，如t细胞、b细胞或nk细胞。所选细胞还可以是前述的亚群，如cd4+t细胞、cd8+t细胞或t调节细胞。所选细胞可以是前述的其它亚群，如在一些实施例中，多个靶向配体用于实现靶向由多个细胞标记区分的细胞。
如本文所用，“疾病特异性受体”是指特异性结合到与疾病的病原体相关或指示疾病的生物分子的蛋白质。举例来说，癌症的疾病特异性受体将包括标记癌细胞并且将其与非癌细胞区分(例如通过癌细胞上的过度表达)的蛋白质。感染性疾病的疾病特异性受体可以包括例如直接特异性结合到感染原的受体或特异性结合到感染细胞表面上所显示的生物分子的受体(例如，肽-mhc复合物，其中肽是感染原特异性肽)。
如本文所用，“选择性并入”意谓纳米载体以比纳米载体并入其它细胞中的更高速率或更大的最大并入量并入所选细胞中。“选择性并入”可以意谓以并入除所选细胞外的细胞2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、100倍、1,000倍或更大倍数快速或高效地并入所选细胞中。
如本文所用，“选择性结合”意谓以结合到参考分子的至少2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、100倍、1,000倍或更大倍数的亲和力结合到目标。
如本文所用，“表达治疗蛋白”意谓使所选细胞与纳米载体接触或向个体投与纳米载体，所选细胞以通过常规方法可检测的量表达治疗蛋白，如凝胶电泳、质谱法、荧光显微法、流式细胞测量术和/或蛋白质印迹法(westernblotting)。在治疗蛋白由所选细胞内源性表达的情况下，“表达治疗蛋白”意谓接触或投与步骤引起所选细胞中治疗蛋白的表达增加至少5％、10％、15％、20％或更大。
如本文所用，“hbv诱发的肝细胞癌”是指已知已由hbv引起的肝细胞癌，或医学专业人员使用合理的判断将理解为已由hbv引起的肝细胞癌。
如本文所用，癌症的“根除”是指完整反应(cr)。
如本文所用，“个体”或“患者”可以互换地使用。“个体”包括任何哺乳动物。哺乳动物可以是例如人类或适当的非人类哺乳动物，例如灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、牛、马、山羊、骆驼、绵羊或猪。个体还可以是鸟或家禽。优选地，个体是人类。个体可以是雄性或雌性。有需要的个体可以是先前未被诊断或识别为患有例如自身免疫疾病、感染性疾病、癌症或癌前病状的病状的个体。有需要的个体可以是先前已被诊断或识别为患有癌症或癌前病状的个体。有需要的个体还可以是患有(罹患)例如自身免疫疾病、感染性疾病、癌症或癌前病状的病状的个体。或者，有需要的个体可以是相对于大多数群体，具有产生这类病症的风险的个体(即，相对于大多数群体，倾向于产生这类病症的个体)。
任选地，有需要的个体已经经历、正在经历或即将经历病状的至少一种治疗性干预。
在最近疗法中，有需要的个体可以患有难治性病状，例如难治性癌症。“难治性癌症”意谓对先前投与的治疗不起反应的癌症。所述癌症可能在治疗开始时有抗性或其可能在治疗期间变得有抗性。难治性癌症也称为抗性癌症。在一些实施例中，有需要的个体在基于最新疗法缓解之后具有癌症复发。在一些实施例中，有需要的个体接受了所有已知用于癌症治疗的有效疗法并且都失败了。在一些实施例中，有需要的个体接受了至少一种先前疗法。
如本文所用，“复发个体”是指已经在先前治疗之后展现cr、部分反应(pr)、缓解或长期缓解，随后再出现癌症的个体。
如本文所用，“离体”是指针对个体或供体的身体外部的细胞的方法。
如本文所用，“体内”是指针对个体身体中的细胞的方法。
如本文所用，“体外”是指针对培养物中生长的细胞而非原代细胞的方法。
如本文所用，“细胞靶向配体”或“所选细胞靶向配体”可互换地使用，并且是指选择性结合所选细胞(例如，通过所选细胞表面上的标记蛋白质)的生物分子(例如，蛋白质或多核苷酸)。一般来说，细胞靶向配体选择性地将纳米载体靶向体内所选细胞。示例性细胞靶向配体包括抗体片段，如单链可变片段(scfv)；经工程改造的配体，如经合理工程改造的结合剂；小分子配体或适配体。
实施例
在特定实施例中，瞬时表达是表达12小时到15天；18小时到12天；20小时到14天；24小时到10天、24小时到8天或30小时到7天。特别考虑的是在各种实施例中瞬时表达不长于14天。举例来说，在特定实施例中，瞬时表达是持续不长于12天、不长于10天、不长于9天、不长于8天或不长于7天的可检测表达。在需要较长表达的实施例中，提供治疗蛋白的瞬时表达的纳米粒子可以以重复剂量传递到个体，例如每5-10天(例如，每7天)进行传递。
在特定实施例中，可以监测个体治疗蛋白的表达，并且当表达低于阈值时，治疗医师可以确定是否有必要需要额外纳米粒子来产生治疗蛋白的额外表达。
在特定实施例中，纳米粒子的传递可以是静脉内或在所选解剖部位(例如肿瘤部位)处、到所选解剖部位或接近所选解剖部位。
在特定实施例中，纳米粒子的传递可以与治疗部位处的细胞引诱剂的使用协调。举例来说，个体可以投与将细胞类型引诱到解剖部位的药剂。在特定实施例中，所引诱的细胞类型可以与靶向基因修饰以表达核酸或蛋白质(如治疗蛋白)的细胞类型相同的细胞类型。举例来说，如果解剖部位是肿瘤部位，那么可能有益的是将t细胞引诱到肿瘤部位，并且随后修饰所引诱的t细胞以表达核酸或蛋白质，如治疗蛋白，如嵌合抗原受体(car)、t细胞受体(tcr)或car/tcr杂合体。在特定实施例中，所引诱的细胞类型可以是与靶向基因修饰以表达核酸或蛋白质(如治疗蛋白)的细胞类型不同的细胞类型。举例来说，如果解剖部位是肿瘤部位，那么可能有益的是将细胞引诱到肿瘤部位，所述肿瘤部位支持经修饰以瞬时表达治疗蛋白的所选细胞的活性。支持t细胞活性的细胞可以包括t细胞(例如，t辅助细胞)、自然杀手(nk)细胞和巨噬细胞的亚群。在特定实施例中，将超过一种细胞类型引诱到解剖部位可以是有益的。在特定实施例中，细胞可以在传递纳米粒子(例如，“预处理”)之前被引诱到解剖部位。
在特定实施例中，本文所描述的治疗方案还可以包括治疗部位处的活化巨噬细胞。举例来说，治疗部位处的活化巨噬细胞可以克服所治疗个体的一或多个巨噬细胞的肿瘤抑制。
在特定实施例中，用于体内基因修饰所选细胞类型以表达核酸或蛋白质(如治疗蛋白)的纳米粒子包括(1)所选细胞靶向配体；(2)带正电载体；(3)带正电载体内的核酸；以及(4)中性或带负电包衣。
当将所公开的纳米粒子添加到细胞的非均质混合物(例如体内环境)中时，经工程改造的纳米粒子结合到所选细胞群并且刺激受体介导的内吞作用；这个过程提供其携带的核酸(例如，合成mrna)的输入，并且因此所选细胞开始表达经编码分子(图1-3b)。因为当使用mrna而非dna时不需要转基因的核转运和转录，所以这个过程在一些情况下是快速并且高效的。如果需要，可以进行纳米粒子的额外应用直到实现所要结果为止。在特定实施例中，纳米粒子是生物可降解和生物相容的。
在特定实施例中，快速意谓经编码核酸的表达在细胞的非均质样品暴露于本文所公开的纳米粒子的24小时内或12小时内的所选细胞类型内开始。这个时间线可能利用核酸，如mrna，其几乎立即(例如，在几分钟内)开始转录以释放到目标细胞细胞质中。
在特定实施例中，高效意谓囊封核酸转移到靶向细胞(例如，原代人类t细胞)中>80％并且表型修饰发生于这些细胞中的至少80％、这些细胞中的至少90％或这些细胞中的100％中。在特定实施例中，高效意谓囊封核酸转移到靶向细胞中>80％且表型修饰发生于这些细胞中的至少25％、这些细胞中的至少33％或这些细胞中的至少50％中。在特定实施例中，表型修饰可以在吸收纳米粒子的所选择的细胞的1/3中进行，其中所传递的核酸编码核酸酶。
在特定实施例中，核酸包括表达治疗蛋白的合成mrna，如car、tcr、car/tcr杂合体或巨噬细胞活化因子。特定实施例利用体外转录(ivt)mrna(参见例如格鲁齐恩-诺加尔斯卡(grudzien-nogalska)等人,分子生物学方法(methodsmol.biol.)969:55-72,2013)；自我扩增型rna(sa-rna；布里托(brito)等人,遗传学进展(advgenet.)89:179-233,2015)；或封端dna(cedna；李(li)等人,公共科学图书馆·综合(plosone.)2013年8月1日(doi.org/10.1371/journal.pone.0069879)以瞬时表达，例如白血病特异性1928zcar、乙型肝炎病毒(hbv)核抗原特异性hb核18-27tcr、前列腺肿瘤特异性抗ror14-1bbzcar或巨噬细胞活化因子。
现在如下更详细地描述本公开的额外选项和实施例：(i)治疗蛋白的表达，所述治疗蛋白包括(a)car、tcr和car/tcr杂合体和(b)巨噬细胞活化因子；(ii)细胞引诱剂；(iii)纳米粒子；(iv)组合物；(v)使用方法；(vi)试剂盒；(vii)示例性实施例；以及(viii)实验实例。
(i)治疗蛋白的表达，所述治疗蛋白包括(a)car、tcr和car/tcr杂合体和(b)巨噬细胞活化因子。在特定实施例中，表达是基于使用mrna作为所传递的纳米粒子内的核酸。
在特定实施例中，核酸包括合成mrna。在特定实施例中，合成mrna使用5'-加帽来工程改造以增加胞内稳定性。多个不同的5'-帽结构可用于产生合成mrna分子的5'-帽。举例来说，抗反向帽类似物(anti-reversecapanalog；arca)帽含有5'-5'-三磷酸鸟嘌呤-鸟嘌呤键，其中一个鸟嘌呤含有n7甲基以及3'-o-甲基。合成mrna分子还可以使用负责产生5'-帽结构的酶转录后加帽。举例来说，重组牛痘病毒加帽酶和重组2'-o-甲基转移酶可以在mrna的5'最末端核苷酸与鸟嘌呤核苷酸之间产生典型5'-5'-三磷酸键，其中鸟嘌呤含有n7甲基化并且最终5'-核苷酸含有产生帽1结构的2'-o-甲基。这产生具有较高翻译能力和细胞稳定性并且细胞促炎性细胞因子的活化降低的帽。
合成mrna或其它核酸也可以制为环状的。合成mrna可以环化或串联，以产生翻译胜任的分子来辅助聚a结合蛋白与5'端结合蛋白之间的相互作用。环化或串联的机制可以通过至少三种不同途径进行：1)化学物质催化；2)酶催化；和3)核酶催化。新形成的5'-/3'-键可以是分子内或分子间的。
在第一途径中，核酸的5'端和3'端可以含有化学反应性基团，当封闭在一起时，所述化学反应性基团在分子的5'端与3'端之间形成新的共价键。5'端可以含有nhs-酯反应性基团，并且3'端可以含有3'-氨基封端的核苷酸，使得在有机溶剂中，合成mrna分子的3'端上的3'-氨基封端的核苷酸将经历对5'-nhs-酯部分的亲核攻击，从而形成新的5'-/3'-酰胺键。
在第二途径中，t4rna连接酶可以用于将5'-磷酸化核酸分子酶连接到核酸的3'-羟基，从而形成新的磷酸二酯键。在实例反应中，可以根据制造商的方案将1μg核酸分子在37℃下与t4rna连接酶(马萨诸塞州伊普斯威奇的新英格兰生物实验室(newenglandbiolabs,ipswich,mass.))的1-10个单元一起培育1小时。连接反应可能在分离寡核苷酸存在下进行，所述分离寡核苷酸能够与并置的5'-区域和3'-区域碱基配对，以辅助酶连接反应。
在第三途径中，cdna模板的5'端或3'端编码连接酶核酶序列，使得在体外转录期间，所得核酸分子可以含有能够将核酸分子的5'端连接到核酸分子的3'端的活性核酶序列。连接酶核酶可以衍生自i型内含子、i型内含子、丁型肝炎病毒、发夹状核酶或可以通过selex(通过指数富集进行配体的系统性进化)来选择。核酶连接酶反应可以在0℃与37℃之间的温度下进行1到24小时。
在特定实施例中，这些核酸序列包括翻译成蛋白质的rna序列。核酸序列包括全长核酸序列以及衍生自全长蛋白质的非全长序列。序列还可以包括天然序列或可以引入以在特定所选细胞类型中提供密码子偏好的序列的简并密码子。编码治疗蛋白的基因序列可以在公开可用的数据库和出版物中获得。如本文所用，术语“编码”是指核酸序列(如质粒、基因、cdna、mrna)充当用于合成治疗蛋白的模板的特性。
如所指示，核酸用于通过基因修饰的细胞驱使治疗蛋白的表达，并且在特定实施例中，治疗蛋白包括car、tcr、car/tcr杂合体或巨噬细胞活化因子。
(a)car、tcr和car/tcr杂合体。car是指包括至少结合域和效应子域，以及任选地间隔子域和/或跨膜域的合成设计的受体。在特定实施例中，car是指包括呈scfv形式的胞外抗原结合域、跨膜域和细胞质信号传导域(在本文也称为“胞内信号传导域”)的重组多肽，所述细胞质信号传导域包括衍生自如下文所定义的刺激分子的功能信号传导域。在特定实施例中，car的中心胞内信号传导域衍生自通常发现与tcr复合物相关的cd3ζ链。如下文更充分地描述，cd3ζ信号传导域可以与衍生自至少一种如4-1bb(即，cd137)、cd27和/或cd28的共刺激分子的一或多个功能信号传导域融合。适用于本公开的方法和组合物的示例性car和car骨架包括由wo2012138475a1、us9624306b2、us9266960b2、us2017017477、ep2694549b1、us20170283504、us20170281766、us20170283500、us20180086846、us20100105136、us20100105136、wo2012079000、wo2008045437、wo2016139487a1和wo2014039523提供的那些骨架，所述申请案中的每一个以全文引用的方式并入本文中。
tcr是指天然存在的t细胞受体。car/tcr杂合体是指具有tcr的要素和car的要素的蛋白质。举例来说，car/tcr杂合体可以具有天然存在的tcr结合域和效应子域，tcr结合域不与效应子域天然相关联。car/tcr杂合体可以具有突变tcr结合域和itam信号传导域。car/tcr杂合体可以具有天然存在的tcr，所述天然存在的tcr具有插入的非天然存在的间隔子区或跨膜域。
特定car/tcr杂合体包括
在特定实施例中，car/tcr杂合体包括“t细胞受体(tcr)融合蛋白”或“tfp”。通常当共置于t细胞中或共置于t细胞表面上时，tfp包括衍生自各种多肽的重组多肽，所述各种多肽包括通常能够i)与目标细胞上的表面抗原结合和ii)与完整tcr复合物的其它多肽组分相互作用的tcr。
在特定实施例中，tfp包括结合癌症抗原(例如，cd19、ror1)的抗体片段，其中抗体片段的序列与编码tcr子单元的核酸序列或其部分连续并且与编码tcr子单元的核酸序列或其部分在相同的阅读框架中。tfp能够与一或多个内源性(或者，一或多个外源性，或内源性与外源性的组合)tcr子单元缔合，以便形成功能性tcr复合物。
结合域可以尤其包括特异性结合目标细胞上的标记的任何肽。结合域的来源包括来自各种物种的抗体可变区(其可以呈抗体、sfv、scfv、fab、基于scfv的grababody或可溶vh域或域抗体的形式)。这些抗体可以仅使用重链可变区形成抗原结合区，即，这些功能抗体仅是重链的同二聚体(称为“重链抗体”)(杰斯普(jespers)等人,自然·生物技术(nat.biotechnol.)22:1161,2004；科特斯-雷塔莫佐(cortez-retamozo)等人,癌症研究(cancerres.)64:2853,2004；巴拉尔(baral)等人,自然·医学(naturemed.)12:580,2006；和巴特尔米(barthelemy)等人,生物化学杂志(j.biol.chem.)283:3639,2008)。
结合域的替代来源包括编码无规肽库的序列或编码替代非抗体骨架(如sctcr)的环区中的氨基酸的经工程改造的多样性的序列(参见例如莱克(lake)等人,国际免疫学(int.immunol.)11:745,1999；梅纳德(maynard)等人,免疫学杂志方法(j.immunol.methods)306:51,2005；美国专利第8,361,794号)、纤维蛋白原域(参见例如魏塞尔(weisel)等人,科学(science)230:1388,1985)、kunitz域(参见例如美国专利第6,423,498号)、经设计的锚蛋白重复蛋白(darpin)(宾兹(binz)等人,分子生物学杂志j.mol.biol.)332:489,2003和宾兹等人,自然·生物技术22:575,2004)、纤维连接蛋白结合域(纤连蛋白或单功能抗体)(理查兹richards)等人,分子生物学杂志326:1475,2003；派克(parker)等人,蛋白质工程设计和选择(proteineng.des.selec.)18:435,2005和哈克尔(hackel)等人(2008)分子生物学杂志381:1238-1252)、半胱氨酸结小蛋白(维塔(vita)等人(1995)美国科学学院学报(proc.nat′l.acad.sci.(usa))92:6404-6408；马丁(martin)等人(2002)自然·生物技术21:71,2002和黄(huang)等人(2005)结构(structure)13:755,2005)、三十四肽重复域(梅因(main)等人,结构11:497,2003和科尔塔贾雷纳(cortajarena)等人,美国化学会化学生物学(acschem.biol.)3:161,2008)、富含亮氨酸的重复域(施通普(stumpp)等人,分子生物学杂志332:471,2003)、脂质运载蛋白域(参见例如wo2006/095164，贝斯特(beste)等人,美国科学学院学报96:1898,1999和舍恩菲尔德
在特定实施例中，结合域为单链tcr(sctcr)，包括vα/β和cα/β链(例如，vα-cα、vβ-cβ、vα-vβ)或包括对所关注的目标具有特异性的vα-cα、vβ-cβ、vα-vβ对(例如，肽-mhc复合物)。
在特定实施例中，经工程改造的car、tcr和杂合car/tcr包括与已知或识别的tcrvα、vβ、cα或cβ的氨基酸序列至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％一致的序列，其中每个cdr包括与特异性结合到所关注的目标的tcr或其片段或衍生物的零个变化或最多一个、两个或三个变化。
在特定实施例中，可以从纳米粒子瞬时表达的经工程改造的car、tcr和杂合car/tcr包括衍生自或基于已知或识别的tcr(例如，高亲和力tcr)的vα、vβ、cα或cβ的vα、vβ、cα或cβ区，并且当与已知或识别的tcr的vα、vβ、cα或cβ比较时，包括一或多个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10个)插入、一或多个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10个)缺失、一或多个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10个氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代或非保守氨基酸取代)，或上文所提及的变化的组合。插入、缺失或取代可以在vα、vβ、cα或cβ区中的任何地方，包括在这些区的氨基末端或羧基末端或两端处，其限制条件是每个cdr包括零个变化或最多一个、两个或三个变化并且含有经修饰的vα、vβ、cα或cβ区的目标结合域仍可以以类似于野生型的亲和力和作用特异性结合其目标。
在特定实施例中，本公开的结合域vh区可以衍生自或基于已知单克隆抗体的vh，并且当与已知单克隆抗体的vh比较时，所述结合域vh区可以含有一或多个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10个)插入、一或多个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10个)缺失、一或多个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代或非保守氨基酸取代)，或上文所提及的变化的组合。插入、缺失或取代可以在vh区中的任何地方，包括在这个区的氨基末端或羧基末端或两端处，其限制条件是每个cdr包括零个变化或最多一个、两个或三个变化并且含有经修饰的vh区的结合域仍可以以类似于野生型结合域的亲和力特异性结合其目标。
在特定实施例中，本公开的结合域中的vl区衍生自或基于已知单克隆抗体的vl，并且当与已知单克隆抗体的vl比较时，所述vl区含有一或多个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10个)插入、一或多个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10个)缺失、一或多个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)，或上文所提及的变化的组合。插入、缺失或取代可以在vl区中的任何地方，包括在这个区的氨基末端或羧基末端或两端处，其限制条件是每个cdr包括零个变化或最多一个、两个或三个变化并且含有经修饰的vl区的结合域仍可以以类似于野生型结合域的亲和力特异性结合其目标。
在特定实施例中，car、tcr或杂合car/tcr的结合域包括或为与轻链可变区(vl)或与重链可变区(vh)或这两个区的序列的至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％一致的序列，其中每个cdr包括与特异性结合到所关注的目标的单克隆抗体或其片段或衍生物的零个变化或最多一个、两个或三个变化。
在特定实施例中，结合域可以结合psma。对psma具有特异性的多种抗体是本领域的普通技术人员已知的并且可以容易地表征序列、表位结合和亲和力。在特定实施例中，结合域可以包括抗间皮素配体(与治疗卵巢癌、胰腺癌和间皮瘤相关)；抗wt-1(与治疗白血病和卵巢癌相关)；抗hiv-gag(与治疗hiv感染相关)；或抗巨细胞病毒(与治疗如疱疹病毒的cmv疾病相关)。
在特定实施例中，结合域可以结合cd19。在特定实施例中，结合域为单链fv片段(scfv)，所述单链fv片段包括对cd19具有特异性的vh和vl区。在特定实施例中，vh和vl区为人类的。示例性vh和vl区包括抗cd19特异性单克隆抗体fmc63的片段。在特定实施例中，scfv是人类的或人类化scfv，所述人类的或人类化scfv包括可变轻链，所述可变轻链包括rasqdiskyln的cdrl1序列、srlhsgv的cdrl2序列和gntlpytfg的cdrl3序列。在特定实施例中，scfv是人类的或人类化scfv，所述人类的或人类化scfv包括可变重链，所述可变重链包括dygvs的cdrhi序列、vtwgsettyynsalks的cdrh2序列和yamdywg的cdrh3序列。其它cd19靶向抗体，如sj25c1和hd37是已知的。(sj25c1：贝切克(bejcek)等人癌症研究2005,pmid7538901；hd37:佩祖托(pezutto)等人ji1987,pmid2437199)。
在特定实施例中，结合人类cd19的scfv序列包括：
malpvtalllplalllhaevklqqsgaelvrpgssvkisckasgyafssywmnwvkqrpgqglewigqiypgdgdtnyngkfkgqatltadkssstaymqlsgltsedsavyfcarktissvvdfyfdywgqgttvtvssggggsggggsggggsdieltqspkfmstsvgdrvsvtckasqnvgtnvawyqqkpgqspkpliysatyrnsgvpdrftgsgsgtdftltitnvqskdladyfcqqynrypytsgggtkleikraaaievmypppyldneksngtiihvkgkhlcpsplfpgpskpfw(seqidno:103)。
在特定实施例中，结合域可以结合ror1。在特定实施例中，scfv是人类的或人类化scfv，所述人类的或人类化scfv包括可变轻链，所述可变轻链包括asgfdfsayym(seqidno:104)的cdrl1序列、tiypssg(seqidno:105)的cdrl2序列和gntlpytfgadratyfca(seqidno:106)的cdrl3序列。在特定实施例中，scfv是人类的或人类化scfv，所述人类的或人类化scfv包括可变重链，所述可变重链包括dtidwy(seqidno:107)的cdrh1序列、vqsdgsytkrpgvpdr(seqidno:108)的cdrh2序列和yiggyvfg(seqidno:109)的cdrh3序列。对ror1具有特异性的多种抗体是本领域的普通技术人员已知的，并且可以容易地表征序列、表位结合和亲和力。
在特定实施例中，结合人类ror1的scfv序列包括：
mlllvtslllcelphpafllipqeqlvesggrlvtpggsltlsckasgfdfsayymswvrqapgkglewiatiypssgktyyatwvngrftissdnaqntvdlqmnsltaadratyfcardsyaddgalfniwgpgtlvtissggggsggggsggggselvltqspsvsaalgspakitctlssahktdtidwyqqlqgeaprylmqvqsdgsytkrpgvpdrfsgsssgadryliipsvqaddeadyycgadyiggyvfgggtqltvtgeskygppcppcpmfwvlvvvggvlacysllv(seqidno:110)。
关于纳米粒子的产生的额外描述可以见于pct/us2018/012507中，其以全文引用的方式并入本文中。.
特定以下癌症可以通过在car、tcr和杂合car/tcr的胞外组分内包括结合一或多个相关细胞标记的结合域(例如，包括对以下标记中的任一个具有特异性的scfv的car)来靶向：
在特定实施例中，合成mrna(例如，ivtmrna)编码特异性结合细胞标记或其片段的car、tcr或car/tcr杂合体。
不限制前述内容，细胞标记还包括a33；bage；bcl-2；β-连环蛋白；bcma；b7h4；btla；ca125；ca19-9；cd3,cd5；cd19；cd20；cd21；cd22；cd25；cd28；cd30；cd33；cd37；cd38；cd40；cd52；cd44v6；cd45；cd56；cd79b；cd80；cd81；cd86；cd123；cd134；cd137；cd151；cd171；cd276；cea；ceacam6；c-met；cs-1；ctla-4；周期蛋白b1；dage；ebna；egfr；egfrviii,ephrinb2；erbb2；erbb3；erbb4；epha2；雌激素受体；fap；铁蛋白；α-胎蛋白(afp)；flt1；flt4；叶酸结合蛋白；卷曲受体；gage；g250；gd-2；ghrhr；ghr；gitr；gm2；gprc5d；gp75；gp100(pmel17)；gp130；hla；her-2/neu；hpve6；hpve7；htert；hvem；igf1r；il6r；kdr；ki-67；路易斯a；路易斯y；lifrβ；lrp；lrp5；ltβr；mage；mart；间皮素；muc；muc1；mum-1-b；myc；nyeso-1；o-乙酰基gd-2；o-乙酰基gd3；osmrβ；p53；pd1；pd-l1；pd-l2；prame；孕酮受体；psa；psma；ptch1；rank；ras；robo1；rorl；存活素；tcrα；tcrβ；肌腱蛋白；tgfbr1；tgfbr2；tlr7；tlr9；tnfr1；tnfr2；tnfrsf4；tweak-r；tsta酪氨酸酶；vegf和wt1。
特定癌细胞细胞标记包括：
本公开提供用于治疗、预防或缓解癌症或癌前病状的症状的方法。所述方法包括向有需要的个体投与治疗有效量的本公开的纳米载体或其药学组合物。可以治疗的示例性癌症包括前列腺癌、乳癌、干细胞癌、卵巢癌、间皮瘤、肾细胞癌、黑素瘤、胰腺癌、肺癌、hbv诱发的肝细胞癌和多发性骨髓瘤。可以治疗的其它示例性癌症包括髓母细胞瘤、少突神经胶质瘤、卵巢透明细胞腺癌、卵巢子宫内膜样腺癌、卵巢浆液性腺癌、胰腺导管腺癌、胰腺内分泌肿瘤、恶性横纹肌样肿瘤、星形细胞瘤、非典型畸胎样横纹肌样肿瘤、脉络丛癌、脉络丛乳头状瘤、室管膜瘤、胶质母细胞瘤、脑膜瘤、神经胶质肿瘤、少突星形细胞瘤、少突神经胶质瘤、成松果体细胞瘤、癌肉瘤、脊索瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、肾外横纹肌样肿瘤、神经鞘瘤、皮肤鳞状细胞癌、软骨肉瘤、软组织透明细胞肉瘤、尤文氏肉瘤(ewingsarcoma)、胃肠道间质瘤、骨肉瘤、横纹肌肉瘤、上皮样肉瘤、肾髓质癌、弥漫性大b细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤以及未另列出(nos)的肉瘤。
本公开进一步提供使用本公开的纳米载体或其药学组合物治疗癌症或前期癌，或制备适用于治疗这类癌症或前期癌的药剂。可以治疗的示例性癌症包括前列腺癌、乳癌、干细胞癌、卵巢癌、间皮瘤、肾细胞癌、黑素瘤、胰腺癌、肺癌、hbv诱发的肝细胞癌和多发性骨髓瘤。可以治疗的其它示例性癌症包括髓母细胞瘤、少突神经胶质瘤、卵巢透明细胞腺癌、卵巢子宫内膜样腺癌、卵巢浆液性腺癌、胰腺导管腺癌、胰腺内分泌肿瘤、恶性横纹肌样肿瘤、星形细胞瘤、非典型畸胎样横纹肌样肿瘤、脉络丛癌、脉络丛乳头状瘤、室管膜瘤、胶质母细胞瘤、脑膜瘤、神经胶质肿瘤、少突星形细胞瘤、少突神经胶质瘤、成松果体细胞瘤、癌肉瘤、脊索瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、肾外横纹肌样肿瘤、神经鞘瘤、皮肤鳞状细胞癌、软骨肉瘤、软组织透明细胞肉瘤、尤文氏肉瘤、胃肠道间质瘤、骨肉瘤、横纹肌肉瘤、上皮样肉瘤、肾髓质癌、弥漫性大b细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤以及nos肉瘤。
在本文所公开的任何方法中，癌症选自由以下组成的群组：脑和中枢神经系统(centralnervoussystem；cns)癌、头颈癌、肾癌、卵巢癌、胰腺癌、白血病、肺癌、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、肉瘤、乳癌和前列腺癌。在一些实施例中，癌症选自由以下组成的群组：髓母细胞瘤、少突神经胶质瘤、卵巢透明细胞腺癌、卵巢子宫内膜样腺癌、卵巢浆液性腺癌、胰腺导管腺癌、胰腺内分泌肿瘤、恶性横纹肌样肿瘤、星形细胞瘤、非典型畸胎样横纹肌样肿瘤、脉络丛癌、脉络丛乳头状瘤、室管膜瘤、胶质母细胞瘤、脑膜瘤、神经胶质肿瘤、少突星形细胞瘤、少突神经胶质瘤、成松果体细胞瘤、癌肉瘤、脊索瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、肾外横纹肌样肿瘤、神经鞘瘤、皮肤鳞状细胞癌、软骨肉瘤、软组织透明细胞肉瘤、尤文氏肉瘤、胃肠道间质瘤、骨肉瘤、横纹肌肉瘤、上皮样肉瘤、肾髓质癌、弥漫性大b细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤以及nos肉瘤。
还考虑了对感染性疾病原具有特异性的结合域，例如通过结合到感染原抗原。这些包括例如病毒抗原或其它病毒标记，例如由病毒感染的细胞表达。示例性病毒包括腺病毒、沙粒病毒、布尼亚病毒(bunyaviruse)、冠状病毒、黄病毒(flavirviruse)、肝病毒、疱疹病毒、乳头状瘤病毒(papilomaviruse)、副黏液病毒(paramyxoviruse)、细小病毒(parvoviruse)、小核糖核酸病毒(picornaviruse)、痘病毒(poxviruse)、正黏液病毒(orthomyxoviruse)、逆转录病毒、呼肠孤病毒(reoviruse)、棒状病毒、轮状病毒、海绵状病毒或披膜病毒(togaviruse)。在其它实施例中，病毒抗原标记包括由cmv、感冒病毒、eb病毒(epstein-barr)、流感病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒、单纯疱疹病毒、hiv、流感、日本脑炎、麻疹、骨髓灰质炎(polio)、狂犬病、呼吸道合胞体病毒(respiratorysyncytial)、风疹、天花、水痘带状疱疹或西尼罗河病毒(westnilevirus)。
作为其它特定实例，巨细胞病毒抗原包括包膜糖蛋白b和cmvpp65；eb抗原包括ebvebnai、ebvp18和ebvp23；肝炎抗原包括hbv的s、m和l蛋白、hbv的前s抗原、hbcagδ、hbvhbe、丙型肝炎病毒rna、hcvns3和hcvns4；单纯疱疹病毒抗原包括即刻早期蛋白和糖蛋白d；hiv抗原包括gag、pol和env基因的基因产物，如hivgp32、hivgp41、hivgp120、hivgp160、hivp17/24、hivp24、hivp55gag、hivp66pol、hivtat、hivgp36、nef蛋白和逆转录酶；流感抗原包括红血球凝集素和神经氨酸酶；日本脑炎病毒抗原包括蛋白质e、m-e、m-e-ns1、ns1、ns1-ns2a和80％e；麻疹抗原包括麻疹病毒融合蛋白；狂犬病抗原包括狂犬病糖蛋白和狂犬病核蛋白；呼吸道合胞体病毒抗原包括rsv融合蛋白和m2蛋白；轮状病毒抗原包括vp7sc；风疹抗原包括蛋白质e1和e2；并且水痘带状疱疹病毒抗原包括gpi和gpii。
其它特定示例性病毒抗原序列包括：
关于病毒抗原的其它实例参见基础病毒学(fundamentalvirology),第二版,菲尔茨,b.n.(fields,b.n.)和奈普,d.m.(knipe,d.m.)编(纽约雷文出版社(ravenpress,newyork)，1991)。
在本文所公开的特定实施例中，经修饰的免疫系统细胞识别并破坏病毒感染的细胞。或者或另外，经修饰的单核细胞/巨噬细胞可以在由病毒粒子进行细胞感染之前从周围组织或血流(胞外)去除病毒。b细胞可以经修饰以瞬时广泛表达中和抗体。在一个实例中，b细胞可以经修饰以瞬时广泛表达中和抗hiv抗体。
在特定实施例中，靶向剂靶向hivgag蛋白、gp120或乙型肝炎包膜蛋白(s域)。
在特定实施例中，标记由与细菌感染相关的细胞表达。示例性细菌包括炭疽(anthrax)；革兰氏阴性杆菌(gram-negativebacilli)、衣原体(chlamydia)、白喉(diphtheria)、流感嗜血杆菌(haemophilusinfluenza)、幽门螺旋杆菌、疟疾、结核分支杆菌、百日咳毒素、肺炎球菌(pneumococcus)、立克次体(rickettsiae)、葡萄球菌、链球菌和破伤风。
作为细菌抗原标记的特定实例，炭疽抗原包括炭疽保护性抗原；革兰氏阴性杆菌抗原包括脂多糖；流感嗜血杆菌抗原包括荚膜多糖；白喉抗原包括白喉毒素；结核分枝杆菌抗原包括分枝菌酸、热休克蛋白65(hsp65)、30kda主要分泌的蛋白和抗原85a；百日咳毒素抗原包括红血球凝集素、百日咳杆菌粘附素、fim2、fim3和腺苷酸环化酶；肺炎球菌抗原包括肺炎球菌溶血素(pneumolysin)和肺炎球菌荚膜多糖；立克次体抗原包括rompa；链球菌抗原包括m蛋白；并且破伤风抗原包括破伤风毒素。
当治疗目标是治疗细菌感染时，单核细胞/巨噬细胞尤其适用于修饰。在一个特定实施例中，单核细胞/巨噬细胞可以用识别金黄色葡萄球菌或金黄色葡萄球菌结块因子a(clfa)的表面组分脂磷壁酸的配体修饰。
在特定实施例中，免疫细胞经修饰以靶向多药耐药性“超级细菌”。超级细菌的实例包括屎肠球菌(enterococcusfaecium)、艰难梭菌(clostridiumdifficile)、鲍氏不动杆菌(acinetobacterbaumannii)、绿脓杆菌(pseudomonasaeruginosa)和肠杆菌(enterobacteriaceae)(包括大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌(klebsiellapneumoniae)、肠杆菌属)。
在特定实施例中，标记由与真菌感染相关的细胞表达。示例性真菌包括念珠菌(candida)、球孢子菌(coccidiode)、隐球菌(cryptococcus)、组织浆菌(histoplasma)、利什曼原虫(leishmania)、疟原虫(plasmodium)、原虫(protozoa)、寄生虫(parasite)、血吸虫(schistosomae)、癣(tinea)、弓形虫(toxoplasma)和克氏锥虫(trypanosomacruzi)。
作为真菌抗原的其它特定实例，球孢子菌抗原包括小球抗原；隐球菌抗原包括荚膜多糖；组织浆菌抗原包括热休克蛋白60(hsp60)；利什曼原虫抗原包括gp63和脂磷酸聚糖；恶性疟原虫抗原包括裂殖子表面抗原、子孢子表面抗原、环子孢子抗原、配子母细胞/配子表面抗原、原虫和包括红内期抗原pf155/resa的其它寄生虫抗原；血吸虫抗原包括谷胱甘肽-s-转移酶和副肌球蛋白；癣真菌抗原包括发癣菌素(trichophytin)；弓形虫抗原包括sag-1和p30；并且克氏锥虫抗原包括75-77kda抗原和56kda抗原。
当治疗目标是治疗真菌感染时，单核细胞/巨噬细胞尤其适用于修饰。
在特定实施例中，标记由与自身免疫或过敏性病状相关的细胞表达。示例性自身免疫病状包括急性出血坏死性脑病、过敏性哮喘、斑秃、贫血、口疮、关节炎(包括类风湿性关节炎、青少年类风湿性关节炎、骨关节炎、牛皮癣性关节炎)、哮喘、自身免疫甲状腺炎、结膜炎、克罗恩病(crohn'sdisease)、皮肤红斑狼疮、皮炎(包括异位性皮炎和湿疹性皮炎)、多尿症(diabetes)、糖尿病(diabetesmellitus)、麻风结节性红斑(erythemanodosumleprosum)、角膜结膜炎、多发性硬化、重症肌无力、牛皮癣、硬皮病、舍格伦综合征(sjogren'ssyndrome)(包括舍格伦综合征的继发性干燥性角膜结膜炎)、史蒂文斯-约翰逊综合征(stevens-johnsonsyndrome)、全身性红斑狼疮、溃疡性结肠炎、阴道炎和韦格纳氏肉牙肿病(wegener'sgranulomatosis)。
自身免疫抗原的实例包括谷氨酸脱羧酶65(gad65)、天然dna、髓鞘碱性蛋白、髓鞘蛋白脂质蛋白、乙酰胆碱受体组分、甲状腺球蛋白和促甲状腺激素(thyroidstimulatinghormone；tsh)受体。过敏性抗原的实例包括花粉抗原，如日本雪松花粉抗原、豚草花粉抗原、黑麦草花粉抗原、动物衍生的抗原(如尘螨抗原和猫科动物抗原)、组织相容性抗原和青霉素以及其它治疗性药物。
效应子域.效应子域能够将功能信号传输到细胞。在特定实施例中，效应子域将通过与直接促进细胞应答的一或多种其它蛋白质缔合而直接或间接促进细胞应答。效应子域可以提供在结合到目标细胞上所表达的标记后表达car、tcr或car/tcr杂合体的转导淋巴细胞的至少一种功能的活化。淋巴细胞的活化可以包括增殖、分化、活化或其它效应子功能中的一或多个。在特定实施例中，所传递的多核苷酸编码效应子域。
效应子域可以包括一个、两个、三个或更多个受体信号传导域、胞内信号传导域、共刺激域或其组合。可以在本公开的car、tcr或car/tcr杂合体中使用来自多种信号传导分子(例如信号转导受体)中的任一种的任何胞内效应子域、共刺激域或这两个。
示例性效应子域包括以下的那些效应子域：4-1bb、cd3ε、cd3δ、cd3ζ、cd27、cd28、cd79a、cd79b、card11、dap10、fcrα、fcrβ、fcrγ、fyn、hvem、icos、lck、lag3、lat、lrp、notch1、wnt、nkg2d、ox40、ror2、ryk、slamf1、slp76、ptα、tcrα、tcrβ、trim、zap70、ptch2或其任何组合。
t细胞活化可以称为由两种不同类别的细胞质信号传导序列介导：引发抗原依赖性初级活化并且提供tcr样信号(初级细胞质信号传导序列)的那些；以及以抗原非依赖性方式起作用以提供二级或共刺激信号(二级细胞质信号传导序列)的那些。以刺激性方式起作用的初级信号传导序列可以含有信号传导基元，所述信号传导基元称为基于受体酪氨酸的活化基元或itam。含有初级细胞质信号传导序列的itam的实例包括衍生自cd3ζ、ferγ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd5、cd22、cd79a、cd79b和cd66d的那些序列。
在特定实施例中，效应子域包括与细胞质信号传导蛋白缔合的细胞质部分，其中细胞质信号传导蛋白是淋巴细胞受体或其信号传导域、包括多个itam的蛋白质、共刺激因子或其任何组合。
胞内信号传导域的实例包括cd3ζ链，和/或共受体的细胞质序列，所述共受体共同作用以在car接合之后引发信号转导，以及这些序列的任何衍生物或变异体和具有相同功能能力的任何合成序列。在特定实施例中，car的胞内信号传导域可以被设计成包括与一或多个任何其它所要细胞质域组合的胞内信号传导域。举例来说，car的胞内信号传导域可以包括胞内信号传导域和共刺激信号传导区。共刺激信号传导区是指包括共刺激分子的胞内域的car的一部分。共刺激分子是除淋巴细胞对标记的反应所需的所表达标记配体之外的细胞表面分子。这类分子的实例包括cd27、cd28、4-1bb(cd137)、ox40、cd30、cd40、淋巴细胞功能相关抗原-1(lfa-1)、cd2、cd7、light、nkg2c、b7-h3和与cd83特异性结合的配体。
间隔子区.可以对针对目标的个别标记定制间隔子区以优化目标识别。在特定实施例中，间隔子长度可以基于标记表位的位置、抗体对所述表位的亲和力和/或表达car、tcr或car/tcr杂合体的淋巴细胞对响应标记识别的体外和/或体内增殖的能力来选择。
通常，间隔子区发现于car、tcr或car/tcr杂合体的结合域与跨膜域之间。间隔子区可以提供结合域的柔性并且允许经修饰细胞中的高表达水平。在特定实施例中，间隔子区可以具有至少10到250个氨基酸、至少10到200个氨基酸、至少10到150个氨基酸、至少10到100个氨基酸、至少10到50个氨基酸或至少10到25个氨基酸，并且包括所列范围中的任一个的端点之间的任何整数。在特定实施例中，间隔子区具有250个氨基酸或更少；200个氨基酸或更少，150个氨基酸或更少；100个氨基酸或更少；50个氨基酸或更少；40个氨基酸或更少；30个氨基酸或更少；20个氨基酸或更少；或10个氨基酸或更少。
在特定实施例中，间隔子区可以衍生自免疫球蛋白样分子的铰链区，例如来自人类lgg1、人类igg2、人类igg3或人类igg4的铰链区的全部或一部分。可以修饰铰链区以避免不合需要的结构相互作用，如二聚化。在特定实施例中，铰链区的全部或一部分可以与免疫球蛋白恒定区的一或多个域组合。举例来说，铰链区的一部分可以与ch2或ch3域或其变异体的全部或一部分组合。
跨膜域.本文所公开的car、tcr或car/tcr杂合体还可以包括跨膜域。在特定实施例中，纳米粒子内投与的car、tcr或car/tcr杂合多核苷酸编码跨膜域。跨膜域提供car、tcr或car/tcr杂合体在淋巴细胞膜中的锚定。跨膜域可以衍生自天然或合成来源。当来源是天然的时，所述域可以衍生自任何膜结合或跨膜蛋白。跨膜区至少包括以下的α、β或ζ链的一或多个跨膜区：t细胞受体、cd28、cd3、cd45、cd4、cds、cd9、cdi6、cd22；cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cdi34、cdi37和cd154。在特定实施例中，合成或变异跨膜域主要包括疏水性残基，如亮氨酸和缬氨酸。
可以在体内(在动物模型中)和/或在体外测试编码不同配体结合域、不同间隔区长度、不同细胞内结合域和/或不同跨膜域的不同潜在car、tcr或杂合car/tcr核酸以识别具有优于其它car、tcr或杂合car/tcr的改进的功能的car、tcr或杂合car/tcr。
示例性car.在特定实施例中，car包括由与cd28和cd3ζ细胞质信号传导域组合的对psma的胞外域具有特异性的单链抗体(scfv)(j591)构成的p28z融合受体。在特定实施例中，car包括p28zcar。本文所描述的p28zcar的特定实例包括鼠类组分。氨基酸位置1-797包括抗psmascfv(j592)，而位置797-1477包括鼠类cd8跨膜域、鼠类cd28信号传导域和鼠类cd3ζ信号传导域。任何p28z域可以个别地用优化域替换。在特定实施例中，本文所描述的p28zcar的位置797-1477内的跨膜域和信号传导域可以尤其被针对人类或其它动物中的用途优化的域替换。在特定实施例中，结合域的任何全部或部分、效应子域的任何全部或部分、间隔子域的任何全部或部分和/或跨膜域的任何全部或部分可以针对人类或其它动物中的用途优化。在特定实施例中，p28zcar针对人类中的用途优化。当针对人类优化时，与非人类抗体相比，p28zcar可以在人类中具有降低的免疫原性并且具有更低数目的非免疫原性表位。
在特定实施例中，ror1特异性和cd19特异性car可以使用2a2、r12和r11mab(ror1)以及fmc63mab(cd19)的vl和vh链片段构建。用于r11和r12的可变区序列提供于杨(yang)等人,公共科学图书馆·综合(plosone)6(6):e21018,2011年6月15日中。每个scfv可以通过(gly4ser)3蛋白连接到衍生自igg4-fc(uniprot资料库∶p01861)的间隔子域，所述间隔子域包括‘铰链-ch2-ch3'(229aa)、‘铰链-ch3'(119aa)或仅‘铰链'(12aa)序列。所有间隔子可以含有位于天然igg4-fc蛋白的位置108处的‘铰链'域内的s→p取代，并且可以与人类cd28(示例性全长cd28参见uniprot∶p10747)的27aa跨膜域和包括以下的效应子域信号传导模块连接：(i)具有位于天然cd28蛋白的位置186-187处的ll→gg取代的人类cd28的41aa细胞质域，或(ii)人类4-1bb(uniprot∶q07011)的42aa细胞质域，其中的每一个可以与人类cd3ζ(uniprot∶p20963)的同工型3的112aa细胞质域连接。构建体编码t2a核糖体跳跃元件和嵌合受体下游的tegfr序列。tegfr可以用结合序列的标签盒替换或补充有结合序列的标签盒，如本文所公开的strep
her2特异性嵌合受体可以使用识别her2上的膜邻近表位的her2特异性mab的vl和vh链片段构建，并且scfv可以与igg4铰链/ch2/ch3、igg4铰链/ch3以及仅igg4铰链胞外间隔子域并且与cd28跨膜域、4-1bb和cd3ζ信号传导域连接。
抗cd19嵌合受体可以包括对应于cd19特异性mabfmc63(scfv：vl-vh)的序列的单链可变片段(scfv)；衍生自igg4-fc的间隔子，其包括‘铰链-ch2-ch3'域(229aa，长间隔子)或仅‘铰链’域(12aa，短间隔子)；以及cd3ζ单独或与膜邻近cd28或4-1bb共刺激域串联的信号传导模块。
(b)巨噬细胞活化因子.“巨噬细胞活化”是指将巨噬细胞的表型或功能从(i)失活状态变成活化状态；(ii)非活化状态变成活化状态；(iii)活化状态变成更活化状态；或(iv)失活状态变成非活化状态的方法。“失活状态”意谓促进肿瘤生长和癌转移的免疫抑制表型。“非活化状态”意谓巨噬细胞既不促进肿瘤生长或转移也不促使杀死肿瘤细胞。活化意谓巨噬细胞展现杀肿瘤活性。在特定实施例中，活化状态产生如下文更充分地描述的m1表型。在特定实施例中，失活状态产生m2表型。“巨噬细胞失活”是指将巨噬细胞的表型或功能从(i)活化状态变成不太活化状态；(ii)活化状态变成非活化状态；(iii)活化状态变成失活状态；或(iv)非活化状态变成失活状态的方法。在特定实施例中，失活状态为m2。在特定实施例中，活化状态为m1。
投与巨噬细胞刺激纳米粒子组合物可以改变肿瘤中的免疫抑制状态，更容易用本文所描述的纳米粒子和由此编码的一或多种治疗蛋白对肿瘤进行伴生治疗。
巨噬细胞朝向活化或失活表型的极化由巨噬细胞与多个不同分子或环境的相互作用产生。举例来说，m1巨噬细胞极化是通过刺激来触发，所述刺激包括toll样受体(tlr)配体(例如，脂多糖(lps)、胞壁酰二肽、咪喹莫特、cpg)、ifnγ、tnfα和巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)。取决于引发极化的刺激，m2极化巨噬细胞可以划分成以下亚群：m2a亚型是由il-4、il-13或真菌和蠕虫感染引发；m2b是由il-1受体配体、免疫复合物和lps引发；m2c是由il-10、tgf-β和糖皮质激素引发；并且m2d是由il-6和腺苷引发。m2巨噬细胞极化还可以通过il-21、gm-csf、补体组分和凋亡细胞触发。还通过局部微环境条件(如低氧)来调节巨噬细胞极化。
前述分子和环境通过触发涉及转录因子的不同胞内信号传导路径而影响巨噬细胞极化。在m1和m2极化中涉及的转录因子包括irf、转录的信号转导子和活化因子(stat)、socs3蛋白以及活化b细胞的核因子κ-轻链-强化子(nfκb)。丝裂原活化蛋白激酶(mapk)还在朝向m1或m2表型引导巨噬细胞功能中起作用。
通过如上文所论述的如ifn和tlr信号传导的这类刺激活化的irf/stat路径，使巨噬细胞经由stat1极化到m1活化状态。另一方面，如il-4和il-13的这类刺激经由stat6使巨噬细胞朝向m2活化状态歪斜(西卡a(sicaa)和勃朗特v(brontev)(2007)临床研究杂志(jclininvest)117:1155-1166)。这些信号传导事件因此引起发炎性免疫反应和杀肿瘤活性的促进，如在m1巨噬细胞极化的情况下，或引起免疫抑制前肿瘤反应的促进，如在m2巨噬细胞极化的情况下。
与m1表型的诱导有关的一些细胞内分子包括g-蛋白偶合受体p2y(2)r，其在通过nos2诱导no中起作用(恩sy(eunsy)等人(2014)国际免疫药理学(intimmunopharmacol)18:270-276)；socs3，其活化nfκb/pi-3激酶路径以产生no(阿诺德ce(arnoldce)等人(2014)免疫学(immunology)141:96-110)；以及生长和分化因子活化素a，其促进m1标记并且下调il-10(西拉-菲拉尔迪e(sierra-filardie)等人(2011)血液(blood)117:5092-5101)。
诱导m1表型所涉及的其它胞内分子包括irf。irf是一组具有不同作用的转录因子，包括病毒介导的ifn活化和调节细胞生长、分化、细胞凋亡和免疫系统活性。irf家族的成员的特征在于含有色氨酸(w)重复的保守n-末端dna-结合域。
irf5是具有螺旋-转角-螺旋dna-结合基元并且介导病毒诱导的信号传导路径和ifn诱导的信号传导路径的转录因子。其充当控制巨噬细胞是否将促进或抑制炎症的分子开关。irf5活化i型ifn基因、发炎性细胞因子(包括tnf、il-6、il-12和il-23)和肿瘤抑制因子以及th1和th17反应。其由位于染色体7q32(omimid607218)处的人类irf5基因编码。应了解，存在irf5的若干同工型/转录变异体。在特定实施例中，人类irf5的同工型包括同工型1(uniprot登录号q13568-1，seqidno:25)、同工型2(uniprot登录号q13568-2，seqidno:26)、同工型3(uniprot登录号q13568-3，seqidno:27)、同工型4(uniprot登录号q13568-4，seqidno:28)、同工型5(uniprot登录号q13568-5，seqidno:29)和同工型6(uniprot登录号q13568-6，seqidno:30)。在特定实施例中，人类irf5的同工型包括由seqidno:47中展示的核苷酸序列编码的同工型1、由seqidno:48中展示的核苷酸序列编码的同工型2、由seqidno:49中展示的核苷酸序列编码的同工型3、由seqidno:50中展示的核苷酸序列编码的同工型4、由seqidno:51中展示的核苷酸序列编码的同工型5和由seqidno:52中展示的核苷酸序列编码的同工型6。在特定实施例中，鼠类irf5包括seqidno:31中展示的氨基酸序列。在特定实施例中，鼠类irf5是由seqidno:53中展示的核苷酸序列编码。已展示m1巨噬细胞上调irf5。
irf1和irf8还在骨髓细胞的开发和功能中起关键作用，包括通过促炎性信号(如ifn-γ)来活化巨噬细胞。德罗尔n(drorn)等人(2007)分子免疫学(molimmunol.)44(4):338-346。在特定实施例中，人类irf1包括seqidno:32中展示的氨基酸序列。在特定实施例中，人类irf1是由seqidno:54中展示的核苷酸序列编码。在特定实施例中，鼠类irf1包括seqidno:36中展示的氨基酸序列。在特定实施例中，鼠类irf1是由seqidno:58中展示的核苷酸序列编码。在特定实施例中，人类irf8包括seqidno:35中展示的氨基酸序列。在特定实施例中，人类irf8是由seqidno:57中展示的核苷酸序列编码。在特定实施例中，鼠类irf8包括seqidno:40中展示的氨基酸序列。在特定实施例中，鼠类irf8是由seqidno:62中展示的核苷酸序列编码。
irf3是irf1和irf2的同系物。其含有若干功能域，包括nes、dbd、c-末端irf相关域和若干调节磷酸化位点。irf3以失活细胞质形式发现，在丝氨酸/苏氨酸磷酸化后与creb结合蛋白、转录共活化因子形成复合物。这种复合物易位到细胞核并且活化ifn-α和ifn-β以及其它干扰素诱导的基因的转录。在特定实施例中，人类irf3的同工型包括同工型1(uniprot登录号q14653-1)、同工型2(uniprot登录号q14653-2)、同工型3(uniprot登录号q14653-3)、同工型4(uniprot登录号q14653-4)和同工型5(uniprot登录号q14653-5)。在特定实施例中，人类irf3同工型1包括seqidno:33中展示的氨基酸序列。在特定实施例中，人类irf3同工型1是由seqidno:55中展示的核苷酸序列编码。在特定实施例中，鼠类irf3包括seqidno:37中展示的氨基酸序列。在特定实施例中，鼠类irf3是由seqidno:59中展示的核苷酸序列编码。
irf7已经展示在i型ifn基因的转录活化中起作用。在特定实施例中，人类irf7的同工型包括同工型a(uniprot登录号q92985-1)、同工型b(uniprot登录号q92985-2)、同工型c(uniprot登录号q92985-3)和同工型d(uniprot登录号q92985-4)。在特定实施例中，人类irf7同工型a包括seqidno:34中展示的氨基酸序列。在特定实施例中，人类irf7同工型a是由seqidno:56中展示的核苷酸序列编码。在特定实施例中，鼠类irf7包括seqidno:38中展示的氨基酸序列。在特定实施例中，鼠类irf7是由seqidno:60中展示的核苷酸序列编码。
还可以使用有助于irf活化的一或多个irf突变。例如：irf5(同工型4，seqidno:28)的人类变异体3/变异体4的拟磷酸化突变，用模拟磷酸化的残基(如天冬氨酸残基)取代氨基酸残基s425、s427、s430、s436(陈w(chenw)等人(2008)自然结构分子生物学(natstructmolbiol.)15(11):1213-1220)；irf5(同工型2，seqidno:26)的人类变异体5的拟磷酸化突变，用模拟磷酸化的残基(如天冬氨酸残基)取代氨基酸残基t10、s158、s309、s317、s451和/或s462(常夫曼h-c(changforemanh-c)等人，见下文)；人类irf5同工型a(变异体1，同工型3，seqidno:27)和同工型b(变异体2，同工型1，seqidno:25)的突变，残基s156、s158、和t160变为模拟磷酸化的残基(如天冬氨酸残基)，以形成irf5的核积聚(林r(linr)等人(2005)生物化学杂志280(4):3088-3095)；以及irf3拟磷酸化突变，用模拟磷酸化的残基(如天冬氨酸取代irf3的氨基酸残基s396(陈w(chenw)等人，见下文)在特定实施例中，鼠类irf7/irf3的融合蛋白包括irf3相关域(seqidno:39)中的四个丝氨酸和一个苏氨酸残基处的asp(d)突变，赋予融合蛋白的构成性活化和易位(林r等人(1998)，见上文；林等人(2000)分子和细胞生物学(molecularandcellularbiology)20:6342-6353)。在特定实施例中，包括irf3相关域中的四个丝氨酸和一个苏氨酸残基处的d突变的鼠类irf7/irf3的融合蛋白是由seqidno:61中展示的核苷酸序列编码。在特定实施例中，鼠类irf8突变包括用精氨酸(r)(seqidno:41)取代氨基酸残基310处的赖氨酸(k)。在特定实施例中，包括用r取代氨基酸残基310处的k的鼠类irf8突变是由seqidno:63中展示的核苷酸序列编码。主要与k310处的irf8结合的小泛素样修饰蛋白(sumo)抑制irf8应答基因的活化。生曲素特异性蛋白酶1(senp1)靶向sumo2/3。senp1“脱sumo化”irf8的活性并且使得irf8从m1巨噬细胞分化的抑制子变成活化因子(直接和通过转录活化活性)。通过k310残基突变防止sumo结合到irf8增加irf8特异性基因转录2-5倍(参见常t-h(changt-h)等人(2012)，见上文)。
本公开的特定实施例包括经工程改造的irf转录因子。在特定实施例中，经工程改造的irf转录因子包括缺乏功能自抑制域并且因此对反馈失活不敏感的irf(汤普森(thompson)等人(2018)免疫学前沿(frontimmunol)9:2622)。举例来说，活性增加2-3倍的人类irf5可以通过删除人类irf5蛋白的aa489-539获得(巴恩斯(barnes)等人(2002)分子细胞生物学(molcellbiol)22:5721-5740)。在特定实施例中，在治疗自身免疫疾病的情形下，可以删除或突变irf4的自抑制域、促进m2表型的转录因子以产生更具活性的irf4。在特定实施例中，irf的自抑制域发现于irf蛋白的羧基末端处。在特定实施例中，经工程改造的irf转录因子包括缺乏一或多个功能的核输出信号(nes)来捕获细胞核中的ir并且因此增强转录的irf。举例来说，可以通过用丙氨酸(l157a/l159a)替换两个亮氨酸残基来突变人类irf5的nes来实现人类irf5的核积聚(林等人(2000)分子和细胞生物学20:6342-6353)。在特定实施例中，经工程改造的irf转录因子包括一或多个irf的融合物、一或多个irf的片段的融合物以及突变irf的融合物。
nfκb也是与巨噬细胞m1活化相关的关键转录因子。nfκb调节大量发炎性基因的表达，所述发炎性基因包括tnfα、il1b、环加氧酶2(cox-2)、il-6和il12p40。nfκb活性通过κb激酶(ikk)三聚复合物(两个激酶，ikkα、ikkβ和调节蛋白ikkγ)的抑制因子的活化来调节。当上游信号在ikk复合物处汇聚时，其首先通过磷酸化来活化ikkβ激酶，并且活化的ikkβ进一步使抑制分子、κb的抑制因子(i-κb)磷酸化。这导致i-κb的蛋白酶体降解和nfκbp65/p50异二聚体从nfκb/i-κb复合物释放。nfκbp65/p50异二聚体随后易位到细胞核并且结合到发炎性基因的启动子。
ikkβ是nfκb以及其它转录因子(如irf5)的活化激酶。ikkβ类似地磷酸化数种其它信号传导路径组分，包括foxo3、ncoa3、bcl10、irs1、nemo/ikbkg、nfκb子单元rela和nfkb1，以及ikk相关的激酶tbk1和ikbke。在特定实施例中，人类ikkβ的同工型包括同工型1(uniprot登录号o14920-1，seqidno:42)、同工型2(uniprot登录号o14920-2seqidno:43)、同工型3(uniprot登录号o14920-3seqidno:44)和同工型4(uniprot登录号o14920-4seqidno:45)。在特定实施例中，人类ikkβ的同工型包括由seqidno:64中展示的核苷酸序列编码的同工型1、由seqidno:65中展示的核苷酸序列编码的同工型2、由seqidno:66中展示的核苷酸序列编码的同工型3和由seqidno:67中展示的核苷酸序列编码的同工型4。在特定实施例中，鼠类ikkβ包括seqidno:46中展示的氨基酸序列。在特定实施例中，鼠类ikkβ是由seqidno:68中展示的核苷酸序列编码。
本公开提供irf转录因子与可以活化irf以实现tam再程序化到活化状态以用于杀死肿瘤的一或多个分子的共表达。在特定实施例中，共表达策略包括∶irf5与ikkβ的共表达；irf5与tank结合激酶-1(tbk-1)、tnf受体相关因子6(traf6)衔接子、受体相互作用蛋白2(rip2)激酶和/或nfκb激酶-ε(ikkε)的共表达(常夫曼h-c等人(2012)公共科学图书馆·综合7(3):e33098)；irf5与蛋白激酶dna-pk的共表达(雷扎科夫g(ryzhakovg)等人(2015)干扰素与细胞因子研究杂志(jofinterferon&cytokineres)35(2):71-78)；irf5与蛋白激酶酪氨酸激酶bcr-abl的共表达(马西莫m(massimom)等人(2014)癌发生(carcinogenesis)35(5):1132-1143)；以及irf5或irf8与cop9信号体中的一或多个组分的共表达(科奇涅夫斯卡j(korczeniewskaj)等人(2013)分子细胞生物学33(6):1124-1138；柯亨hcohenh)等人(2000)生物化学杂志275(50):39081-39089)。
如所指示，低氧还通过低氧诱导型因子hif-1α和hif-2α影响巨噬细胞极化。hif-1α调节nos2表达并且支持m1表型的出现，而hif-2α调节arg1表达并且支持m2表型的出现(武田n(takedan)等人(2010)基因进化(genesdev)24:491-501)。
表1.巨噬细胞极化中涉及的信号传导分子和基因.
从西卡a和曼托瓦尼a(mantovania)2012(见上文)和查韦斯-加兰l(chávez-galánl)等人(2015)免疫学前沿6,253改编。arg-1，精氨酸酶-1；fizz1，抵抗素样分子-α(retnl-α)；stat，转录的信号转导子和活化因子；irf，干扰素调节因子；socs3，细胞因子信号传导3的抑制因子；btk，布鲁顿氏酪氨酸激酶(bruton'styrosinekinase)；hif-1α，低氧诱导型因子1；klf-4，克鲁佩尔(krüppel)样因子4；tnfα，肿瘤坏死因子-α；bmp-7，骨形态生成蛋白7；p2y(2)r，p2y嘌呤受体2；pparγ，过氧化物酶体增殖剂活化受体γ；nfκb，核因子κb；fabp4，脂肪酸结合蛋白4；lxrα，肝x受体α。
在特定实施例中，编码irf的核苷酸与编码其它irf的一或多个额外核苷酸组合使用。在特定实施例中，编码irf的核苷酸与编码其它irf的一或多个额外核苷酸并且与编码ikkβ的核苷酸组合使用。在特定实施例中，编码irf的核苷酸与编码ikkβ的核苷酸以0.5:1、1:1、2:1、3:1、4:1或5:1的比率组合使用。在特定实施例中，编码irf的核苷酸与编码ikkβ的核苷酸以3:1的比率组合使用。
表2提供可以用于区分m1表型与m2表型(包括标示为m2a、m2b、m2c和m2d的亚表型)的准则的特定组合。
表2.对巨噬细胞表型进行分类的示例性准则.
从罗斯泽t(
评估巨噬细胞表型的分析可以利用特定针对m1或m2表型的不同分子标签。普遍公认的m1巨噬细胞的标记是cd80+，而m2巨噬细胞可以表征为cd163+。因此，可以进行流式细胞测量术以评估这些标记。驱使巨噬细胞朝向m1型并且远离m2型还可以通过测量il-12/il-10比率或cd163-/cd163+巨噬细胞比率的增加来评估。在特定实施例中，m1与m2形态可以通过光学显微镜来评估。在特定实施例中，吞噬作用分析可以与其它分析一起使用来评估巨噬细胞是m1型还是m2表型。不同巨噬细胞群的吞噬作用分析可以通过以一定浓度培育待用巨噬细胞吞噬的实体来进行，所述浓度与其每个细胞的归一化总表面积一致。待吞噬的实体可以添加到巨噬细胞培养物中。待吞噬的实体可以例如标记有荧光标记。可以通过每个巨噬细胞测量的中值总荧光强度来确定吞噬作用指数。吞噬作用的定量可以通过例如流式细胞测量术进行。还可以利用肿瘤细胞杀死分析。在特定实施例中，m1表型包括标签m2巨噬细胞基因的表达减少，所述标签m2巨噬细胞基因包括serpinb2(尿激酶型纤维蛋白溶酶原活化因子的抑制因子)、ccl2(c-c基元趋化因子配体2)、ccl11(c-c基元趋化因子配体11)和retnla(抵抗素样α；fizz1)。在特定实施例中，m1表型包括m1分化基因的表达增加，所述m1分化基因包括ccl5(c-c基元趋化因子配体5)。
基因表达(例如，上文提到的cd80、cd86和/或其它基因的m1表达)可以通过本领域技术人员的分析测量。测量基因表达的方法包括纳斯瑞
(ii)细胞引诱剂.在特定实施例中，细胞引诱剂用于将细胞引诱到解剖部位(例如，肿瘤部位)。在特定实施例中，可以将细胞引诱剂投与到所选解剖部位处、所选解剖部位或所选解剖部位附近。在特定实施例中，细胞引诱剂可以与将其引导到所选解剖部位的化合物一起投与。
在特定实施例中，所选解剖部位是肿瘤部位并且t细胞被引诱到肿瘤部位。在特定实施例中，所引诱的t细胞包括已经或将被修饰以瞬时表达治疗蛋白的所选t细胞。在特定实施例中，所引诱的细胞包括支持经修饰以瞬时表达治疗蛋白的所选细胞类型的活性的细胞。举例来说，当t细胞经修饰以瞬时表达治疗蛋白时，可以募集nk细胞或恒定nk(inkt)细胞以支持肿瘤特异性t细胞。在特定实施例中，超过一种细胞类型可以被引诱到所选解剖部位。
在特定实施例中，所选细胞可以使用预处理被引诱到解剖部位。预处理是指将通过向解剖部位投与纳米粒子来募集将再程序化的细胞。在特定实施例中，预处理包括将t细胞募集到肿瘤部位并且用本文所描述的纳米粒子再程序化所募集的t细胞以瞬时表达肿瘤特异性受体。
因此，任选地，用产生所选细胞类型的治疗蛋白表达的纳米粒子治疗可以与细胞引诱剂(如t细胞引诱剂)一起刺激待治疗的肿瘤的t细胞募集。适当的t细胞引诱剂包括ccl21和ip10。额外免疫细胞引诱剂是本领域中已知的。举例来说，识别以下细胞/引诱剂对：
本领域的普通技术人员将认识到，不同细胞类型可由不同引诱剂治疗引诱/募集。
(iii)纳米粒子.如先前所指示，本公开内利用的纳米粒子可以包括(a)所选细胞靶向配体；(b)带正电载体；(c)带正电载体内的核酸；以及(d)中性或带负电包衣。
(a)所选细胞靶向配体.在特定实施例中，所选细胞靶向配体可以包括纳米粒子表面锚定的靶向配体，所述纳米粒子表面锚定的靶向配体选择性地将纳米粒子结合到所选细胞并且引发快速受体诱导的内吞作用以内化所述配体。在特定实施例中，将所选细胞靶向配体共价偶合到构成中性或带负电包衣的聚合物。
在特定实施例中，所选细胞靶向配体可以包括抗体结合域、scfv蛋白、dart分子、肽和/或适配体。特定实施例利用抗cd8、抗cd3和/或抗cd45抗体结合域来转染人类t细胞，并且抗体结合域识别cd34、cd133或cd46以靶向造血干细胞(hsc)。还提供用于包括巨噬细胞的其它细胞类型的结合域的实例。
在特定实施例中，纳米粒子的所选细胞靶向配体选择性地结合非均质细胞群内的所关注的所选细胞(如免疫细胞或感染性疾病细胞，或例如用病毒或其它感染原感染的细胞)。对于根据本文所公开的组合物和方法的靶向，所选细胞与目前已知或稍后发现的标记相关。
在特定实施例中，标记是抗原。抗原是指能够结合到免疫球蛋白分子的抗原结合区或引发免疫反应的物质，所述免疫反应例如通过呈现主要组织相容性抗原(mhc)细胞蛋白上抗原的t细胞介导的免疫反应。“抗原”包括抗原决定子、半抗原和免疫原，所述抗原可以是肽、小分子、碳水化合物、脂质、核酸或其组合。当参考经处理来呈现给t细胞的抗原时，术语“抗原”是指由mhc呈现给tcr的t细胞表位的抗原的那些部分(例如肽片段)。当在以对“抗原”具有特异性的抗体形式的b细胞介导的免疫反应的情形下使用时，参考结合到抗体可变域(轻和重)的互补决定区的抗原部分。结合部分可以是线性或三维表位。
在特定实施例中，所关注的所选免疫细胞是淋巴细胞。淋巴细胞包括t细胞、b细胞、nk细胞、单核细胞/巨噬细胞和hsc。
已发现数个不同的t细胞之亚群，各自具有不同的功能。在特定实施例中，所选细胞靶向配体通过受体介导的内吞作用实现针对特定淋巴细胞群的选择性方向。举例来说，大部分t细胞具有以数种蛋白质的复合物形式存在的t细胞受体(tcr)。天然t细胞受体是由两个分离的肽链构成，所述肽链由独立的t细胞受体α和β(tcrα和tcrβ)基因产生并且称为α-tcr链和β-tcr链。本文所公开的所选细胞靶向配体可以结合α-tcr链和/或β-tcr链，来实现核酸选择性传递到这些t细胞。
γδt-细胞表示在其表面上具有不同的t-细胞受体(tcr)的t细胞的较小亚群。在γδt细胞中，tcr是由一个γ-链和一个δ-链构成。这组t细胞比αβt细胞更不常见(总t细胞的2％)。然而，本文所公开的所选细胞靶向配体可以结合γ-tcr链和/或δtcr链，来实现核酸选择性传递到这些t细胞。
cd3在所有成熟的t细胞上表达。因此，本文所公开的所选细胞靶向配体可以结合cd3来实现核酸选择性传递到所有成熟的t细胞。活化的t细胞表达4-1bb(cd137)、cd69和cd25。因此，本文所公开的所选细胞靶向配体可以结合4-1bb、cd69或cd25来实现核酸选择性传递到活化的t细胞。cd5和转铁蛋白受体还在t细胞上表达并且可以用于实现核酸选择性传递到t细胞。
可以进一步将t细胞分类成包括细胞溶解t细胞的辅助细胞(cd4+t细胞)和细胞毒性t细胞(ctl，cd8+t细胞)。t辅助细胞在免疫过程中辅助其它白细胞，包括使b细胞成熟成血浆细胞和细胞毒性t细胞和巨噬细胞的活化以及其它功能。这些细胞也称为cd4+t细胞，因为其在其表面上表达cd4蛋白。当辅助性t细胞通过被在抗原呈递细胞(antigenpresentingcell；apc)表面上表达的mhcii类分子与肽抗原一起呈递时，所述辅助性t细胞变得被活化。一旦活化，那么所述辅助性t细胞快速地划分并且分泌被称作调节或辅助活性免疫反应的细胞因子的较小蛋白质。本文所公开的所选细胞靶向配体可以结合cd4来实现核酸选择性传递到t辅助细胞。
细胞毒性t细胞破坏病毒感染的细胞和肿瘤细胞，并且还涉及移植排斥反应。这些细胞也称为cd8+t细胞，因为其在其表面上表达cd8糖蛋白。这些细胞通过结合到与mhci类相关的抗原来识别其目标，所述与mhci类相关的抗原几乎存在于身体的每个细胞的表面上。本文所公开的所选细胞靶向配体可以结合cd8来实现核酸选择性传递到ctl。
如本文所使用的“中枢记忆”t细胞(或“tcm”)是指表达其表面上的cd62l或ccr7和cd45ro的抗原处理过的ctl，并且与原始细胞相比不表达或具有降低的cd45ra表达。在特定实施例中，中枢记忆细胞对于cd62l、ccr7、cd25、cd127、cd45ro和cd95的表达为正的，并且与原始细胞相比具有降低的cd45ra表达。本文所公开的所选细胞靶向配体可以结合cd62l、ccr7、cd25、cd127、cd45ro和/或cd95来实现核酸选择性传递到tcm。
如本文所使用的“效应子记忆”t细胞(或“tem”)是指与中枢记忆细胞相比不表达或具有其表面上的降低的cd62l表达的抗原处理过的t细胞，并且与原始细胞相比不表达或具有降低的cd45ra表达。在特定实施例中，效应子记忆细胞与原始细胞或中枢记忆细胞相比对于cd62l和ccr7的表达时负的，并且具有cd28和cd45ra的可变表达。效应子t细胞与记忆或原始t细胞相比对于颗粒酶b和穿孔素是正的。本文所公开的所选细胞靶向配体可以结合颗粒酶b和/或穿孔素来实现核酸选择性传递到tem。
调节t细胞(“treg”)是t细胞的亚群，其调节免疫系统、维持对自身抗原的耐受性并且消除自身免疫疾病。treg表达cd25、ctla-4、gitr、garp和lap。本文所公开的所选细胞靶向配体可以结合cd25、ctla-4、gitr、garp和/或lap来实现核酸选择性传递到原始treg。
如本文所使用的“原始”t细胞是指表达cd62l和cd45ra的非抗原处理过的t细胞，并且与中枢或记忆细胞记忆细胞相比不表达cd45ro。在特定实施例中，原始cd8+t淋巴细胞特征在于原始t细胞的表型标记(包括cd62l、ccr7、cd28、cd127和cd45ra)的表达。本文所公开的所选细胞靶向配体可以结合cd62l、ccr7、cd28、cd127和/或cd45ra来实现核酸选择性传递到原始t细胞。
响应干扰素或巨噬细胞衍生的细胞因子来活化nk细胞(也称为k细胞，并且杀死细胞)。其用以含有病毒感染，而适应性免疫反应产生可以清除感染的抗原特异性细胞毒性t细胞。nk细胞表达cd8、cd16和cd56但不表达cd3。本文所公开的所选细胞靶向配体可以结合cd8、cd16和/或cd56来实现核酸选择性传递到nk细胞。
巨噬细胞(和其前驱物、单核细胞)存在于身体的每个组织中(在某些情况下，作为微神经胶质细胞、库普弗细胞(kupffercell)和破骨细胞)，在所述身体的每个组织中，巨噬细胞吞噬凋亡细胞、病原体和其它非自身组分。因为单核细胞/巨噬细胞吞噬非自身组分，所以本文所描述的纳米粒子上并不需要特定的巨噬细胞引导剂或单核细胞引导剂以用于这些细胞的选择性吸收。或者，本文所公开的所选细胞靶向配体可以结合cd11b、f4/80；cd68；cd11c；il-4rα；和/或cd163来实现核酸选择性传递到单核细胞/巨噬细胞。应认识到，巨噬细胞将不表达tcr，并且因此其对于本文所描述的包括编码tcr蛋白或car/tcr杂合蛋白的mrna的纳米粒子不是所需的目标。
不成熟的树突状细胞(即，预活化)吞噬周围的抗原和其它非自身组分，并且随后以活化形式迁移到淋巴组织的t细胞区域，其中其向t细胞提供抗原呈递。因此，如巨噬细胞，树突状细胞的靶向不必依赖于所选细胞靶向配体。当所选细胞靶向配体用于选择性地靶向树突状细胞时，其可以结合以下cd抗原：cd1a、cd1b、cd1c、cd1d、cd21、cd35、cd39、cd40、cd86、cd101、cd148、cd209和dec-205。
b细胞可以通过b细胞受体(bcr)的存在与其它淋巴细胞区分开。b细胞的主要功能是制备抗体。b细胞表达cd5、cd19、cd20、cd21、cd22、cd35、cd40、cd52和cd80。本文所公开的所选细胞靶向配体可以结合cd5、cd19、cd20、cd21、cd22、cd35、cd40、cd52和/或cd80来实现核酸选择性传递到b细胞。靶向b细胞受体同种型恒定区(igm、igg、iga、ige)的抗体也可以用于靶向b细胞亚型。
淋巴细胞官能化相关抗原1(lfa-1)是由所有t细胞、b细胞和单核细胞/巨噬细胞表达。因此，本文所公开的所选细胞靶向配体可以结合lfa-1来实现核酸选择性传递到t细胞、b细胞和单核细胞/巨噬细胞。
还可以针对本文所公开的纳米粒子的选择性传递来靶向hsc。hsc表达cd34、cd46、cd133、sca-1和cd117。本文所公开的所选细胞靶向配体可以结合cd34、cd46、cd133、sca-1和/或cd117来实现核酸选择性传递到造血干细胞。
“选择性传递”意谓核酸由一或多种所选淋巴细胞群传递和表达。在特定实施例中，选择性传递排斥所选淋巴细胞群。在特定实施例中，所投与核酸的至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％由所选淋巴细胞群传递和/或表达。在特定实施例中，选择性传递确保非淋巴细胞不表达所传递的核酸。举例来说，当靶向剂是t细胞受体(tcr)基因时，确保选择性，因为仅t细胞具有tcr表达所需的ζ链。选择性传递还可以基于缺乏到非所选细胞中的核酸吸收。
所选细胞靶向配体可以包括淋巴细胞上发现的基元的结合域。所选细胞靶向配体还可以包括允许选择性吸收到淋巴细胞中的任何选择性结合机制。在特定实施例中，所选细胞靶向配体包括以下的结合域：t细胞受体基元；t细胞α链；t细胞β链；t细胞γ链；t细胞δ链；ccr7；cd1a；cd1b；cd1c；cd1d；cd3；cd4；cd5；cd7；cd8；cd11b；cd11c；cd16；cd19；cd20；cd21；cd22；cd25；cd28；cd34；cd35；cd39；cd40cd45racd45ro；cd46；cd52；cd56；cd62l；cd68；cd80；cd86；cd95；cd101；cd117；cd127；cd133；cd137(4-1bb)；cd148；cd163；f4/80；il-4rα；sca-1；ctla-4；gitr；garp；lap；颗粒酶b；lfa-1；转铁蛋白受体；以及其组合。
在特定实施例中，结合域包括细胞标记配体、受体配体、抗体结合域、肽、肽适配体、核酸、核酸适配体、镜像适配体或其组合。在所选细胞靶向配体的情形下，结合域包括结合到另一物质以形成能够介导内吞作用的复合物的任何物质。
抗体结合域包括抗体(例如fv、fab、fab'、f(ab')2)的结合分段和单链fv片段(scfv)或特异性结合到由淋巴细胞表达的基元的免疫球蛋白的任何生物学有效片段。抗体或抗原结合片段包括多克隆抗体、单克隆抗体、人类抗体、人类化抗体、合成抗体、嵌合抗体、双特异性抗体、微型抗体和线性抗体中的全部或一部分。
来自人类起源的抗体或人类化抗体在人类中具有降低的免疫原性或无免疫原性并且与非人类抗体相比具有较低数目的非免疫原性表位。抗体和其片段通常将被选择以在人类个体中具有降低的含量或无抗原性。
如本领域的普通技术人员已知可以使用获得单克隆抗体的方法、噬菌体呈现的方法、产生人类或人类化抗体的方法或使用经工程改造以产生抗体的转基因动物或植物的方法制备特异性结合由淋巴细胞表达的基元的抗体(参见例如美国专利第6,291,161号和第6,291,158号)。部分或完全合成抗体的噬菌体呈现库是可用的并且可以针对可结合到淋巴细胞基元的抗体或其片段进行筛选。举例来说，结合域可以通过筛选用于特异性结合到所关注的目标的fab片段的fab噬菌体库来识别(参见候特(hoet)等人,自然·生物技术23:344,2005)。人类抗体的噬菌体呈现库也是可用的。另外，使用所关注的目标作为适宜系统(例如小鼠，humab
在特定实施例中，所选细胞靶向配体的结合域包括t细胞受体基元抗体；t细胞α链抗体；t细胞β链抗体；t细胞γ链抗体；t细胞δ链抗体；ccr7抗体；cd1a抗体；cd1b抗体；cd1c抗体；cd1d抗体；cd3抗体；cd4抗体；cd5抗体；cd7抗体；cd8抗体；cd11b抗体；cd11c抗体；cd16抗体；cd19抗体；cd20抗体；cd21抗体；cd22抗体；cd25抗体；cd28抗体；cd34抗体；cd35抗体；cd39抗体；cd40抗体；cd45ra抗体；cd45ro抗体；cd46抗体；cd52抗体；cd56抗体；cd62l抗体；cd68抗体；cd80抗体；cd86抗体；cd95抗体；cd101抗体；cd117抗体；cd127抗体；cd133抗体；cd137(4-1bb)抗体；cd148抗体；cd163抗体；f4/80抗体；il-4rα抗体；sca-1抗体；ctla-4抗体；gitr抗体；garp抗体；lap抗体；颗粒酶b抗体；lfa-1抗体；或转铁蛋白受体抗体。这些结合域还可以由前述抗体的scfv片段组成。
适用于本公开的方法和组合物的示例性抗体(如scfv)包括提供于以下中的那些抗体：wo2014164553a1、us20170283504、us7083785b2、us10189906b2、us10174095b2、wo2005102387a2、us20110206701a1、wo2014179759a1、us20180037651a1、us20180118822a1、wo2008047242a2、wo1996016990a1、wo2005103083a2和wo1999062526a2，其中的每一个以引入的方式并入本文中。
肽适配体包括在两端连接到蛋白质骨架的肽环(其对目标蛋白具有特异性)。这种双重结构约束极大地增加了肽适配体的结合亲和力到与抗体相当的含量。可变环长度通常为8到20个氨基酸(例如，8到12个氨基酸)，并且骨架可以是任何稳定的、可溶的、较小的并且无毒的蛋白质(例如，硫氧还蛋白a、胱抑蛋白a三重突变、绿色荧光蛋白、水蛭抑制剂c和细胞转录因子spl)。肽适配体选择可以使用不同系统，如酵母双混合系统(例如，gal4酵母-双混合系统)或lexa相互作用陷阱系统进行。
核酸适配体为单链核酸(dna或rna)配体，其通过折叠到指定结合到具有高亲和力和特异性的目标蛋白质或其它分子的特定球状结构中而起作用，如奥斯伯恩(osborne)等人,化学生物学新见(curr.opin.chem.biol.)1:5-9,1997和切尔基亚(cerchia)等人,febs快报(febsletters)528:12-16,2002所描述。在特定实施例中，适配体是较小的(15kd；或15-80个核苷酸之间或20-50个核苷酸之间)。适配体一般通过称为selex的程序与包括1014-1015个随机寡核苷酸序列的库分离(通过指数富集的配体的系统进化；参见例如图尔克(tuerk)等人,科学,249:505-510,1990；格林(green)等人,发酵学方法(methodsenzymology.)75-86,1991；和戈尔德(gold)等人,生物化学年鉴(annu.rev.biochem.),64:763-797,1995)。产生适配体的其它方法描述于例如美国专利第6,344,318号；第6,331,398号；第6,110,900号；第5,817,785号；第5,756,291号；第5,696,249号；第5,670,637号；第5,637,461号；第5,595,877号；第5,527,894号；第5,496,938号；第5,475,096号；以及第5,270,16号中。除至少一个β-核糖单元由β-d-脱氧核糖或选自例如β-d-核糖、α-d-核糖、β-l-核糖的经修饰的糖单元替换以外，镜像适配体类似于核酸适配体。
在特定实施例中，egr2靶向m2巨噬细胞。egr2的市售抗体可以从马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔(thermofisher,waltham,ma)；马萨诸塞州剑桥的艾碧康(abcam,cambridge,ma)；马萨诸塞州伯林顿的密理博西格玛(milliporesigma,burlington,ma)；德国贝尔吉施格拉德巴赫的美天旎生物技术公司(miltenyibiotec,bergischgladbach,germany)；华盛顿州西雅图的生命期生物科学公司(lifespanbiosciences,inc.,seattle,wa)；以及科罗拉多州利特顿的诺伍斯生物制剂公司(novusbiologicals,littleton,co)获得。抗egr2抗体的产生论述于例如穆拉卡米k(murakamik)等人(1993)癌基因(oncogene)8(6):1559-1566中。抗egr2抗体包括：兔单克隆抗egr2抗体克隆epr4004；小鼠单克隆抗egr2抗体克隆1g5；小鼠单克隆抗egr2抗体克隆oti1b12；识别人类egr2的aa残基200-300的兔多克隆抗egr2抗体；识别人类egr2的aa残基340-420的兔多克隆抗egr2抗体；以及识别人类egr2抗体残基370-420的兔多克隆抗egr2抗体。结合域可以衍生自本文所公开的这些抗体和其它抗体。
对cd206具有特异性的多种其它抗体是本领域的普通技术人员已知的，并且可以容易地表征序列、表位结合和亲和力。参见例如wo2014/140376、wo2013/174537和us7,560,534。用于cd206的市售抗体可以从马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔；伊利诺伊州罗斯蒙特的蛋白质科技公司(proteintech,rosemont,il)；加利福尼亚州圣地亚哥的生物联想公司(biolegend,sandiego,ca)；明尼苏达州明尼阿波利斯的r&d系统(r&dsystems,minneapolis,mn)；华盛顿州西雅图的生命期生物科学公司(lifespanbiosciences,inc.,seattle,wa)；科罗拉多州利特顿的诺伍斯生物制剂公司；加利福尼亚州海格立斯的拜耳雷德(bio-rad,hercules,ca)。在特定实施例中，抗cd206抗体包括大鼠单克隆抗小鼠cd206单克隆抗体克隆c068c2(目录号141732，加利福尼亚州圣地亚哥的生物联想公司)。
在特定实施例中，靶向配体包括人类或人类化结合域(例如，scfv)，所述人类或人类化结合域包括可变轻链，所述可变轻链包括:包括asqsvshdv(seqidno:69)的cdrl1序列、包括yts的cdrl2序列和包括qdyssprt(seqidno:70)的cdrl3序列。在特定实施例中，靶向配体包括人类或人类化结合域(例如，scfv)，所述人类或人类化结合域包括可变重链，所述可变重链包括:包括gysitsdy(seqidno:71)的cdrh1序列、包括ysg的cdrh2序列和包括cvsgtyyfdywg(seqidno:72)的cdrh3序列。这些反映结合cd163的mac2-48抗体的cdr序列。
在特定实施例中，靶向配体包括人类或人类化结合域(例如，scfv)，所述人类或人类化结合域包括可变轻链，所述可变轻链包括：包括asqsvssdv(seqidno:73)的cdrl1序列、包括yas的cdrl2序列和包括qdytsprt(seqidno:74)的cdrl3序列。在特定实施例中，靶向配体包括人类或人类化结合域(例如，scfv)，所述人类或人类化结合域包括可变重链，所述可变重链包括：包括gysitsdy(seqidno:75)的cdrh1序列、包括ysg的cdrh2序列和包括cvsgtyyfdywg(seqidno:76)的cdrh3序列。这些反映结合cd163的mac2-158抗体的cdr序列。
对cd163具有特异性的多种其它抗体或结合域是本领域的普通技术人员已知的，并且可以容易地表征序列、表位结合和亲和力。参见例如wo2011/039510、wo2002/032941、wo2002/076501和us2005/0214871。用于cd163的市售抗体可以从马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔；纽约州法明代尔的恩佐生命科学公司(enzolifesciences,inc.,farmingdale,ny)；加利福尼亚州圣地亚哥的生物联想公司；明尼苏达州明尼阿波利斯的r&d系统；华盛顿州西雅图的生命期生物科学公司；以及新泽西州佛兰德斯的rdi研究诊断(rdiresearchdiagnostics,flanders,nj)获得。在特定实施例中，抗cd163抗体可以包括：小鼠单克隆抗cd163抗体克隆3d4；小鼠单克隆抗cd163抗体克隆ber-mac3；小鼠单克隆抗cd163抗体克隆edhu-1；以及小鼠单克隆抗cd163抗体克隆ghi/61。
在特定实施例中，靶向配体包括人类或人类化结合域(例如，scfv)，所述人类或人类化结合域包括可变轻链，所述可变轻链包括：包括rssksllykdgktyln(seqidno:77)的cdrl1序列、包括lmstras(seqidno:78)的cdrl2序列和包括qqlveypft(seqidno:79)的cdrl3序列。在特定实施例中，靶向配体包括人类或人类化结合域(例如，scfv)，所述人类或人类化结合域包括可变重链，所述可变重链包括：包括gywms(seqidno:80)的cdrh1序列、包括eirlksdnyathyaesvkg(seqidno:81)的cdrh2序列和包括fid的cdrh3序列。这些反映结合cd23的cdr序列。
对cd23具有特异性的多种抗体或结合域是本领域的普通技术人员已知的并且可以容易地表征序列、表位结合和亲和力。参见例如us7,008,623、us6,011,138a(包括5e8、6g5、2c8、b3b1和3g12的抗体)、us2009/0252725，雷克特(rector)等人(1985)免疫学杂志55:481-488；弗洛雷斯-鲁梅奥(flores-rumeo)等人(1993)科学241:1038-1046；谢尔(sherr)等人(1989)免疫学杂志142:481-489；以及佩恩(pene)等人,(1988)美国科学院院报(pnas)85:6820-6824。用于cd23的市售抗体可以从马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔；马萨诸塞州剑桥的艾碧康；马萨诸塞州沃本的生物抗体公司(biossantibodies,inc.,woburn,ma)；加利福尼亚州海格立斯的拜耳雷德；华盛顿州西雅图的生命期生物科学公司；以及加利福尼亚州普莱森顿的博士德生物学技术(bosterbiologicaltechnology,pleasanton,ca)获得。在特定实施例中，抗cd23抗体可以包括：小鼠单克隆抗cd23抗体克隆tu1；兔单克隆抗cd23抗体克隆sp23；兔单克隆抗cd23抗体克隆epr3617；小鼠单克隆抗cd23抗体克隆5b5；小鼠单克隆抗cd23抗体克隆1b12；小鼠单克隆抗cd23抗体克隆m-l23.4；以及小鼠单克隆抗cd23抗体克隆3a2。
m1结合域.在特定实施例中，靶向配体包括人类或人类化结合域(例如，scfv)，所述人类或人类化结合域包括可变轻链，所述可变轻链包括：包括ssnigdny(seqidno:82)的cdrl1序列、包括rds的cdrl2序列和包括qsydsslsgs(seqidno:83)的cdrl3序列。在特定实施例中，靶向配体包括人类或人类化结合域(例如，scfv)，所述人类或人类化结合域包括可变重链，所述可变重链包括：包括gftfddyg(seqidno:84)的cdrh1序列、包括iswnggkt(seqidno:85)的cdrh2序列和包括argslfhdssgfyfgh(seqidno:86)的cdrh3序列。这些反映结合cd38的ab79抗体的cdr序列。
在特定实施例中，靶向配体包括人类或人类化结合域(例如，scfv)，所述人类或人类化结合域包括可变轻链，所述可变轻链包括：包括nsnigsnt(seqidno:87)的cdrl1序列、包括sds的cdrl2序列和包括qsydsslsgsr(seqidno:88)的cdrl3序列。在特定实施例中，靶向配体包括人类或人类化结合域(例如，scfv)，所述人类或人类化结合域包括可变重链，所述可变重链包括：包括gftfnnyg(seqidno:89)的cdrh1序列、包括isydgsdk(seqidno:90)的cdrh2序列和包括arvyyygfsgpsmdv(seqidno:91)的cdrh3序列。这些反映结合cd38的ab19抗体的cdr序列。
在特定实施例中，靶向配体包括人类或人类化结合域(例如，scfv)，所述人类或人类化结合域包括可变轻链，所述可变轻链包括：包括rasqsvssyla(seqidno:92)的cdrl1序列、包括dasnrat(seqidno:93)的cdrl2序列和包括qqrsnwpptf(seqidno:94)的cdrl3序列在特定实施例中，靶向配体包括人类或人类化结合域(例如，scfv)，所述人类或人类化结合域包括可变重链，所述可变重链包括：包括sfams(seqidno:95)的cdrh1序列、包括aisgsgggtyyadsvkg(seqidno:96)的cdrh2序列和包括dkilwfgepvfdy(seqidno:97)的cdrh3序列。这些反映结合us7,829,693中所描述的cd38的达雷木单抗(daratumumab)抗体的cdr序列。
对于cd38具有特异性的多种抗体是本领域的普通技术人员已知的并且可以容易地表征序列、表位结合和亲和力。参见例如wo2005/103083、wo2006/125640、wo2007/042309、wo2008/047242、wo2012/092612、wo2006/099875、wo2011/154453、wo2015/130728、us7,829,693和us2016/0200828。用于cd38的市售抗体可以从马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔；马萨诸塞州剑桥的艾碧康；以及马萨诸塞州伯林顿的密理博西格玛获得。在特定实施例中，抗cd23抗体可以包括：兔单克隆抗cd38抗体克隆gad-3；小鼠单克隆抗cd38抗体克隆hit2；小鼠单克隆抗cd38抗体克隆at1；小鼠单克隆抗cd38抗体克隆at13/5；大鼠单克隆抗cd38抗体克隆nimr-5；以及大鼠单克隆igg2a，κ抗cd38抗体克隆90/cd38(目录号/加利福尼亚州圣何塞的bd生物科学(bdbiosciences,sanjose,ca))。
在特定实施例中，g蛋白偶合受体18(gpr18)靶向m1巨噬细胞。用于gpr18的市售抗体可以从加利福尼亚州森尼韦尔的分析生物技术公司(assaybiotechnologycompanyinc.,sunnyvale,ca)；马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔；马萨诸塞州剑桥的艾碧康；加利福尼亚州尔湾的生物技术公司(genetex,inc.,irvine,ca)；以及科罗拉多州利特顿的诺伍斯生物制剂公司获得。在特定实施例中，抗gpr18抗体包括：识别人类gpr18的氨基酸1-50的一部分的兔多克隆抗gpr18抗体；识别包括人类gpr18的氨基酸160-240的区域的兔多克隆抗gpr18抗体；识别包括人类gpr18的氨基酸100-180的区域的兔多克隆抗gpr18抗体；兔单克隆抗gpr18抗体克隆epr12359；以及识别包括人类gpr18的氨基酸140-190的区域的兔多克隆抗gpr18抗体。
在特定实施例中，甲酰基肽受体2(fpr2)靶向m1巨噬细胞。用于fpr2的市售抗体可以从瑞典布罗玛的阿特拉斯抗体(atlasantibodies,bromma,sweden)；加利福尼亚州旧金山的博欧特llc(biorbyt,llc,sanfrancisco,ca)；德克萨斯州卡蒂的云克隆公司(cloud-clonecorp.,katy,tx)；马萨诸塞州塞伦的美国生物生命科学(usbiologicallifesciences,salem,ma)；以及科罗拉多州利特顿的诺伍斯生物制剂公司获得。在特定实施例中，抗fpr2抗体包括：小鼠单克隆抗fpr2抗体克隆gm1d6；小鼠单克隆抗fpr2抗体克隆304405；重组抗fpr2抗体克隆rea663；以及识别包括fpr2的氨基酸300-350的区域的兔多克隆抗fpr2抗体。
在特定实施例中，靶向配体包括人类或人类化结合域(例如，scfv)，所述人类或人类化结合域包括可变轻链，所述可变轻链包括：包括rasqsvssyla(seqidno:98)的cdrl1序列、包括dassrat(seqidno:99)的cdrl2序列和包括qlrsnwppyt(seqidno:92)的cdrl3序列在特定实施例中，靶向配体包括人类或人类化结合域(例如，scfv)，所述人类或人类化结合域包括可变重链，所述可变重链包括：包括gygmh(seqidno:100)的cdrh1序列、包括viwydgsnkyyadsvkg(seqidno:101)的cdrh2序列和包括dtgdrffdy(seqidno:102)的cdrh3序列。这些反映结合cd64的cdr序列。
对于cd64具有特异性的多种抗体是本领域的普通技术人员已知的并且可以容易地表征序列、表位结合和亲和力。参见例如us7,378,504、wo2006/131953和wo2008/074867。用于cd64的市售抗体可以从明尼苏达州贝波特的安塞尔(ancell,bayport,mn)；马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔；马萨诸塞州剑桥的艾碧康；华盛顿州西雅图的生命期生物科学公司；以及科罗拉多州利特顿的诺伍斯生物制剂公司获得。在特定实施例中，抗cd64抗体包括：小鼠单克隆抗cd64抗体克隆体32-2；小鼠单克隆抗cd64抗体克隆umab74；大鼠单克隆抗cd64抗体克隆290322；小鼠单克隆抗cd64抗体克隆10.1；以及小鼠单克隆抗cd64抗体克隆1d3。
在特定实施例中，cd86靶向m1巨噬细胞。对于cd86具有特异性的多种抗体是本领域的普通技术人员已知的并且可以容易地表征序列、表位结合和亲和力。参见例如wo2004/076488、us8,378,082(mab2d4)和us6,346,248(ig10h6d10)。用于cd86的市售抗体可以从马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔；德国贝尔吉施格拉德巴赫的美天旎生物技术公司；华盛顿州西雅图的生命期生物科学公司；加利福尼亚州海格立斯的拜耳雷德；以及科罗拉多州利特顿的诺伍斯生物制剂公司获得。在特定实施例中，抗cd86抗体包括：小鼠单克隆抗cd86抗体克隆bu63；识别包括人类cd86的ala23到his244的区域的多克隆山羊抗cd86抗体；小鼠单克隆抗cd86抗体克隆it2.2；兔单克隆抗cd86抗体克隆bff-3；以及小鼠单克隆抗cd86抗体克隆c86/1146。
还可以使用可以促进淋巴细胞内化和/或转染的其它药剂，例如聚(亚乙基亚胺)/dna(pel/dna)复合物。
(b)带正电载体.在特定实施例中，载体包括使核酸凝结并且保护其免于酶降解的载体分子。如本文其它地方更详细地公开，载体可以包括带正电脂质和/或聚合物。特定实施例利用聚(β-氨基酯)(pbae(例如pbae447和/或具有1-(3-氨丙基)吡咯烷端帽)。在一些实施例中，pbae的分子量在4kda与6kda之间、在5kda与7kda之间、在6kda与8kda之间、在7kda与9kda之间、在8kda与10kda之间或在9kda与11kda之间。在一些实施例中，pbae的分子量为4kda、5kda、6kda、7kda、8kda、9kda或11kda。在一些实施例中，pbae的分子量小于4kda或大于11kda。在一些实施例中，pbae为pbae447。在一些实施例中，pbae447的分子量在4kda与6kda之间、在5kda与7kda之间、在6kda与8kda之间、在7kda与9kda之间、在8kda与10kda之间或在9kda与11kda之间。在一些实施例中，pbae447的分子量为4kda、5kda、6kda、7kda、8kda、9kda或11kda。在一些实施例中，pbae447的分子量小于4kda或大于11kda。
当通过凝胶渗透色谱法(gpc)评估时，聚合物(例如pbae)可以包括基质内的一定范围的聚合物长度，包括例如3,000-6,000或4,000-5,000的mn范围；10,000-20,000或14,500-21,000的mw范围；和/或55,000-77,000或60,000-72,000的mz范围。在特定实施例中，载体基质内的pbae通过gpc的分子量分布为mn＝4,000-5,000；mw＝14,500-21,000；以及mz＝60,000-72,000。
在一些实施例中，pbae与一或多个分子偶联。在一些实施例中，pbae与聚乙二醇偶联(以形成peg-pbae)。端基还可以在转染效率中起重要作用，其中含有叔胺的端帽是优选的。
带正电脂质的额外实例包括磷脂酸与氨基醇的酯，如二棕榈酰基磷脂酸或二硬脂酰基磷脂酸与羟基乙二胺的酯。带正电脂质的更特定实例包括例如马丁(martin)等人,现代制药设计(curr.pharma.design),11:375-394,2005中所描述的3β-[n-(n',n'-二甲氨基乙基)氨基甲酰基)胆固醇(dc-chol)；n,n'-二甲基-n,n'-二辛基溴化铵(ddab)；n,n'-二甲基-n,n'-二辛基氯化铵(ddac)；1,2-二油酰氧基丙基-3-二甲基-羟乙基氯化铵(dori)；1,2-二油酰氧基-3-[三甲铵基]-丙烷(dotap)；n-(1-(2,3-二油基氧基)丙基)-n,n,n-三甲基氯化铵(dotma)；二棕榈酰基磷脂酰胆碱(dppc)；1,2-二(十八基)氧基-3-[三甲铵基]-丙烷(dstap)；以及阳离子脂质。
可用作本公开内的载体的带正电聚合物的实例包括多元胺；聚有机胺(例如聚乙二亚胺(pei)、聚乙二亚胺纤维素)；聚(酰氨基胺)(pamam)；聚氨基酸(例如聚赖氨酸(pll)、聚精氨酸)；多糖(例如纤维素、聚葡糖、deae葡聚糖、淀粉)；精胺、亚精胺、聚(乙烯基苯甲基三烷基铵)、聚(4-乙烯基-n-烷基-吡啶鎓)、聚(丙烯酰基-三烷基铵)以及tat蛋白。
还可以使用任何浓度和任何比率的脂质与聚合物的掺合物。使用多种等级以不同比率掺合不同聚合物类型可以导致从贡献聚合物中的每一个借用的特征。还可以采用各种端基化学物质。
在不限制前述的情况下，本文所公开的特定实施例还可以利用由能够形成多孔网状物的任何材料构造的多孔纳米粒子。示例性材料包括金属、过渡金属和类金属。示例性金属、过渡金属和类金属包括锂、镁、锌、铝和二氧化硅。在特定实施例中，多孔纳米粒子包括二氧化硅。介孔二氧化硅的异常高表面积(超过1,000m2/g)使得能够在超过常规dna载体(如脂质体)的含量下的核酸负载。
载体基质可以形成多种不同形状，包括球状、立方形、锥形、长方形、圆柱形、环形等。核酸可以以多种方式包括于载体的孔中。举例来说，核酸可以囊封在多孔纳米粒子中。在其它方面，核酸可以与多孔纳米粒子的表面或多孔纳米粒子表面附近的紧密底层连接(例如，共价和/或非共价)。在特定实施例中，核酸可以并入到多孔纳米粒子中，例如整合到多孔纳米粒子的材料中。举例来说，核酸可以并入到聚合物纳米粒子的聚合物基质中。
(c)带正电载体内的核酸.上文关于car、tcr、car/tcr杂合体和巨噬细胞活化因子的表达描述了产生治疗蛋白表达的核酸。
(d)中性或带负电包衣.在特定实施例中，本文所公开的纳米粒子包括遮蔽囊封的核酸并且减少或防止偏离目标结合的包衣。通过将纳米粒子的表面电荷减少到中性或带负电来减少或防止偏离目标的结合。如本文其它地方更详细地公开，包衣可以包括中性或带负电基于聚合物和/或基于脂质体的包衣。特定实施例利用聚谷氨酸(pga)作为纳米粒子包衣。当使用时，包衣不必一定涂布整个纳米粒子。有利地是，包衣足以减少纳米粒子的偏离目标的结合。抗体片段(例如，fab或scfv)可以直接或间接连接到pga包衣。举例来说，抗体片段(例如，fab或scfv)可以使用例如与添加到fab或scfv序列的半胱氨酸反应的pga-马来酰亚胺化学偶合到pga。在一些实施例中，抗体通过连接子(例如，蛋白质或多肽连接子或化学连接子)偶合。
在特定实施例中，包衣为亲水性和/或不带电亲水性聚合物的致密表面包衣，其足以防止囊封的核酸在释放到所选细胞中之前暴露于环境。在特定实施例中，包衣覆盖纳米粒子的表面的至少80％或至少90％。在特定实施例中，包衣包括pga。
可以用作本公开的实施例内的包衣的不带电聚合物的实例包括聚乙二醇(peg)；聚(丙二醇)；和聚氧化烯共聚物(
不带电聚合物还包括两性离子聚合物。两性离子是指总体电荷电中性的特性，同时具有正电荷和负电荷。两性离子聚合物可以表现得类似于抵抗细胞和蛋白质粘附的细胞膜的区域。
两性离子聚合物包括两性离子组成单元，其包括具有两性离子基团的侧基(即，从聚合物主链侧接的基团)。示例性两性离子侧基包括羧基甜菜碱基(例如-ra-n+(rb)(rc)-rd-co2-，其中ra为将聚合物主链共价偶合到羧基甜菜碱基的阳离子氮中心的连接基团，rb和rc为氮取代基，并且rd为将阳离子氮中心共价偶合到羧基甜菜碱基的羧基的连接基团)。
带负电荷聚合物的实例包括海藻酸；甲酸多糖；羧甲基纤维素；羧甲基纤维素-半胱氨酸；角叉菜胶(例如，
在特定实施例中，本文所公开的聚合物可以包括“星形聚合物”，其是指两个或更多个从核延伸的聚合物分支的分支聚合物。核为一组具有两个或更多个官能团的原子，分支可以通过聚合从所述核延伸。
在特定实施例中，分支为两性离子或带负电的聚合分支。对于星形聚合物，可以通过水解、紫外线照射或加热将分支前驱物转化成两性离子或带负电聚合物。聚合物还可以通过可有效地聚合不饱和单体的任何聚合方法获得，所述聚合方法包括原子转移自由基聚合(atrp)、可逆加成片段化链转移聚合(raft)、光聚合、开环聚合(rop)、缩合、迈克尔加成(michaeladdition)、分支产生/增长反应或其它反应。
脂质体为包括至少一个同心脂质双层的微观囊泡。选择囊泡形成脂质来实现最终复合物的流动性或硬度的指定程度。在特定实施例中，脂质体提供脂质组合物，其为包围多孔纳米粒子的外层。
脂质体可以是中性(胆固醇)或双极的并且包括磷脂，如磷脂酰胆碱(pc)、磷脂酰乙醇胺(pe)、磷脂酰环己六醇(pi)和鞘磷脂(sm)，以及双极性脂质的其它类型，所述双极性脂质包括二油酰基磷脂酰乙醇胺(dope)，烃链长度在14-22范围内，并且是饱和的或具有一或多个双键c＝c。能够单独或与其它脂质组分组合产生稳定脂质体的脂质的实例为磷脂，如氢化大豆磷脂酰胆碱(hspc)、卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、溶血卵磷脂、溶血磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰环己六醇、鞘磷脂、脑磷脂、心磷脂、磷脂酸、脑苷脂、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(dspe)、二油酰基磷脂酰胆碱(dopc)、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(dppc)、棕榈酰油酰基磷脂酰胆碱(popc)、棕榈酰基油酰基磷脂酰乙醇胺(pope)和二油酰基磷脂酰乙醇胺4-(n-马来酰亚氨基-甲基)环己烷-1-甲酸酯(dope-mal)。可以变得并入到脂质体中的其它含非磷脂质包括十八胺、十二胺、十六胺、十四烷酸异丙酯、三乙醇胺-月桂基硫酸酯、烷基-芳基硫酸酯、乙酰基棕榈酸酯、甘油蓖麻油酸酯、十六基硬脂酸酯、两性丙烯酸聚合物、聚乙氧基化脂肪酸酰胺、ddab、二(十八烷基)二甲基氯化铵(dodac)、1,2-二肉豆蔻酰基-3-三甲基铵丙烷(dmtap)、dotap、dotma、dc-chol、磷脂酸(pa)、二棕榈酰磷脂酰甘油(dppg)、二油酰基磷脂酰甘油、dopg和二鲸蜡基磷酸酯。在特定实施例中，用于产生本文所公开的脂质体的脂质包括胆固醇、氢化大豆磷脂酰胆碱(hspc)和衍生的囊泡形成脂质peg-dspe。
形成脂质体的方法描述于例如美国专利第4,229,360号、第4,224,179号、第4,241,046号、第4,737,323号、第4,078,052号、第4,235,871号、第4,501,728号和第4,837,028号中，以及斯卓卡(szoka)等人,生物物理综述年鉴(ann.rev.biophys.bioeng.)9:467,1980；和霍普(hope)等人,化学物理脂类(chem.phys.lip.)40:89,1986中。
产生纳米粒子的其它示例性方法公开于us2018/0030153、us2017/0296676和wo2018/129270中，出于所有目的其公开内容以全文引用的方式并入本文中。
在特定实施例中，包衣是基于聚合物的，其中聚合物大小为5-100kda。在特定实施例中，包衣是基于聚合物的，其中聚合物大小为5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100kda。
在特定实施例中，pbae聚合物与核苷酸(例如，ivtmrna)以20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1、100:1或更大的比率混合以产生pbae-核苷酸聚合复合物。在特定实施例中，pbae聚合物与核苷酸(例如，ivtmrna)以60:1的比率混合以产生pbae-核苷酸聚合复合物。在特定实施例中，pbae-核苷酸聚合复合物可以与pga/二-甘露糖组合以形成纳米粒子。
本文所公开的纳米粒子的大小可以在广泛范围内变化，并且可以以不同方式，例如通过动态光散射和/或电子显微法测量。举例来说，本公开的纳米粒子可以具有100nm的最小尺寸。本公开的纳米粒子还可以具有等于或小于500nm、小于150nm、小于100nm、小于90nm、小于80nm、小于70nm、小于60nm、小于50nm、小于40nm、小于30nm、小于20nm或小于10nm的最小尺寸。在特定实施例中，纳米粒子可以具有5nm与500nm之间、10nm与100nm之间、20nm与90nm之间、30nm与80nm之间、40nm与70nm之间以及40nm与60nm之间的范围内的最小尺寸。在特定实施例中，尺寸为纳米粒子或经涂布的纳米粒子的直径。在特定实施例中，本公开的纳米粒子群体可以具有等于或小于500nm、小于100nm、小于90nm、小于80nm、小于70nm、小于60nm、小于50nm、小于40nm、小于30nm、小于20nm或小于10nm的平均最小尺寸。在特定实施例中，本公开的组合物中的纳米粒子群体的可以具有5nm与500nm之间、10nm与100nm之间、20nm与90nm之间、30nm与80nm之间、40nm与70nm之间以及40nm与60nm之间的范围内的平均直径。
(iv)组合物.本文所公开的纳米粒子可以调配成用于直接向个体投与的组合物，其中在体内进行选择性靶向。任选地，可以共同地将超过一种纳米粒子(即，含有不同乘客核酸的纳米粒子，编码不同治疗蛋白的纳米粒子)投与相同个体，无论是依序还是同时。
在特定实施例中，纳米粒子提供为组合物的一部分，所述组合物可以包括至少0.1％w/v或w/w的纳米粒子；至少1％w/v或w/w的纳米粒子；至少10％w/v或w/w的纳米粒子；至少20％w/v或w/w的纳米粒子；至少30％w/v或w/w的纳米粒子；至少40％w/v或w/w的纳米粒子；至少50％w/v或w/w的纳米粒子；至少60％w/v或w/w的纳米粒子；至少70％w/v或w/w的纳米粒子；至少80％w/v或w/w的纳米粒子；至少90％w/v或w/w的纳米粒子；至少95％w/v或w/w的纳米粒子；或至少99％w/v或w/w的纳米粒子。
本文所公开的组合物可以被调配成通过例如注射、吸入、输注、灌注、灌洗或摄取投与。本文所公开的组合物可以另外被调配用于通过导管输注，通过静脉内、肌肉内、瘤内、皮内、动脉内、结节内、淋巴管内、腹膜内、病灶内、前列腺内、阴道内、直肠内、局部、鞘内、囊泡内、经口和/或皮下投与，并且更确切地说通过静脉内、皮内、动脉内、结节内、淋巴管内、腹膜内、病灶内、阴道内、直肠内、局部、鞘内、瘤内、肌肉内、囊泡内、经口和/或皮下注射。
对于注射和输注，组合物可以被调配为如在缓冲液中的水溶液形式，所述缓冲液包括汉克氏溶液(hanks'solution)、林格氏溶液溶液(ringer'ssolution)或生理盐水。水溶液可以含有调配剂，如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，在使用之前，调配物可以呈用例如无菌无热原质水的适合的媒剂复原的冻干和/或粉末形式。
对于经口投与，组合物可以调配为片剂、丸剂、糖衣药丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液、悬浮液等形式。对于口服固体调配物，例如散剂、胶囊和片剂，适合的赋形剂包括粘合剂(黄芪胶、阿拉伯胶、玉米淀粉、明胶)；填充剂，如糖，例如乳糖、蔗糖、甘露糖醇和山梨糖醇；磷酸二钙、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁；纤维素制剂，如玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄芪胶、甲基纤维素、羟丙基甲基-纤维素、羧甲基纤维素钠，和/或聚乙烯吡咯烷酮(pvp)；造粒剂；以及结合剂。必要时，可以添加崩解剂，如玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸、交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂，或海藻酸或其盐，如海藻酸钠。必要时，固体剂型可以使用标准技术包覆糖衣或包覆肠衣。还可以使用调味剂，如胡椒薄荷、冬青油、樱桃味调料、橙味调料等。
对于通过吸入投与，组合物可以用适合的推进剂(例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它适合的气体)调配为来自加压包装或喷雾器的气雾剂喷雾。在加压气雾剂的情况下，剂量单位可以通过提供传递计量量的阀来确定。可以调配用于在吸入器或吹入器中使用的含有治疗性和适合的粉末基剂(如乳糖或淀粉)的粉末混合物的明胶胶囊和药筒。
本文所公开的任何组合物调配物可以宜包括任何其它药学上可接受的载剂，所述载剂包括不产生显著不利、过敏或胜过投与益处的其它不良反应(无论对于研究、预防和/或治疗性治疗)的那些载剂。示例性医药学上可接受的载剂和调配物公开于雷明顿药物科学(remington'spharmaceuticalsciences),第18版,马克印刷公司(mackprintingcompany),1990中。此外，可以制备调配物以满足美国fda局生物标准和/或其它相关外国管理机构所需要的无菌性、产热原性、一般安全性和纯度标准。
示例性一般使用的药学上可接受的载剂包括任何和所有膨胀剂或填充剂、溶剂或共溶剂、分散介质、包衣、表面活性剂、抗氧化剂(例如，抗坏血酸、甲硫氨酸、维生素e)、防腐剂、等渗剂、吸收延迟剂、盐、稳定剂、缓冲剂、螯合剂(例如，edta)、凝胶、粘合剂、崩解剂和/或润滑剂。
示例性缓冲剂包括柠檬酸盐缓冲剂、琥珀酸盐缓冲剂、酒石酸盐缓冲剂、反丁烯二酸盐缓冲剂、葡糖酸盐缓冲剂、草酸盐缓冲剂、乳酸盐缓冲剂、乙酸盐缓冲剂、磷酸盐缓冲剂、组氨酸盐缓冲剂和/或三甲胺盐。
示例性防腐剂包括苯酚、苯甲醇、间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、十八烷基二甲基苯甲基氯化铵、苯甲烃铵卤化物、氯化六羟季铵、对羟苯甲酸烷酯(如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯)、儿茶酚、间苯二酚、环己醇和3-戊醇。
示例性等渗剂包括多羟基糖醇，包括含三羟基或更多羟基的糖醇，如甘油、赤藻糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇或甘露糖醇。
示例性稳定剂包括有机糖、多羟基糖醇、聚乙二醇；含硫还原剂、氨基酸、低分子量多肽、蛋白质、免疫球蛋白、亲水性聚合物或多糖。
组合物也可以调配为积存制剂形式。积存制剂可以用适合的聚合或疏水性材料(例如，于可接受的油中的乳液形式)或离子交换树脂调配，或调配为微溶性衍生物，例如微溶性盐形式。
另外，组合物可以利用含有至少一种活性成分的固体聚合物的半渗透基质调配为持续释放系统形式。已经确定多种持续释放材料并且是本领域普通技术人员熟知的。取决于持续释放系统的化学性质，所述持续释放系统可以在投与两周到1个月之后释放活性成分。在特定实施例中，可以利用持续释放系统，例如如果人类患者错过每周投与。本文所描述的纳米粒子的特定实施例的半衰期为4小时。为了维持释放，纳米粒子可以囊封在随时间推移缓慢释放纳米粒子的水凝胶或生物可降解聚合物内。mrna自身在例如在pbae聚合物内缩合时是稳定的。
(v)使用方法.本文所公开的方法包括用本文所公开的组合物治疗个体(包括人类、兽医学动物、家畜和研究动物)。如所指示，组合物可以治疗癌症到感染性疾病范围内的多种不同病状。
治疗有效治疗。治疗个体包括传递治疗有效量的一或多种组合物。治疗有效量可以提供有效量、防治性治疗和/或治疗性治疗。
“有效量”是在个体内产生所要生理学变化所必需的化合物的量。通常出于研究目的而投与有效量。举例来说，本文所公开的有效量在向个体投与之后通过所选细胞类型引起核酸或蛋白质(如治疗蛋白)的表达(例如瞬时表达)。作为另一个实例，向个体投与有效量的细胞引诱剂导致向投与部位募集特定细胞类型(例如，t细胞)。
“防治性治疗”包括向不呈现疾病或病状的征兆或症状或仅呈现疾病或病状的早征兆或症状的个体投与的治疗，使得治疗是出于减少、预防或降低疾病或病状进一步发展的风险的目的而投与。因此，防治性治疗充当针对疾病或病症的预防性治疗。疫苗是预防性治疗的一个实例。
在特定实施例中，投与预防性治疗以治疗病毒感染，如hiv。举例来说，组合物可以在处于罹患病毒感染风险下或已暴露于病毒的个体中预防性地投与，以预防、降低或延迟病毒感染或疾病的发展。举例来说，组合物可以向可能已暴露于病毒(例如hiv)的个体或处于暴露于病毒的高风险下的个体投与。
“治疗性治疗”包括向呈现疾病或病状的症状或征兆的个体投与的治疗并且出于减少或消除疾病或病状的那些征兆或症状的目的而向个体投与。“治疗治疗”引起个体的所需治疗益处。
预防性和治疗性治疗不需要完全预防或治愈疾病或病状，但也可以提供部分益处。
在癌症的情形下，治疗有效量可以减少肿瘤细胞的数目、减少癌转移的数目、减少肿瘤体积、增加预期寿命、诱导癌细胞的细胞凋亡、诱导癌细胞死亡、诱导癌细胞中的化疗或放射敏感性、抑制癌细胞附近的血管生成、抑制癌细胞增殖、抑制肿瘤生长、预防癌转移、延长个体的寿命、减少癌症相关的疼痛、减少癌转移的数目和/或减少癌症在治疗之后的复发或再出现。
在病毒的情形下，治疗有效量可以减少病毒感染细胞的数目，并且减少与病毒感染相关的一或多种症状，如发热、发冷、呕吐、关节疼痛等。
在hiv的情形下，治疗有效量可以减少hiv感染的细胞的数目；增加个体的t细胞数目；减少感染的发生率、频率或严重程度；增加预期寿命；延长个体的寿命和/或减少hiv相关的疼痛或认知障碍。
对于投与，可以基于体外分析法和/或动物模型研究的结果初始地估算治疗有效量(在本文中也称为剂量)。这类信息可以用于更准确地确定适用于所关注的个体的剂量。
向特定个体投与的实际剂量可以由医师、兽医或研究人员考虑以下参数来确定：如物理和生理学因素，包括个体的目标、体重、病状的严重程度、疾病的类型、先前或同时发生的治疗性干预、原发症以及投与途径。
组合物的适用剂量可以包括0.1μg/kg到5μg/kg、或0.5μg/kg到1μg/kg、或1mg/kg到1000mg/kg或更大。
获得治疗目标或作用的治疗有效量可以通过在治疗方案的过程期间投与单次剂量或多次剂量来实现。这类剂量可以例如每日、每隔一天、每隔4天、每隔2-8天、每隔3-10天、每隔5-10天、每隔6-9天、每周或每两星期投与。任选地，剂量之间的时间可以变化。在一些实施例中，单次剂量将提供所需治疗效果；在其它实施例中，将需要多次剂量。在特定实施例中，治疗方案的有效性和对一或多个额外剂量的需要可以通过测定、追踪或测量由瞬时表达的治疗蛋白或核酸介导的表型效应来监测。
在特定实施例中，一旦蛋白质或核酸(例如治疗蛋白)的表达水平低于阈值，治疗医师就可以确定是否有必要用纳米粒子进行额外治疗或是否已经实现治疗目标，并且此时并不需要用纳米粒子进行额外治疗。在特定实施例中，如根据定量pcr或流式细胞测量术所测量，阈值以下可以是峰值表达水平的50％、45％、40％、35％、34％、33％、32％、31％、30％、29％、28％、27％、26％、25％、24％、23％、22％、21％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小。在特定实施例中，如根据定量pcr所测量，阈值以下可以是峰值表达水平的15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小。在特定实施例中，如根据流式细胞测量术所测量，阈值可以是表达蛋白质或核酸的纳米粒子转染的t细胞的35％、34％、33％、32％、31％、30％、29％、28％、27％、26％、25％、24％、23％、22％、21％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小。在特定实施例中，阈值可以是表达治疗蛋白的外周血中cd8+t细胞的20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小。在特定实施例中，阈值可以是在体外活细胞分析中获得的肿瘤细胞计数，以测量ivtmrna转染的t细胞选择性地裂解抗原阳性目标细胞的能力。
在特定实施例中，一旦蛋白质或核酸(例如治疗蛋白)的表达水平低于可检测限值，治疗医师就可以确定是否有必要用纳米粒子进行额外治疗或是否已经实现治疗目标，并且此时并不需要用纳米粒子进行额外治疗。
在特定实施例中，当蛋白质或核酸(例如治疗蛋白)的表达不可以通过定量pcr检测到时，所述蛋白质或核酸的表达低于可检测限值。在特定实施例中，如通过流式细胞测量术所测量，可检测限值可以示表达蛋白质或核酸的个体的t细胞的1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、0.005％、0.001％或更小。在特定实施例中，可检测限值可以是表达治疗蛋白的外周血中的cd8+t细胞的百分比。在特定实施例中，可检测限值可以是表达蛋白质或核酸的个体的外周血中的cd8+t细胞的2％、1.5％、1％、0.5％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、0.005％、0.001％或更小。
在特定实施例中，本公开的方法产生与离体接触纳米载体的t细胞的移植至少约相同的功效。在特定实施例中，至少约相同的功效包括比较经纳米粒子转染的t细胞(即，经ivtmrna转染的t细胞，其中ivtmrna编码治疗蛋白)的功能与用相同对应治疗蛋白离体工程改造的t细胞的功能。在特定实施例中，通过病毒方法转导离体工程改造的t细胞。在特定实施例中，比较的功能是体外分析中的细胞杀死。在特定实施例中，与用相同的对应治疗蛋白离体工程改造的t细胞相比，至少约相同的功效包括通过经纳米粒子转染的t细胞杀死抗原阳性目标细胞时无统计学显著差异。在特定实施例中，比较的功能是体外分析中的细胞因子产生。在特定实施例中，与用相同的对应治疗蛋白离体工程改造的t细胞相比，至少约相同的功效包括通过经纳米粒子转染的t细胞对包括il-2、tnf-α和ifn-γ的细胞因子产生的含量无统计学显著差异。在特定实施例中，比较可以包括肿瘤大小或体内生长。在特定实施例中，与接受包括用相同的对应治疗蛋白转导的t细胞的过继性t细胞的个体相比，至少约相同的功效包括用编码治疗蛋白的ivtmrna灌输的个体中肿瘤大小或生长无统计学显著差异。在特定实施例中，比较可以包括个体的存活率。在特定实施例中，与接受包括用相同的对应治疗蛋白转导的t细胞的过继性t细胞疗法的个体相比，至少约相同的功效包括用编码治疗蛋白的ivtmrna灌输的个体的存活率无统计学显著差异。
观测结果中的统计显著性可以通过本领域的普通技术人员已知的统计方法来确定。在特定实施例中，无统计学显著差异是指p值>0.05或>0.01。
与所选细胞引诱剂一起的治疗有效治疗。在特定实施例中，传递核酸以通过所选细胞类型提供治疗蛋白的表达的纳米粒子可以与细胞引诱剂共同投与。“与……一起”意谓在临床上相关的时间窗内投与纳米粒子和细胞引诱剂。“临床上相关的时间窗”意谓在一定时间段内，基于投与纳米粒子和细胞引诱剂而看到的增加的治疗效果，而不是基于单独投与纳米粒子或细胞引诱剂发现的治疗效果。通常，细胞引诱剂在纳米粒子之前投与，但如果临床上相关的时间窗准许在纳米粒子之后投与细胞引诱剂，那么此时序不是必需的。
在特定实施例中，在投与表达纳米粒子之前，向个体投与(局部或全身性地)细胞引诱剂至少一小时并且至多两周。举例来说，在投与纳米粒子组合物之前，投与细胞引诱剂至少一小时、至少3小时、至少6小时、至少9小时、至少12小时、至少24小时或超过24小时。在某些实施例中，预处理在投与纳米粒子之前一小时与24之间，或在投与纳米粒子之前一小时与七天之间进行。在特定实施例中，细胞引诱剂可以与t细胞程序化纳米粒子共传递。
治疗有效治疗与巨噬细胞刺激组合物一起投与。在特定实施例中，含有瞬时表达的mrna的纳米粒子的传递可以与另一治疗策略一起进行，如用表达(由dna或mrna)不同治疗蛋白的第二靶向纳米粒子治疗。举例来说，一或多种巨噬细胞刺激(巨噬细胞活化)纳米粒子组合物用作示例第二治疗性组合物。应了解，还考虑额外类型的靶向纳米粒子以及额外非纳米粒子治疗剂的共同投与。
举例来说，本文所描述的纳米粒子(包括编码治疗蛋白的ivtmrna，如疾病特异性受体)可以与刺激巨噬细胞或克服所治疗的个体的一或多个巨噬细胞的肿瘤抑制的纳米粒子组合物一起向个体投与(同时或依序)。这类巨噬细胞活化组合物自身可以是包括编码逆转或减少巨噬细胞免疫抑制的治疗蛋白(例如转录因子)的核酸的纳米粒子。这类巨噬细胞活化纳米粒子的实例类似于本文所描述的纳米粒子(例如其具有正核和中性或带负电表面，并且传递用于在目标细胞中表达的一或多种核苷酸)来构造。特定实施例利用粒子向细胞提供编码基因的核苷酸，所述基因编码活化调节因子，如调节巨噬细胞极化的转录因子(例如干扰素调节因子(irf))和/或激酶(例如，ikkβ)。巨噬细胞极化是巨噬细胞的生理学活性改变的高度动态过程。在大多数肿瘤中，tam展现免疫抑制表型，其可以是“m2”表型。相比之下，活化的巨噬细胞可以展现产生肿瘤细胞杀死的“m1”表型。本文所公开的特定实施例将促进肿瘤的tam的极化逆转到肿瘤杀死巨噬细胞中。这种作用通过诱导发炎性细胞因子、活化其它免疫细胞和吞噬肿瘤细胞来改善肿瘤内的免疫抑制环境。
举例来说，在一些实施例中，巨噬细胞刺激的纳米粒子中的一或多种乘客核酸编码(作为dna或ivtmrna)与激酶ikkβ组合的转录因子干扰素调节因子5(irf5)。这类粒子可以包括靶向配体的肿瘤相关的巨噬细胞(tam)以引导tam对粒子的更大的选择性吸收。作为一个实例，tam表达cd206，即可以通过在粒子表面上包括甘露糖来靶向的细胞表面受体。可以靶向的其它tam细胞表面受体包括早期生长反应蛋白2(egr2)、cd163、cd23、白细胞介素(il)27ra、clec4a、cd1a、cd1b、cd93、cd226、il13-ra1、il-4r、ii型il-1r、ii型诱铒il-1r、il-10r、巨噬细胞清除受体a和b、ym-1、ym-2、低密度受体相关的蛋白质1(lrp1)、il-6r、cxcr1/2和pd-l1。
特定实施例包括将纳米粒子组合物重复传递到患者，所述纳米粒子组合物靶向患者体内的所选细胞并且通过所选细胞引起治疗蛋白或核酸的表达。在这种情形下，瞬时表达是指在核酸转移到一或多个细胞中之后的短时间内治疗蛋白的表达。这类表达可以以各种本领域公认的方式监测，包括通过检测和/或定量细胞的表型，所述表型是由所表达的治疗蛋白或核酸产生或影响。细胞的表型是指其物理特性和/或其在体内的位置。在特定实施例中，研究人员或临床医师基于其提供的瞬时表达曲线选择用于传递的纳米粒子。
如先前所指示，在特定实施例中，瞬时表达曲线持续12小时到15天；18小时到12天；20小时到14天；24小时到10天、24小时到8天或30小时到7天。特别考虑的是在各种实施例中瞬时表达不长于14天。举例来说，在特定实施例中，瞬时表达是持续不长于12天、不长于10天、不长于9天、不长于8天或不长于7天的可检测表达。在需要较长表达的实施例中，提供治疗蛋白的瞬时表达的纳米粒子可以以重复剂量传递到个体，例如每5-10天(例如，每7天)进行传递。
(vi)试剂盒.活性组分的组合还可以提供作为试剂盒。试剂盒可以包括容器，所述容器包括一或多种如本文所描述的表达纳米粒子，任选地以及一或多种用于组合疗法的药剂。举例来说，一些试剂盒将包括至少一种表达纳米粒子，以及一定量的至少一种巨噬细胞刺激组合物(其自身可以是含有编码例如一定量的至少一种巨噬细胞刺激蛋白质的mrna或dna分子的纳米粒子)。其它试剂盒将包括一定量的至少一种表达纳米粒子以及一定量的至少一种细胞引诱剂，如t细胞引诱剂。试剂盒中的任何活性组分可以以预先测量的剂量提供，尽管这不是必需的；并且预期某些试剂盒将包括多于一剂，包括例如当试剂盒用于需要投与多于一剂的所需表达纳米粒子的方法时。
一般来说，包括两种或更多种活性组分的试剂盒将包括旨在与本文所描述的方法中的一种组合使用的组分。举例来说，将在含有纳米粒子的试剂盒中提供巨噬细胞活化化合物，所述纳米粒子经设计以在肿瘤或将受益于活化巨噬细胞的存在的另一部位中提供表达。类似地，如果试剂盒具备细胞引诱剂，那么包括于试剂盒中的至少一种纳米粒子将在一些情况下靶向由所述细胞引诱剂引诱的细胞类型。
试剂盒还可以包括呈由调节药物或生物产品的制造、使用或销售的政府机构所规定的形式的注意事项，所述注意事项反映制造、使用或销售的机构对用于人类投与的认可。注意事项可以陈述所提供的活性成分，所述活性成分可以向个体投与。试剂盒可以包括用于使用试剂盒的其它说明书，例如关于用于投与的多核苷酸(pn)或纳米粒子(np)的制备；相关废物的恰当处置等。所述说明书可以呈印刷说明书的形式提供于试剂盒内或所述说明书可以印刷于试剂盒自身的一部分上。说明书可以呈表单、手册、彩页、cd-rom或计算机可读装置形式，或可以提供有关在远端位置处的说明书的指导，例如网站。在特定实施例中，试剂盒还可以包括有效使用试剂盒所需的必要医疗用品中的一些或全部，如注射器、安瓿、管、面罩、注射帽、海绵、无菌粘合带、洗必泰(chloraprep)、手套等。可以改变本文所描述的试剂盒中的任一个的内含物。试剂盒的说明书将直接使用活性成分以实现本文所描述的新临床用途。
(vii)示例性实施例.
1.一种用于治疗有需要的个体的方法，其包括向所述个体投与：
治疗有效量的纳米粒子，其包括：
(i)囊封在带正电载体基质内的多核苷酸(例如，合成mrna，如体外转录(ivt)mrna)，其中所述多核苷酸编码蛋白质和/或核酸；
(ii)中性或带负电包衣；以及
(iii)至少一种细胞靶向配体，其从所述包衣的表面延伸，所述细胞靶向配体对所选细胞具有特异性；
其中所述纳米粒子选择性地并入到所述个体内的所选细胞中，使得所述所选细胞由多核苷酸瞬时表达蛋白质，从而治疗所述有需要的个体。
2.根据实施例1所述的方法，其进一步包括向所述个体投与治疗有效量的细胞引诱剂。
3.根据实施例2所述的方法，其中所述细胞引诱剂为t细胞引诱剂。
4.根据实施例3所述的方法，其中所述t细胞引诱剂为ccl21或ip10。
5.根据实施例1到4中任一实施例所述的方法，其中所述蛋白质包括疾病特异性受体，所述疾病特异性受体包括细胞表面受体。
6.根据实施例5所述的方法，其中所述疾病特异性受体包括嵌合抗原受体(car)、t细胞受体(tcr)或其组合。
7.根据实施例5或6所述的方法，其中治疗蛋白包括白血病特异性car、乙型肝炎病毒(hbv)核抗原特异性hb核18-27tcr或前列腺肿瘤特异性抗ror1car。
8.根据实施例1到7中任一项实施例所述的方法，其中所述细胞靶向配体选择性地结合淋巴细胞并且引发受体诱导的内吞作用。
9.根据实施例1到8中任一实施例所述的方法，其中所述蛋白质的表达是持续不长于14天、不长于12天、不长于10天、不长于9天、不长于8天、不长于7天、不长于6天或不长于5天的表达。
10.根据实施例1到9中任一实施例所述的方法，其中向所述个体投与所述治疗有效量的纳米粒子包括投与两剂或更多剂的所述纳米粒子。
11.根据实施例10所述的方法，其中所述两剂或更多剂每5-10天、或每6-8天、或每7天投与。
12.根据实施例1到11中任一实施例所述的方法，其中所述个体需要治疗癌症或感染性疾病。
13.根据实施例1到12中任一实施例所述的方法，其中投与所述纳米粒子包括通过导管注射或输注(a)到肿瘤中或肿瘤附近(瘤内)；(b)到静脉中(静脉内)；或(c)到腹膜中(腹膜内)。
14.根据实施例3到13中任一实施例所述的方法，其中投与所述t细胞引诱剂包括通过导管注射或输注到肿瘤中或肿瘤附近(瘤内)、静脉内注射或输注，或通过导管腹膜内注射或输注。
15.根据实施例2到14中任一实施例所述的方法，其中在投与所述纳米粒子之前向所述个体投与所述细胞引诱剂。
16.根据实施例2到14中任一实施例所述的方法，其中在投与所述纳米粒子之前不超过一小时、之前不超过3小时、之前不超过6小时、之前不超过12小时、或之前不超过24小时时投与所述细胞引诱剂。
17.根据实施例16所述的方法，其中(a)仅在第一剂所述纳米粒子之后；(b)在至少两剂所述纳米粒子的每一剂之后；或(c)在每一剂所述纳米粒子之后投与所述细胞引诱剂。
18.根据实施例1到17中任一实施例所述的方法，其进一步包括向所述个体投与巨噬细胞刺激组合物。
19.根据实施例18所述的方法，其中所述巨噬细胞刺激组合物包括靶向巨噬细胞并且能够引导组合激酶ikkβ的转录因子干扰素调节因子5(irf5)表达的纳米粒子。
20.根据实施例1到19中任一实施例所述的方法，其中所述载体包括带正电脂质或聚合物。
21.根据实施例20所述的方法，其中所述带正电聚合物包括聚(β-氨基酯)(pbae)、聚(l-赖氨酸)、聚(乙烯亚胺)(pei)、聚(酰胺基胺)树枝状聚合物(pama)、聚(胺-共聚-酯)、聚(甲基丙烯酸二甲氨基乙酯)(pdmaema)、壳聚糖、聚(l-丙交酯-共聚-l-赖氨酸)、聚[α-(4-氨基丁基)-l-乙醇酸](paga)或聚(4-羟基-l-脯氨酸酯)(php)。
22.根据实施例1到21中任一实施例所述的方法，其中所述包衣包括中性或带负电脂质或聚合物。
23.根据实施例22所述的方法，其中所述中性或带负电包衣包括聚谷氨酸(pga)、聚(丙烯酸)、海藻酸或胆固醇基半琥珀酸酯/1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺。
24.根据实施例22所述的方法，其中所述中性或带负电包衣包括两性离子聚合物。
25.根据实施例22到24中任一实施例所述的方法，其中所述中性或带负电包衣包括脂质体。
26.根据实施例25所述的方法，其中所述脂质体包括1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(dotap)、1,2-二-o-十八烯基-3-三甲基铵丙烷(dotma)、3β-[n-(n',n'-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆固醇(dc-chol)、二(十八烷基)-酰氨基甘氨酰基精胺(dogs)、胆固醇、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(dope)或1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dopc)。
27.根据实施例1到26中任一实施例所述的方法，其中所述所选细胞靶向配体选择性结合cd4和/或cd8。
28.根据实施例1到27中任一实施例所述的方法，其中所述所选细胞靶向配体包括选自cd4抗体和/或cd8抗体的结合域。
29.根据实施例1到28中任一实施例所述的方法，其中所述所选细胞靶向配体包括选自cd4抗体和/或cd8抗体的scfv片段的结合域。
30.根据实施例1到29中任一实施例所述的方法，其中所述载体包括pbae(例如pbae447和/或具有1-(3-氨丙基)吡咯烷端帽)。
31.根据实施例1到30中任一实施例所述的方法，其中所述包衣包括pga。
32.根据实施例1到31中任一实施例所述的方法，其中所述所选细胞靶向配体包括选自cd4抗体和/或cd8抗体的结合域；所述载体包括pbae(例如pbae447和/或具有1-(3-氨丙基)吡咯烷端帽))；并且所述包衣包括pga。
33.一种合成纳米粒子，其包括：
(i)多核苷酸(例如，合成mrna，如ivtmrna)，其编码蛋白质或核酸并且囊封在带正电载体内；
(ii)中性或带负电包衣，其在所述载体的外表面上；以及
(iii)所选细胞靶向配体，其从所述包衣的表面延伸；
其中所述蛋白质可以选自hbv特异性tcr、白血病特异性抗cd19car或前列腺肿瘤特异性抗ror1car，其中所述car的胞内域可以是1928z或4-1bbz。
34.根据实施例33所述的合成纳米粒子，其中所述载体包括带正电脂质或聚合物。
35.根据实施例34所述的合成纳米粒子，其中所述带正电脂质或聚合物包括pbae、聚(l-赖氨酸)、pei、pamam、聚(胺-共聚-酯)、pdmaema、壳聚糖、聚(l-丙交酯-共聚-l-赖氨酸)、paga或php。
36.根据实施例33或34所述的合成纳米粒子，其中所述包衣包括中性或带负电脂质或聚合物。
37.根据实施例36所述的合成纳米粒子，其中所述中性或带负电包衣包括pga、聚(丙烯酸)、海藻酸或胆固醇基半琥珀酸酯/1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺。
38.根据实施例36所述的合成纳米粒子，其中所述中性或带负电包衣包括两性离子聚合物。
39.根据实施例36到38中任一实施例所述的合成纳米粒子，其中所述中性或带负电包衣包括脂质体。
40.根据实施例39所述的合成纳米粒子，其中所述脂质体包括dotap、dotma、dc-chol、dogs、胆固醇、dope或dopc。
41.根据实施例33到40中任一实施例所述的合成纳米粒子，其中所述所选细胞靶向配体选择性结合cd4和/或cd8。
42.根据实施例33到41中任一实施例所述的合成纳米粒子，其中所述所选细胞靶向配体包括选自cd4抗体和/或cd8抗体的结合域。
43.根据实施例33到42中任一实施例所述的合成纳米粒子，其中所述所选细胞靶向配体包括选自cd4抗体和/或cd8抗体的scfv片段的结合域。
44.根据实施例33到43中任一实施例所述的合成纳米粒子，其中所述载体包括pbae(例如pbae447和/或具有1-(3-氨丙基)吡咯烷端帽)。
45.根据实施例33到44中任一实施例所述的合成纳米粒子，其中所述包衣包括pga。
46.根据实施例33到45中任一实施例所述的合成纳米粒子，其中所述所选细胞靶向配体包括选自cd4抗体和/或cd8抗体的结合域；所述载体包括pbae(例如pbae447和/或具有1-(3-氨丙基)吡咯烷端帽))；并且所述包衣包括pga。
47.一种组合物，其包括根据实施例33到46中任一实施例所述的合成纳米粒子。
48.一种治疗有需要的个体的方法，其包括向所述有需要的个体投与治疗有效量的根据实施例47所述的组合物，从而治疗所述有需要的个体。
49.根据实施例48所述的方法，其进一步包括在投与所述纳米粒子或组合物之前向所述个体投与t细胞引诱剂。
50.一种用于治疗有需要的个体的方法，其包括
选择纳米粒子，其在向所述个体投与之后通过所选细胞类型引起蛋白质或核酸表达，以及
向所述个体投与治疗有效量的所选纳米粒子，从而治疗所述有需要的个体，其中所述蛋白质或核酸的所述表达在投与10天内低于可检测限值。
51.根据实施例50所述的方法，其中所述蛋白质或核酸的所述表达在投与7天内低于所述可检测限值。
52.根据实施例50或51所述的方法，其进一步包括向所述个体投与第二治疗有效量的所述所选纳米粒子。
53.根据实施例52所述的方法，其中所述第二治疗有效量的所述投与在所述蛋白质或核酸的表达已降到低于所述可检测限值之后发生。
54.根据实施例52所述的方法，其中所述第二治疗有效量的所述投与在所述蛋白质或核酸的表达已降到低于所述可检测限值之前发生。
55.根据实施例52所述的方法，其中所述第一治疗有效量和所述第二治疗有效量相隔5天、相隔6天、相隔7天、相隔8天、相隔9天或相隔10天投与。
56.根据实施例50到55中任一实施例所述的方法，其中所述投与包括全身性或局部投与。
57.根据实施例56所述的方法，其中所述投与包括在肿瘤部位处的局部投与。
58.根据实施例50到57中任一实施例所述的方法，其中投与包括通过导管注射或输注(a)到肿瘤中或附近；(b)到静脉中；或(c)到腹膜中。
59.根据实施例50到58中任一实施例所述的方法，其中所述蛋白质包括疾病特异性受体，所述疾病特异性受体包括细胞表面受体。
60.根据实施例59所述的方法，其中所述疾病特异性受体包括car、tcr或其杂合体。
61.根据实施例50到60中任一实施例所述的方法，其中所述治疗蛋白包括hbv特异性tcr、白血病特异性抗cd19car或前列腺肿瘤特异性抗ror1car，其中所述car的胞内域可以是1928z或4-1bbz。
62.根据实施例50到61中任一实施例所述的方法，其中所述蛋白质包括巨噬细胞刺激蛋白。
63.根据实施例62所述的方法，其中所述巨噬细胞刺激蛋白包括与所述激酶ikkβ组合的转录因子irf5。
64.根据实施例62所述的方法，其中所述巨噬细胞刺激蛋白包括一或多个选自以下的irf：irf5、irf1、irf3、irf7、irf8及/或irf7与irf3的融合物。
65.根据实施例64所述的方法，其中所述irf7/irf3融合蛋白包括seqidno:39。
66.根据实施例63到65中任一实施例所述的方法，其中所述一或多个irf缺乏功能性自抑制域。
67.根据实施例63到66中任一实施例所述的方法，其中所述一或多个irf缺乏功能性核输出信号(nes)。
68.根据实施例64所述的方法，其中所述一或多个irf是选自与seqidno:25-41具有>90％、>95％或大于98％一致性的序列。
69.根据实施例64所述的方法，其中所述一或多个irf是选自seqidno:25-31的irf5。
70.根据实施例69所述的方法，其中irf5包括具有一或多个选自s156d、s158d和t160d的突变的seqidno:25或seqidno:27。
71.根据实施例69所述的方法，其中irf5包括具有一或多个选自t10d、s158d、s309d、s317d、s451d和s462d的突变的seqidno:26。
72.根据实施例69所述的方法，其中irf5包括具有一或多个选自s425d、s427d、s430d和s436d的突变的seqidno:28。
73.根据实施例64所述的方法，其中所述一或多个irf是选自seqidno:32和36的irf1。
74.根据实施例64所述的方法，其中所述一或多个irf是选自seqidno:35、40和41的irf8。
75.根据实施例74所述的方法，其中irf8包括具有k310r突变的seqidno:35。
76.根据实施例63到75中任一实施例所述的方法，其中经编码ikkβ是选自与seqidno:42-46具有>90％、>95％或大于98％一致性的序列。
77.根据实施例63到75中任一实施例所述的方法，其中所述经编码ikkβ是选自seqidno:42-46。
78.根据实施例50到77中任一实施例所述的方法，其中所述治疗蛋白包括糖皮质激素诱导的亮氨酸拉链(gilz)。
79.根据实施例50到78中任一实施例所述的方法，其中所选择和所投与的纳米粒子<130nm。
80.根据实施例50到79中任一实施例所述的方法，其中所述所选择和所投与的纳米粒子包括：
(i)囊封在带正电载体基质内的合成mrna，其中所述合成mrna编码治疗蛋白；
(ii)中性或带负电包衣；以及
(iii)至少一种所选细胞靶向配体，其从所述包衣的表面延伸，所述所选细胞靶向配体特异性结合所述所选细胞类型上的标记。
81.根据实施例80所述的方法，其中所述合成mrna包括ivtmrna。
82.根据实施例80或81所述的方法，其中所述带正电载体基质包括带正电脂质或聚合物。
83.根据实施例82所述的方法，其中所述带正电脂质或聚合物包括pbae、聚(l-赖氨酸)、pei、pamam、聚(胺-共聚-酯)、pdmaema、壳聚糖、聚(l-丙交酯-共聚-l-赖氨酸)、paga或php。
84.根据实施例80到83中任一实施例所述的方法，其中所述带正电聚合物包括pbae(例如pbae447和/或具有1-(3-氨丙基)吡咯烷端帽)。
85.根据实施例80到84中任一实施例所述的方法，其中所述中性或带负电包衣包衣包括pga、聚(丙烯酸)、海藻酸或胆固醇基半琥珀酸酯/1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺。
86.根据实施例80到85中任一实施例所述的方法，其中所述中性或带负电包衣包括pga。
87.根据实施例80到85中任一实施例所述的方法，其中所述中性或带负电包衣包括两性离子聚合物。
88.根据实施例80到85中任一实施例所述的方法，其中所述中性或带负电包衣包括脂质体。
89.根据实施例88所述的方法，其中所述脂质体包括dotap、dotma、dc-chol、dogs、胆固醇、dope或dopc。
90.根据实施例80到89中任一项实施例所述的方法，其中所述细胞靶向配体选择性地结合淋巴细胞并且引发受体诱导的内吞作用。
91.根据实施例80到90中任一实施例所述的方法，其中所述所选细胞靶向配体选择性结合cd4和/或cd8。
92.根据实施例80到91中任一实施例所述的方法，其中所述所选细胞靶向配体包括选自cd4抗体和/或cd8抗体的结合域。
93.根据实施例80到92中任一实施例所述的方法，其中所述所选细胞靶向配体包括选自cd4抗体和/或cd8抗体的scfv片段的结合域。
94.根据实施例80到93中任一实施例所述的方法，其中所述所选细胞靶向配体包括选自cd4抗体和/或cd8抗体的结合域；所述载体包括pbae(例如pbae447和/或具有1-(3-氨丙基)吡咯烷端帽))；并且所述包衣包括pga。
95.根据实施例80到89中任一实施例所述的方法，其中所述所选细胞靶向结合cd206、cd163或cd23。
96.根据实施例80到89中任一实施例所述的方法，其中所述所选细胞靶向配体包括二-甘露糖。
97.根据实施例80到89中任一实施例所述的方法，其中所述所选细胞靶向结合cd38、g蛋白偶合受体18(gpr18)、甲酰基肽受体2(fpr2)、cd64或cd68。
98.根据实施例50到97中任一实施例所述的方法，其进一步包括向所述个体投与治疗有效量的细胞引诱剂。
99.根据实施例98所述的方法，其中所述细胞引诱剂包括t细胞引诱剂。
100.根据实施例99所述的方法，其中所述t细胞引诱剂包括ccl21或ip10。
101.根据实施例99或100所述的方法，其中所述t细胞引诱剂包括ccl1、ccl2、ccl17、ccl22、cxcl9、cxcl10或cxcl11。
102.根据实施例98到101中任一实施例所述的方法，其中所述细胞引诱剂包括单核细胞/巨噬细胞引诱剂。
103.根据实施例102所述的方法，其中所述单核细胞/巨噬细胞引诱剂包括ccl2、ccl3、ccl5、ccl7、ccl8、ccl13、ccl17或ccl22。
104.根据实施例98到103中任一实施例所述的方法，其中所述细胞引诱剂包括肥大细胞引诱剂。
105.根据实施例104所述的方法，其中所述肥大细胞引诱剂包括ccl2或ccl5。
106.根据实施例98到105中任一实施例所述的方法，其中所述细胞引诱剂包括嗜酸性细胞引诱剂。
107.根据实施例106所述的方法，其中所述嗜酸性粒细胞引诱剂包括ccl3、ccl5、ccl7、ccl11、ccl13、ccl24或ccl26。
108.根据实施例98到107中任一实施例所述的方法，其中所述细胞引诱剂包括嗜中性粒细胞引诱剂。
109.根据实施例108所述的方法，其中所述嗜中性粒细胞引诱剂包括il-8或nap1。
110.根据实施例98到109中任一实施例所述的方法，其中在投与第一治疗有效量的纳米粒子之前向所述个体投与所述细胞引诱剂。
111.根据实施例98到109中任一实施例所述的方法，其中在投与所述第一治疗有效量的纳米粒子之前不超过一小时、之前不超过3小时、之前不超过6小时、之前不超过12小时或之前不超过24小时时投与所述细胞引诱剂。
112.根据实施例98到109中任一实施例所述的方法，其中在投与所述第一治疗有效量的纳米粒子之前至少一小时、之前至少3小时、之前至少6小时、之前至少12小时或之前至少24小时时投与所述细胞引诱剂。
113.根据实施例98到112中任一实施例所述的方法，其中(a)仅在投与第一剂所述第一治疗有效量的纳米粒子之后投与所述细胞引诱剂。
114.根据实施例50到113中任一实施例所述的方法，其中所述个体需要治疗癌症或感染性疾病。
115.根据实施例114所述的方法，其中所述癌症为白血病、前列腺癌、乙型肝炎诱发的肝细胞癌、卵巢癌、胶质母细胞瘤或肺癌。
116.根据前述实施例中任一实施例所述的方法，其中研究人员或临床医师选择根据前述实施例中任一实施例所述的纳米粒子，所述纳米粒子由于所选纳米粒子的瞬时表达特性而向个体投与。
117.根据实施例116所述的方法，其中所述研究人员或临床医师向所述个体投与所述所选纳米粒子。
118.根据实施例116或117所述的方法，其中所述瞬时表达特性引起持续不长于14天、不长于12天、不长于10天、不长于9天、不长于8天、不长于7天、不长于6天或不长于5天的蛋白质或核酸表达。
(viii)实验实例.
实例1.
引入.
基因疗法使得有可能通过嵌合抗原受体(car)、tcr或car/tcr杂合体来工程改造疾病特异性t细胞。然而，目前离体制造经工程改造的t细胞所需的复杂和昂贵的方案对于以足以解决医疗系统的要求的规模引入这些转基因来说是不实际的。此处公开了传递体外转录(ivt)mrna的可注射纳米粒子，其可短暂地再程序化循环t细胞来识别疾病相关的抗原。这些聚合物纳米粒子的重复输注将肿瘤特异性car或病毒特异性tcr转基因传递到足够量的宿主t细胞中以在与推注输注离体工程改造的淋巴细胞类似的含量下诱导白血病、前列腺癌和b型肝炎诱发的肝细胞癌中的疾病消退。考虑到制造、分布和投与的简易性，这种新的纳米技术转化为对广泛范围的疾病的高影响治疗。
过继性t细胞疗法(从患者或供体收集的t细胞基因上靶向癌症或感染原的强有力模式)的功效现在是无争议的并且由许多展示深刻的临床益处的临床试验支持。然而，针对每名患者制造t细胞产品，而非以标准化形式批量制备药物，涉及的复杂性和高成本使得难以胜过当前的一线疗法选项，如小分子药物或单克隆抗体。大多数经car-t和tcr工程改造的t细胞目前通过繁琐并且订制的过程来制备，所述过程涉及(i)白细胞去除术以从通过两个静脉内管连接到单采血液成分机若干小时来提取t细胞。这对于患者来说是不舒适的，引发相当大的成本，并且最终自身t疗法的大规模采用可能变得因为单采血液成分术能力的可用性而受到限制；(ii)t细胞的活化和转导；(iii)经转导的t细胞在补充有细胞因子的组织培养基中在两周时间段内的扩增；以及(iv)在投与之前洗涤和浓缩t细胞。对于在中心设施处制造并且输送到远程治疗中心的t产品，细胞必须冷冻保存；并且(v)对于car-t产品的每个批料进行质量控制(qc)释放分析。整个过程必须在维持和运行昂贵的环境受控的gmp顺应性条件下进行。因为每个car-t产品是由来自待治疗患者的起始物质(t细胞)制得，所以没有相当大的规模经济。
ivtmrna最近已经作为传递基因信息的潜在新的药物类别而引起关注。这类合成mrna药品可以经工程改造以通过结构上类似于天然mrna而瞬时表达蛋白质。其易于开发、生产起来便宜并且针对制造目的可有效地扩展。解决这种药物类别的固有挑战(尤其涉及控制ivtmrna的翻译功效和免疫原性)的发展提供广泛范围的潜在应用的基础。
此处，对使用ivtmrna作为可注射药物以基因上程序化循环t细胞来瞬时表达疾病特异性受体，从而绕过从患者提取和培养淋巴细胞(图1、2、3a、3b)的需要进行了开发。为了缩合和保护ivtmrna有效负载并且为了将其精确靶向t细胞，调配了生物可降解的聚合纳米粒子。首先离体证实，单一纳米粒子应用可以常规地用cd19特异性1928zcar(yescartatm，由fda批准用于治疗患有复发或难治性较大b细胞淋巴瘤的成年患者)或用对乙型肝炎病毒(hbv)核抗原具有特异性的hb核18-27tcr(目前在用于治疗患有hbv相关肝细胞癌的患者的i期研究中)转染>70％的经培养的t细胞。经纳米粒子转染的t细胞在其表面上瞬时表达这些car-转基因或tcr-转基因持续平均七天。
与复杂并且昂贵的程序的个性化t细胞疗法相比，纳米粒子药物是便宜的并且易于大批量制造(并且被设计用于在cgmp条件下放大规模制造纳米粒子的连续流微流体仪器现在是可用的)。用于纳米载体的微流体组件的示例性方法提供于例如威尔逊(wilson)等人(2017)生物医学材料研究杂志a(j.biomed.mat.res.a.)6(105):183-1825中在一些实施例中，纳米载体使用微混合器芯片制造。与本公开的方法相容的示例性微混合器芯片是
目的.
本实例的目的是开发使用ivtmrna作为可注射药物以基因上程序化循环t细胞来瞬时表达疾病特异性受体，从而绕过从患者提取和培养淋巴细胞的需要。进行实验，其表明，当周期性地投与时，编码mrna粒子的car或tcr可以以足以用与用编码病毒载体的car离体转导的t细胞的常规输注类似的功效实现肿瘤消退的量来程序化t细胞。
结果.
使ivtmrna纳米粒子有效转染具有car转基因或tcr转基因的人类t细胞。为了将编码疾病特异性受体基因的ivtmrna传递到人类淋巴细胞中，使用生物可降解聚(β-氨基酯)(pbae)聚合物调配物作为载体基质(图4a)。阳离子pbae通过静电相互作用与阴离子核酸自组装成纳米络合物(图4b)。粒子通过使用与添加到fab序列中的半胱氨酸反应的pga-马来酰亚胺将抗cd8结合域偶合到聚谷氨酸(pga)，从而形成静电吸附到粒子的偶联物来靶向。所得mrna纳米粒子可以冻干以用于长期存储。在使用之前，在添加无菌水之后，粒子在几秒内水化以恢复其初始浓度。与通过2a连接子序列连接的编码tcrα和β链的略大的tcr转基因相比，在装载有car转基因的纳米粒子的物理特性中未观察到显著差异。示例性蛋白质序列提供于图8中。
首先测试将靶向的ivtmrna纳米粒子添加到现有人类淋巴细胞的培养物中是否可以设计其中的稳固转染。为了测试临床相关应用中的这种方法，将编码白血病特异性1928zcar的ivtmrna并入到纳米粒子中(图5a-5e)。靶向cd19的受体是当今研究最多的car-t细胞产品，其中几乎30个国际上进行中临床试验以及两个fda已经批准的癌症疗法(萨德莱恩(sadelain),临床研究杂志(jclininvest)125:3392-3400,2015)。
作为第二实例，传递编码高亲和力hbv特异性tcr的ivtmrna(图5f-5j)。慢性乙型肝炎的t细胞疗法是恢复抗病毒免疫性和治愈感染的新颖方法。将对hbv核抗原具有特异性的hb核18-27tcr与具有消退hbv感染的hla-a02.01供体分离(卡赫(kah)等人,临床研究杂志2017年8月1日；127(8):3177-3188)。
对于两种构建体，在单一纳米粒子转染之后，使用1928zcar和hb核18-27tcr实时定量pcr和流式细胞测量术来测量其在人类t细胞中的表达水平。在纳米粒子暴露后24小时的转基因表达达到峰值，接着在这些增殖t细胞中的表达的逐渐下降(图5a、5f)。这转化为高水平的car表面表达或tcr表面表达，其中在第2天达到最大值(75％±11％的哦t细胞表达1928zcar；图5b、5c；并且平均89％±4％的t细胞表达hb核18-27tcr；图5g、5h)。正如所预期的，受体表达是短暂的，并且在培养物中8天之后对于car来说降低到28％±6％并且对于tcr来说降低到26％±9％。
随后使用病毒方法将经纳米粒子转染的t细胞的功能(杀死和细胞因子产生)与用这些手提工程改造的t细胞的功能进行比较。使用实时
a.载体递送mrna的输注使宿主t细胞再程序化以识别白血病.
随后检查靶向淋巴细胞的ivtmrna纳米粒子是否可以以足够大的量再程序化循环t细胞以与类似于常规方法的功效引起肿瘤消退。作为在白血病中功效的体内证实，用表达萤火虫荧光素酶的1×106个cd19+raji细胞接种免疫缺陷免疫缺陷nod.cg-prkdcscidil2rgtm1wjl/szj(nsg)小鼠。五天后，小鼠用10×106cd3+人类t细胞复原，随后每周接受装载有编码1928zcar的mrna的纳米粒子的六次输注(以产生白血病特异性)或装载有编码gfp的mrna的对照粒子(图6a)。对照组不接受处理。基于用ivtmrna纳米粒子离体测量的car表面表达的动力学选择每周纳米粒子投与方案，所述投与方案展示相关受体表达长达8天(图5b、5c)。
为了比较纳米粒子输注的治疗效果与常规过继性t细胞疗法的治疗效果，还用编码1928zcar的慢病毒载体离体转导的单次剂量的5×106个t细胞处理额外组的小鼠。这个量等同于当前临床研究中使用的cart细胞的较高剂量，其中患者已经用每千克体重至多1.2×107个cart细胞处理(格鲁普(grupp)等人,新英格兰医学杂志(nengljmed)368:1509-1518,2013)。生物发光成像用于连续定量肿瘤生长。还监测总存活期。与未经处理的对照组相比，用离体工程改造的过继性转移1928zcar-t细胞处理的小鼠中的存活期极大地改进。十只小鼠中的六只根除肿瘤，并且其它小鼠展示相当大的肿瘤消退以及存活期的平均32天的提高(图6c)。用常规过继性t细胞疗法实现的这种治疗益处类似于用程序化相同car到体内淋巴细胞中的ivtmrna纳米粒子的治疗，所述常规过继性t细胞疗法实现7/10小鼠的肿瘤根除和复发性动物的存活期的平均37天的提高(图6c)。
在第一剂之后2天的外周血流式细胞测量术揭露：携带1928z的纳米粒子快速并有效地程序化外围t细胞以识别白血病细胞(cd8+±4.3％中的平均值10％car+，图6d、6e)。这些car瞬时表达长达一周(在第7天，0.8％±0.4％car+cd8+t细胞)。纳米粒子的重复剂量与第一注射一样有效，并且实现平均10.7％±3.6％囊封mrna转移到宿主t细胞中(图6e)。这表明，尽管其通常的瞬时性质，ivtmrna可以充当在宿主淋巴细胞中实现持久原位car表达的平台。
b.通过纳米粒子将肿瘤特异性car基因引入到t细胞中引起前列腺肿瘤的消退.
为了证实实体肿瘤中的功效，证实了经设计以将前列腺肿瘤特异性car基因引入到循环宿主t细胞中以诱导小鼠中的前列腺肿瘤消退的纳米粒子的能力。不同于普遍地表达高水平的cd19目标抗原并且可容易地通过循环t细胞获得的白血病细胞，实体癌是非均质的并且受保护的(米查姆(meacham)和莫里森(morrison),自然(nature)501:328-337,2013)。这意味着肿瘤细胞的一部分将不被靶向car识别，并且将被可以使t细胞功能异常的免疫抑制防御包围。实际上，全基因组/转录剖析已经在140个前列腺癌转移中使用以确立前列腺肿瘤病变展现三个关键细胞表面蛋白质(前列腺特异性膜抗原(psma)、前列腺干细胞抗原(psca)和受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ror1))在患者之间的非均质表达(图7a)。
为了复制人类疾病，将lncapc42前列腺癌细胞(其展现关键细胞表面蛋白质的非均质表达，图7b)原位移植到nsg小鼠的前列腺腺体的背叶中(图7c)。为了通过生物发光成像连续地监测肿瘤负荷，用萤火虫荧光素酶(fluc)对肿瘤细胞进行基因标记。在原位移植之后，所有小鼠在三周内可再现地出现病变(图7c，右图)并且随机分配给实验的各种处理或对照组(图7c)。
测量用对肿瘤抗原ror1具有特异性的106个离体转导的car+t细胞全身性注射携带肿瘤的小鼠的治疗效果。尽管抗ror1car-t细胞未实现肿瘤清除，但处理后的小鼠展现大于两倍的存活期(69天相对于在无处理对照中的32天；图7d、7f)。
小鼠用抗ror1car转基因装载的纳米粒子每周全身性注射(图7e)。与未经处理的对照相比，纳米粒子诱导的car程序化延长了平均40天的存活期，其类似于通过常规过继性t细胞疗法实现的存活益处(△平均存活期＝3天，n.s.，p＝0.23；图7d、7f)。这表明，在向个体投与之前，纳米载体的体内投与实现至少与纳米载体转导的t细胞的离体投与一样大的治疗效果。
复发性前列腺肿瘤的抗原概况通过流式细胞测量术来表型。癌症中所见的最常见的逃避策略中的一个是由于选择性压力car产生的目标抗原表达的减少。当使用仅对单一抗原具有特异性的过继性转移的t细胞来处理非均质肿瘤(如转移性前列腺癌)时，这种现象已经报告为临床前和临床研究中的失败的原因。与未处理的lncapc42前列腺肿瘤(其在各种含量下表达ror1肿瘤抗原)直接比较，两个处理组(过继性转移t细胞或纳米粒子程序化的t细胞)中的靶向car的肿瘤最终产生ror1低/负免疫逃避变异体(图7g)。
材料和方法.
pbae447合成.
这种聚合物是使用与曼格拉维蒂(mangraviti)等人(美国化学学会·纳米(acsnano)9,1236-1249,2015)所描述的方法类似的方法合成。将1,4-丁二醇二丙烯酸酯与1.1:1摩尔比的二丙烯酸酯与胺单体中的4-氨基-1-丁醇合并。在搅拌下将混合物加热到90℃持续24小时以产生丙烯酸酯封端的聚(4-氨基-1-丁醇-共聚-1,4-丁二醇二丙烯酸酯)。将2.3g这种聚合物溶解于2ml四氢呋喃(thf)中。为了形成哌嗪加帽的447聚合物，将786mg溶解于13mlthf中的1-(3-氨丙基)-4-甲基哌嗪添加到聚合物/thf溶液中。在室温下搅拌所得混合物2小时，随后用5体积乙醚使加帽聚合物沉淀。在倾析溶剂之后，用2体积的新制乙醚洗涤聚合物，随后在使用前在真空下干燥残余物2天，以在dmso中形成100mg/ml的储备液，将其存储于-20℃下。
pga-抗体偶联.
将15kd聚谷氨酸(来自阿拉曼达聚合物(alamandapolymers))溶解于水中以形成20mg/ml并且超声处理10分钟。添加相等体积的于水中的4mg/ml1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(赛默飞世尔)，并且在室温下将溶液混合5分钟。所得活化pga随后与抗体以4:1摩尔比合并到磷酸盐缓冲盐水(pbs)中并且在室温下混合6小时。为了去除未连接的pga，将溶液通过50,000nmwco膜(密理博)与pbs交换3次。使用nanodrop2000分光光度计(赛默科技(thermoscientific))测定抗体浓度。将抗cd8(克隆okt8)抗体用于t细胞实验。使用克隆c1.18.4作为对照抗体。
mrna合成.
使用编码抗人类1928zcar、抗ror1(4-1bbz)car和hbv特异性tcr(hb核18-27tcr)的经密码子优化的mrna。经密码子优化的dna序列提供于图8中。所有构建体是从trilink生物技术订购，具有以下修饰：完全取代伪-u和5-甲基-c的经修饰的mrna转录物；arca加帽(cap0)；聚腺苷酸化(120a)；dna酶和磷酸酶处理；二氧化硅膜纯化；以及包装为于1mmph6.4柠檬酸钠中的溶液。
纳米粒子制备.
将mrna储备液在无菌、不含核酸酶的25mmph5.2乙酸钠(naoac)缓冲液中稀释到100μg/ml。在naoac中，将dmso中的pbae-447聚合物在naoac中稀释到6mg/ml，并且以60:1(w:w)比率添加到mrna。在使所得混合物以中等速度涡旋15秒之后，将其在室温下培育5分钟，如此可以形成纳米粒子。为了将靶向要素添加到纳米粒子，将pga连接的结合域在naoac中稀释到250μg/ml并且以2.5:1(w:w)比率添加到mrna。使所得混合物以中等速度涡旋15秒，并且随后在室温下培育5分钟以使得pga结合域与纳米粒子结合。
通过将纳米粒子与60mg/ml作为低温保护剂的蔗糖混合，并且将其在液氮中闪冻，随后将其在freezone2.5l冷冻干燥系统(labconco)中处理来冻干纳米粒子。将冻干的纳米粒子在使用之前在-80℃下。对于应用，将冻干的纳米粒子再悬浮于一定体积的无菌水中以恢复其初始浓度。
细胞分选和流式细胞测量术.
数据是使用运行facsdiva软件的bdlsrfortessa或facscantoii细胞分析仪采集，在bdfacsaria-ii上分选，并且用flowjov10.1分析。
cart细胞杀死分析.
通过流式细胞测量术分析car目标细胞的特异性细胞溶解。在37℃下，将目标k562-cd19细胞用低浓度羧基荧光素丁二酰亚胺基酯(cfse)(0.4μm)标记，并且对照k562用高浓度羧基荧光素丁二酰亚胺基酯(4.0μm)标记15分钟。在含有血清的完整培养基中洗涤两种样品，以1:1的比率混合，随后在所指示的效应子:目标比率下用19-41bbζ共培养。为了评估特异性细胞溶解，用抗cd8mab(生物联想公司)染色每一病状以识别t细胞并且用7aad染色以排除死细胞，并且通过流式细胞测量术分析。通过测量活的cd19+目标细胞(低cfse)与对照cd19-k562细胞(高cfse)的比率来评估特异性细胞杀死。
显微术.
在4℃下用含有3μgcy5标记的egfpmrna的抗cd3靶向纳米粒子处理400μlxfsfm中的106个t细胞1小时以进行表面结合，接着在37℃下培育2小时以进行内化。在这些处理之后，用冷pbs洗涤细胞3次，并且在4℃下将细胞装载到聚-l-赖氨酸(sigma)涂布的载片上30分钟。将样品固定于2％多聚甲醛中，安装于prolonggold抗褪色试剂(英杰公司(invitrogen))中，并且用zeisslsm780nlo激光扫描共焦显微镜成像。
统计分析.
除非另外说明，否则曲线展示平均值±平均值的标准差。statisticalanalysiswasdonewithprismsoftware(graphpad).
实例2.
材料和方法.
pbae合成.
用于合成聚合物的方法是先前描述的(曼格拉维蒂a等人(2015)美国化学学会·纳米9:1236-1249)。将1,4-丁二醇二丙烯酸酯与1:1摩尔比的二丙烯酸酯与胺单体中的4-氨基-1-丁醇合并。丙烯酸酯封端的聚(4-氨基-1-丁二醇-共聚-1,4-丁二醇二丙烯酸酯)是通过在搅拌下将混合物加热到90℃持续24小时来形成。将2.3g这种聚合物溶解于2ml四氢呋喃(thf)中。为了形成哌嗪加帽的447聚合物，将于13mlthf中的786mg1-(3-氨丙基)-4-甲基哌嗪添加到聚合物/thf溶液中并且在室温(rt)下搅拌2小时。用5体积的乙醚使加帽聚合物沉淀，用2体积的新制乙醚洗涤，并且在真空下干燥1天。将纯聚合物溶解于二甲亚砜(dmso)中达到100mg/ml的浓度并且存储在-20℃下。
将pga与二-甘露糖偶联。α-d-吡喃甘露糖基-(1→2)-α-d-吡喃甘露糖(二-甘露糖，奥微米生物化学品公司(omicronbiochemicalsinc.))在偶联到pga之前被修饰成葡基胺。首先，将二-甘露糖(157mg)溶解于10.5ml饱和碳酸铵水溶液中，随后在室温下搅拌24小时。在第二天，添加更多固体碳酸铵直到二-甘露糖从反应溶液沉淀为止。搅拌混合物直到完成，如通过tlc所测量，接着冻干以去除过量的碳酸铵。通过将固体再溶解于甲醇中来实现挥发性盐的完全去除。这些程序在异头碳上产生胺以用于将来与pga偶联。
为了将二-甘露糖偶联到pga，将衬底溶于水中到30mg/ml，随后超声处理10分钟。在室温下在混合下，添加含乙基-n'-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐的水(4mg/ml，30当量)4分钟。将含n-羟基硫代琥珀酰亚胺的水(30mg/ml，35当量)用pga/edc溶液培育1分钟。将于磷酸盐缓冲盐水(pbs)中的胺化二甘露糖与所得活化pga以44:1摩尔比合并，并且在室温下混合6小时。通过24小时的水透析去除过量试剂。
mrna合成.
将用于egfp、irf5和ikk(trilink生物技术)的经密码子优化的mrna用抗反向帽类似物3′-o-me-m7g(5')ppp(5')g(arca)加帽，并且用经修饰的核糖核苷酸假尿苷(ψ)和5-甲基胞苷(m5c)完全取代。
纳米粒子制备.
将irf5与ikkβmrna以3:1(w:w)比率合并并且在25mm乙酸钠(naoac)缓冲液(ph＝5.2)中稀释到100μg/ml。将于dmso(如上文所描述制备)中的聚(β-氨基酯)-447(pbae-447)聚合物仍然在naoac缓冲液从100μg/μl稀释到6μg/μl。为了形成纳米粒子，以60:1(w:w)的比率将pbae-447聚合物添加到mrna中，并且立即以中等速度涡旋15秒，随后在室温下培育混合物5分钟以使得形成pbae-mrna聚合复合物。在下一步骤中，将于naoac缓冲液中的100μg/mlpga/二-甘露糖添加到聚合复合物溶液中，在中等速度下涡旋15秒，并且在室温下培育5分钟。在这个过程中，pga/二-甘露糖涂布pbae-mrna聚合复合物的表面以形成最终np。对于长期存储，将d-蔗糖(60mg/ml)作为低温保护剂添加到np溶液中。纳米粒子在干冰中快速冷冻，随后冻干。将干燥的np在使用之前存储在-20℃或-80℃下。对于体内实验，将冻干np以1:20(w:v)比率再悬浮于水中。
纳米粒子大小和ζ-电位的表征.
在25℃下使用zetapals仪器(布鲁克海文仪器公司(brookhaveninstrumentcorporation))来表征np的生理化学特性(包括流体动力学半径、多分散性、ζ-电位和稳定性)。为了基于动态光散射测量流体动力学半径和多分散性，将np在25mmnaoac(ph＝5.2)中稀释5倍。为了测量ζ-电位，将np在10mmpbs(ph＝7.0)中稀释10倍。为了评估np的稳定性，将新制备的粒子稀释于10mmpbs缓冲液(ph＝7.4)中。每10分钟测量np的流体动力学半径和多分散性持续5小时，并且其大小和粒子浓度来源于使用nanosite300仪器(马尔文(malvern))的粒子追踪分析。为了使用透射电子显微法表征np，遵循先前描述的方案(史密斯tt(smithtt)等人(2017)自然·纳米技术(natnanotechnol)12:813-820)。将新制备的np(25μl，含有0.83μgmrna)沉积在辉光放电处理的200目的碳/弗姆瓦(formvar)涂布的铜栅格上。30秒后，用50％卡尔诺夫斯基固定剂(karnovsky'sfixative)、0.1m二甲胂酸盐缓冲液、dh2o，依序处理栅格，随后用1％(w/v)乙酸铀酰处理。用在120kv(美国jeol)下操作的jeoljem-1400透射式电子显微镜对样品成像。
骨髓衍生的巨噬细胞(bmdm)和其它细胞系。为了制备bmdm，在现有方案之后从小鼠股骨收集骨髓祖细胞(张x(zhangx)等人(2008)当前免疫学方案(currprotocimmunol)章节14:单元1411)。在0.5-1.0e6/ml的接种密度下将这些细胞在完全培养基[补充有4.5g/ld-葡萄糖、l-谷氨酰胺、10％热灭活胎牛血清(fbs)、100u/ml青霉素和100μg/ml的dmem，50ml/500ml补充有20ng/mlm-csf(派普泰克(peprotech)，目录号315-02)的glutamax]中培养。使细胞在37℃下在5％co2下在离体分化成bmdm7天。接着，用巨噬细胞-改良性培养基[补充有20ng/mlmpla(西格玛，cat#l6895)或20ng/mlil4(电子生物科学，目录号34-8041)的巨噬细胞完全培养基]改良细胞。在7-21天之间离体使用bmdm。在补充有10％fbs、100u/ml青霉素、5μg/ml胰岛素、5μg/ml转铁蛋白和5ng/ml亚硒酸钠(所有都来自西格玛奥德里奇)的dmem中培养鼠类卵巢癌细胞系id8(来自凯瑟琳·罗比(katherineroby)博士的礼物(堪萨斯州堪萨斯州城的堪萨斯大学医学中心(universityofkansasmedicalcenter,kansascity,ks))。为了产生表达id8菌株的更具侵入性的血管内皮生长因子(vegf)，用编码鼠类vegf的puno1质粒(英伟杰)以及杀稻瘟菌素抗性基因转染id8肿瘤细胞。为了获得稳定转染物，将肿瘤细胞在含有10μg/ml杀稻瘟菌素(英伟杰)的完整培养基中培养3周。在具有10％fbs、100u/ml青霉素、2mm/l-谷氨酰胺、1.5g/l碳酸氢钠、4.5g/l葡萄糖、10mmhepes、1.0mm丙酮酸钠和0.05mm2-巯基乙醇的完全rpmi1640培养基中培养b16f10黑素瘤细胞系(美国菌种保藏中心(americantypeculturecollection))。对于体内生物发光成像，用萤火虫荧光素酶反转录转导id8-vegf和b16f10细胞系。在39℃下在5％co2下在补充有10％fbs和100u/ml青霉素的完全培养基中培养携带racs-pdgfβ或rcas-cre逆转录病毒的df-1细胞系。
bmdm的mrna转染.
在转染之前一天，将bmdm以250,000/孔的浓度在巨噬细胞完全培养基中的24孔板上再接种。在转染之前，用300μl未补充的dmem替换完全培养基。为了转染这些细胞，将含有2μgmrna的np添加到碱性培养基中并且在37℃下用bmdm共培养。在1小时之后，去除含有np的培养基，并且在评估转染效率和细胞存活力之前再培养细胞24小时。
用于巨噬细胞标签基因分析的bmdm的转染.在转染之前24小时将bmdm在改良性培养基在24孔板上再接种，使得细胞裂变成表型。随后使m2样巨噬细胞暴露于携带25％egfpmrna作为报告子的irf5/ikkβnp或含有2μgmrna的egfpnp(对照)，遵循上文所描述的转染方案。24小时后，在转染后24小时将前10％的高度转染的bmdm(如通过egfp表达所测量)进行分选，并且在rna分离前再以低剂量(10ng/ml)il4培养基再攻击48小时。将从这些细胞提取的rna与来自标准m1样巨噬细胞或m2样巨噬细胞的rna比较，使得可以识别与irf5-np处理相关的标签基因。
rna分离和制备.为了采集rna，使bmdm溶解于trizol试剂(安必逊(ambion))中，并且遵循制造商说明书使用
通过纳斯瑞技术进行的巨噬细胞标签基因分析.
使用
流动细胞测量术和细胞分选.
使用图8中列出的抗小鼠抗体探针，通过用骨髓和淋巴免疫表型组进行流式细胞测量术分析从脾、血液、腹膜灌洗液和支气管肺泡灌洗液获得的细胞。使用运行facsdiva软件的bdlsrfortessa分析仪(贝克顿狄肯生(becktondickinson)收集数据。使用bdfacsariaii对cd11b+和f4/80+腹膜巨噬细胞进行分选。使用flowjo10.0软件分析所有收集的数据。
细胞因子分析.
使用路明克斯200系统(路明克斯)评估fhcrc免疫检测共享资源中心处的细胞因子含量。对于离体研究，收集细胞培养物上清液以用于测量il-6、il-12p70、infγ和tnfα浓度。对于体内研究，测量gm-csf、infγ、il-12p70、il-2、il-6和tnfα的血浆浓度。
qrt-pcr分析.
通过qrt-pcr测定基因表达水平。为了测量所选巨噬细胞标签基因(serpinb2、retnla、ccl5、ccl11、经密码子优化的irf5、内源性irf5和管家gapd基因)，根据制造商的说明书，用rneasy微型柱(凯杰)分离总rna。cdna是使用qscriptcdna合成试剂盒(广达(quanta))合成。对于每个样品，使用来自罗氏通用探针库(upl)的基因特异性探针和由probefinder(罗奇)优化的pcr引物通过perfectaqpcrsupermix低rox(广达)一式三份地进行qrt-pcr，所述pcr引物如下：serpinb2、upl-049、f-actggggcagttatgacagg(seqidno:103)、r-gatgatcggccacaaactg(seqidno:104)；retnla、upl-078、f-ttgttcccttctcatctgcat(seqidno:105)、r-ccttgaccttattctccacga(seqidno:106)；ccl5、upl-105、f-cctactcccactcggtcct(seqidno:107)、r-ctgatttcttgggtttgctgt(seqidno:108)；ccl11、upl-018、f-agagctccacagcgcttc(seqidno:109)、r-cagcacctgggaggtgaa(seqidno:110)；经密码子优化的irf5、upl-022、f-tcttaaagaccacatggtagaacagt(seqidno:111)、r-agctgctgttgggattgc(seqidno:112)；内源性irf5、upl-011、f-gctgtgcccttaacaaaagc(seqidno:113)、r-ggctgaggtggcatgtct(seqidno:114)。基于gapd、upl-060、f-agccacatcgctcagacac(seqidno:115)和r-gcccaatacgaccaaatcc(seqidno:116)的扩增将标签基因mrna含量标准化。所有qrt-pcr反应都使用运行quantstudio6软件的studio5rt-pcr机器(应用生物系统公司(appliedbiosystems))进行。在扩增曲线图不跨越阈值并且不获得ct值的情况下(“未测定”)，将等于分析(40个循环)中的最高循环数的ct值用于比较相对表达。
小鼠和体内肿瘤模型.
除脑肿瘤调节相关的实验以外，这些实验中所用的小鼠是从杰克逊实验室(jacksonlaboratory)获得；其它小鼠在fhcrc动物设施中饲养和居住。所有小鼠都在中心的机构动物护理和使用委员会(institutionalanimalcareandusecommittee)批准的方案的情形中使用。为了将卵巢瘤模型化，将5×106个血管上皮生长因子(vegfp)表达的id8细胞腹膜内(i.p.)注射到4到6周龄的白化病b6(c57bl/6j-tyr<c-2j>)小鼠中，并且使其持续2周。对于存活期研究，动物用携带50μgmrna的irf5np/egfpnp(每周两次剂量，持续9周，或直到健康状况达到安乐死要求)腹膜内处理。对于机制研究，使用1、2或3周的处理，接着在最后一次剂量之后48小时进行安乐死。进行腹膜灌洗以收集腹膜细胞。为了比较irf5/ikkβnp与当前巨噬细胞靶向疗法的功效，一组小鼠接受用携带50μgmrna的irf5/ikkβnp进行的处理持续3周，每周2次剂量；第二组每日经口接受在媒剂(5％于聚乙二醇400中的1-甲基-2-吡咯烷酮)中调配的15mg/kgpi3kγ抑制因子ipi-594(medkoo生物科学公司(medkoobiosciencesinc))持续3周；第三组接收每日腹膜内注射在相同媒剂中调配的30mg/kgcsf1r抑制因子培西达替尼(pexidartinib)(plx3397，medkoo生物科学公司)持续3周。
为了使转移性肺癌模型化，将用f-luc转导并且悬浮于200μlrpmi培养基中的2.5×104个16f10细胞注射到4到6周龄的雌性白化病b6(c57bl/6j-tyr<c-2j>)小鼠(杰克逊实验室)中并且使其持续1周。对于存活期研究，用(或不用)携带30μgmrna悬浮于pbs中的irf5/ikkβ或egfpnp对小鼠进行眼眶后处理。小鼠用3次剂量/周处理持续3周或直到健康状况达到安乐死要求为止。对于机制研究，小鼠接受相同的治疗2周。进行支气管肺泡灌洗以收集用于分析的肺泡细胞。
携带胶质瘤的小鼠在公布的方案之后产生(乌尔博姆l(uhrboml)等人(2004)自然·医学10:1257-1260)。将产生rcas-pdgβ和rcas-cre逆转录病毒的禽类df-1细胞颅内注射到4-6周龄之间的巢蛋白-tv-a/ink4a-arf-/-小鼠；pten-/-小鼠(c57bl/6)的脑半球(坐标：距前囟1mm尾侧，2mm横侧，聚硬膜表面2mm的深度)。允许肿瘤形成2周。在第15天，小鼠接受对一个半球的10gy辐射，而未辐射的半球用导线遮蔽。第二天，小鼠接受携带30μgmrna的irf5/ikkβnp的眼眶后注射(3次剂量/周持续3周)，或分配到pbs对照组。
体内生物发光成像.
pbs(15mg/ml)中的d-荧光素(精诺真(xenogen)用作用于萤火虫荧光素酶成像的衬底。用精诺真ivis光谱成像系统(xenogenivisspectrumimagingsystem)(精诺真)收集生物发光图像。小鼠在成像之前和成像期间用2％异氟醚(forane，巴克斯特保健(baxterhealthcare))麻醉。对于id8-vegf卵巢瘤，将每只小鼠用300μgd-荧光素腹膜内注射，并且收集10分钟后的图像。对于b16f10肺转移性肿瘤，用3mgd-荧光素腹膜内注射小鼠，并且随后收集15分钟的图像。对于脑瘤模型，小鼠接受75mg/kg体重d-荧光素的眼眶后注射，并且收集4分钟后的图像。获取时间在10秒到5分钟范围内。
生物分布分析.
为了测定id8-vegf卵巢瘤模型中irf5np的生物分布，7-8组中的小鼠接受携带50μgmrna的np的腹膜内或眼眶后剂量。注射后二十四小时，收集全血，并且小鼠用co2安乐死以检取器官(肝、脾、肺、肾、心脏、肠、胰腺和隔膜)。所有组织用rnalater稳定，随后在干冰上冷冻。使用rt-qpcr测量每个器官中的经密码子优化的irf5mrna含量。
毒性分析.
为了测量重复输注巨噬细胞靶向np的潜在体内毒性，在3周过程中，用6个连续剂量的携带50μgmrna的irf5/ikkβ或egfpnp静脉内注射小鼠(5只/组)。对照组不接受处理。在最终输注后二十四小时，将小鼠麻醉并且通过眼眶后出血收集血液以确定全血计数。还收集血液用于血清化学分析和细胞因子概况分析(由华盛顿州南马科尔蒂奥的菲尼克斯中心实验室(phoenixcentrallaboratories,mukilteo,wa)mukilteo进行)。然后用co2将动物安乐死以检取器官，所述器官在固定于4％多聚甲醛中之前用去离子水洗涤。常规地处理组织，并且用苏木精和曙红染色切片。样本由委员会认证的病理学家以盲法解释。
细胞因子分析.
使用路明克斯200系统(路明克斯)评估fhcrc免疫检测共享资源处的细胞因子含量。对于离体研究，收集细胞培养物上清液以用于测量il-6、il12p70、infγ和tnfα浓度。对于体内研究，测量gm-csf、infγ、il-12p70、il-2、il-6和tnfα的血浆浓度。
统计分析.
使用未配对双尾单因子变异数分析测试分析所观测到的差异的统计显著性。用于每一测量结果的p值以数字或数字图例列出。使用对数秩测试来表征存活率数据。使用graphpadprism软件版本6.0或r软件执行所有统计分析。
结果.
设计np来设计tam的ivtmrna转染。开发了可以通过利用阳离子pbae聚合物与阴离子mrna之间的静电相互作用在靶向细胞中引入稳固基因表达的靶向mrna传递系统(图9a)。为了改进囊封于所得纳米载体中的mrna的稳定性和翻译，使用并入经修饰的核糖核苷酸假尿苷(ψ)(卡里科k(karikok)等人(2008)分子治疗学(molther)16:1833-1840)和5-甲基胞苷(m5c)的信使的合成版本，并且用arca(抗反向帽类似物)加帽(夸比乌斯es(quabiuses)等人(2015)自然生物技术学刊(nbiotechnol)32:229-235)。mrna通过使pbae主链中的酯键水解裂解而从mrna-pbae络合物胞内释放。先前使用这个系统证实有效体内t细胞转染(史密斯tt等人(2017)自然·纳米技术)。为了将纳米粒子靶向tam以及进一步使其含有的mrna-pbae络合物稳定，使用pga作为连接子将二-甘露糖部分工程改造到其表面上(图9a)。利用简单的两步、电荷驱动的自组装方法制造np。首先，合成mrna与带正电pbae聚合物络合，所述带正电pbae聚合物将mrna缩合成纳米大小的络合物。这个步骤之后是添加用二-甘露糖官能化的pga，其遮蔽pbae-mrna粒子的正电荷且赋予巨噬细胞靶向。所得mrna纳米载体具有99.8±24.5nm的大小、0.183的多分散性，和中性表面电荷(3.40±2.15mvζ-电位，图9b、9c)。转染效率首先使用绿色荧光蛋白编码mrna(gfp-np)调配的np在鼠类骨髓源性巨噬细胞(bmdm)中测试。简单来说，使50,000个bmdm暴露于含有1μgmrna的np中1小时，接着次日进行gfp表达的流式细胞测量术测量。在单一np应用之后，常规地转染31.9％(±8.5％)的这些原代巨噬细胞而不降低其活力(图9e、9f)。具有二-甘露糖的粒子的表面修饰是相关的，因为在这种本质上吞噬的细胞类型中非靶向(但pga涂布的)纳米载体的转染率下降到平均25％(±2.1％)。np选择性靶向cd11b+、f4/80+巨噬细胞群，其中46％的巨噬细胞经转染并且表达高含量的egfp(图9d)。这种高转染效率表明所公开的系统和方法在将mrna靶向传递到tam中的效力。基于诱导巨噬细胞极化的转录因子候选物的体外筛选的结果，选择两种mrna以用于包括于np中：第一种编码irf5，即有利于将巨噬细胞朝向m1表型极化的irf家族的关键成员，并且第二种编码ikkβ，即将irf5磷酸化并活化的激酶。
将免疫抑制巨噬细胞程序化为促炎性表型.
为了诱导巨噬细胞极化，选择两种mrna以用于包括于np中：第一种编码irf5，即有利于将巨噬细胞朝向m1表型极化的干扰素调节因子家族的关键成员(克劳斯格鲁伯t(krausgrubert)等人(2011)自然·免疫学(natimmunol)12:231-238)；第二种编码ikkβ，即将irf5磷酸化并活化的激酶(任j(renj)等人(2014)美国国家科学院院刊(procnatlacadsciusa)111:17438-17443)。使用3个irf5mrna与1个ikkβmrna的比率。使用对np传递的(并且经密码子优化的)irf5mrna具有特异性的实时定量pcr，发现巨噬细胞中的mrna表达在第1天达到最大，引起irf5相对于内源性因子含量增加1,500倍(图9a)。正如所预期的，基因表达是短暂的，但irf5含量在返回到基线之前在第3天(增加581倍)和第5天(增加87倍)内保持剧烈上调。
为了确定irf5/ikkβ-编码np是否可以将m2巨噬细胞再程序化为治疗上合乎需要的抗癌m1表型，使用纳斯瑞基因表达分析。首先在白细胞介素-4(il-4)存在下培养bmdm以诱导抑制性m2表型(图9h)。在用对照gfp-mrna纳米粒子或含irf5/ikkβmrna的np转染之后，分析基因表达谱，并且将其与发炎性巨噬细胞相比较，所述发炎性巨噬细胞通过使bmdm暴露于tlr4促效剂单磷酰脂质a而分开产生。尽管在含抑制性il-4的培养基中培养，但用irf5/ikkβmrnanp转染的巨噬细胞显示类似于发炎性巨噬细胞的基因表达谱(图9i)。标签m2巨噬细胞基因，如serpinb2和ccl2(雅布隆斯基k(jablonskik)等人(2015)公共科学图书馆·综合10:e0145342；瓦尔加t(vargat)等人(2016)免疫学杂志196:4771-4782)剧烈下调，同时关键m1分化基因，如ccl5(西卡a等人(2012)临床研究杂志122:787-795)上调(图9j、9k)。这些数据确定irf5和其激酶的np介导的表达使抑制性巨噬细胞朝向促炎性表型歪斜。
实例3.
用于播散性卵巢癌的np传递的促m1基因的治疗效果.
为了评估临床上相关体内测试系统中的这种治疗方法，使用重现c57bl/6小鼠晚期、不可切除卵巢瘤的模型；这些动物注射有id8卵巢癌细胞，其用荧光素酶标记以使得肿瘤生长能够连续生物发光成像(廖jb(liaojb)等人(2015)癌症免疫疗法杂志(jimmunothercancer)3:16；斯蒂芬sb(stephansb)等人(2015)自然·生物技术33:97-101)允许肿瘤形成两周。通过这个阶段，小鼠在整个腹膜壁和肠道系膜中已经产生结节。将动物分成3个组，所述组腹膜内接收100μgmrna/小鼠/周的剂量下的pbs(对照)、gfpnp(假处理)或irf5/ikkβnp处理持续9周(图10a)。观察到，在irf5/ikkβnp处理组中，疾病消退并且最终40％动物消除(相对于对照组的60天中值存活期的总计142天的中值存活期；图10b、10c)。为了理解irf5/ikkβnp介导的抗肿瘤作用的潜在机制，首先检查甘露糖受体如何专有地靶向被限制np与吞噬细胞的相互作用。在用二-甘露糖靶向的np的第一次剂量之后24小时收集的腹膜灌洗液的流式细胞测量术揭露优先基因转移到巨噬细胞和单核细胞中(分别平均37.1％和15.3％，图10d)，而转染到偏离目标细胞中是低的或不可检测的。在用irf5/ikkβ纳米粒子或pbs处理3周时段(每周两次注射)之后，随后进行患有现有卵巢癌小鼠腹膜中的巨噬细胞/单核细胞群的详细表型和功能分析。相对于对照中的43％±15.6％，流动细胞测量术分析揭露irf5/ikkβnp将免疫抑制巨噬细胞(ly6c-、f4/80+、cd206+)群减少到平均2.6％±2.1％(图10e、10f)。相反地，m1样巨噬细胞的分数从0.5％±0.2％增加到10.2％±4.1％(图10e、10g)。irf5基因疗法还影响其它免疫细胞群。确切地说，发炎性单核细胞(cd11b+、ly6c+、ly6g-)更丰富(与未处理小鼠的4.5％±1.9％相比，73.4％±3.6％)。所有irf5np处理的动物中的一个有趣的发现是存在于赘瘤内或周围的淋巴细胞的多灶性致密群集(图10h)，指示免疫刺激巨噬细胞的基因程序化可以恢复淋巴细胞迁移并且浸润到实体肿瘤中。
通过荧光活化细胞分选分离腹膜巨噬细胞以分析其细胞激素分泌，并且检测到促炎性(抗肿瘤)细胞因子il-12(高3.4倍)、ifn-g(高8.4倍)和tnf-α(高1.5倍)的释放的稳固增加，而il-6(与朝向替代性活化(m2样)巨噬细胞分化相关的调节细胞因子)的含量减少97倍(图10i)。基因组表达谱证实朝向irf5/ikkβ纳米粒子处理的小鼠中的m1样巨噬细胞表型的分化。包括在mpla或il-4中离体培养的巨噬细胞的基因表达水平以分别提供典型m1样或m2样巨噬细胞的参考值(图10j)。
生物分布和安全性.
随后对使用经设计以检测仅纳米传递的(密码子优化的)irf5的rt-qpcr分析在腹膜内注射之后24小时的各种器官中的纳米粒子的分布进行定量。在位于腹膜中的器官中发现最高浓度的ivtmrna，所述器官包括肝、脾、肠、胰腺和隔膜(图11a)。检测到处于腹膜外的器官(心脏、肺、肾)中的少量粒子传递的mrna，表明腹膜内注射的纳米载体的一部分进入体循环。随后评估分布数据引导的这些纳米试剂对于重复给药是否是生物相容的并且安全的。小鼠用总共8次剂量的irf5/ikkβnp(两次50μgmrna剂量/周持续4周，图11b)注射。在最终剂量之后24小时将小鼠安乐死，记录体重，通过眼眶后出血收集血液以用于血清化学分析，并且进行完全的整体尸检。组之间的体重没有差异。通过委员会认证的病理学家评估以下组织：肝、脾、系膜、胰腺、胃、肾、心脏和肺。在所有情况下，组织病理学评估揭露肿瘤病变内或周围的淋巴细胞的多灶性致密群集，但在赘生性细胞不存在的组织中未观察到发炎或明显的坏死的迹象(图11c)。此外，经irf5/ikkβnp处理的小鼠的血清化学分析与pbs对照组相当，指示不发生全身性毒性(图11d)。因为在生物分布研究中全身性地检测到少量irf5mrna，所以设计平行实验以定量外周血中的发炎性细胞因子。在单次腹膜内注射irf5/ikkβnp之后，在白细胞介素-6(il-6)的血清含量中测量到平均26.8pg/ml(图11e)和肿瘤坏死因子-a(tnf-a)平均94.7pg/ml(图11f)的适度和短暂增加。基于先前报告，这些含量比与病理学发现相关的那些含量低500倍，并且因此可以视为安全(塔兰特j.m.(tarrantj.m.)(2010)毒理科学(toxicolsci)117:4-16；科普兰s(copelands)等人(2005)临床与诊断实验室免疫学(clindiagnlabimmunol)12:60-67))。
在静脉内输注irf5/ikkβ纳米粒子的情况下控制全身性肿瘤转移.
基于用直接投与到腹膜腔中以治疗遍及腹膜扩散的肿瘤病变的irf5/ikkβnp实现的治疗反应，所问的下一问题要求是静脉内输注的mrna纳米载体是否可以全身性程序化巨噬细胞以控制播散性疾病。rt-qpcr生物分布研究揭露：静脉内输注的纳米载体优先将其mrna货物传递到具有高含量的驻留巨噬细胞/吞噬细胞的器官，所述器官主要为脾、肝和肺(图12a)。为了测量临床上相关体内测试系统中的抗肿瘤反应，将含有irf5/ikkβmrna的粒子投与到具有播散性肺黑素瘤转移的小鼠中(图12b)。最近工作描述单核细胞和巨噬细胞在建立由这种疾病引起的癌转移中的基础作用(布特勒kl(butlerkl)等人(2017)科学报告(scirep)7:45593；尼耳森sr(nielsensr)等人(2017)炎症介质(mediatorsinflamm)2017:9624760)，并且通过共聚焦显微术确认肿瘤植入与肺中的吞噬细胞积聚协调(图12c)。通过生物发光成像确定肿瘤负担，并且将具有可检测癌症的小鼠分选到具有匹配水平的组。随后将组随机分配到处理条件：不接受治疗(pbs)或静脉内注射gfp囊封的纳米粒子或irf5/ikkβ囊封的纳米粒子。仅irf/ikkβ纳米粒子疗法大体上减少肺部的肿瘤负担；实际上，其改进总存活期平均1.3倍(图12d、12e)。在平行实验中，在肿瘤接种后22天内处死小鼠以通过肺癌转移计数验证生物发光肿瘤信号并且通过流式细胞测量术评估巨噬细胞极化。与pbs对照相比(平均419±139癌转移；图12f、12g)，irf5/ikknp处理的肺中的癌转移总数减少8.7倍(平均40±16癌转移)。支气管肺泡灌洗液细胞的流式细胞测量术揭露从免疫抑制性(cd206+、mhcii-、cd11c+、cd11blow)巨噬细胞朝向活化(cd206-、mhcii+、cd11c-、cd11b+)吞噬细胞的强转变(图12h、12i)。
程序化肿瘤抑制吞噬细胞以治疗胶质瘤.
检查第三体内测试系统胶质瘤，难以管理癌症类型，其中m2样巨噬细胞表示大部分非赘生性细胞并且促进肿瘤生长和侵入(汉巴德祖米安d(hambardzumyan)等人(2016)自然神经科学(natneurosci)19:20-27)。目前，对这种疾病的标准护理为放疗，其不利地提供症状的仅暂时稳定或减小并且使中值存活延长3个月(曼j(mannj)等人(2017)神经病学前沿(frontneurol)8:748)。为了再现疾病的基因事件和后续分子进化，使用pdgfβ驱动的胶质瘤(pdg小鼠(汉巴德祖米安d等人(2009)翻译肿瘤学(transloncol)2:89-95；凯威尔df(quaildf)等人(2016)科学352:aad3018))的rcas-pdgf-b/巢蛋白-tv-a；ink4a/arf-/-转基因小鼠模型；pten-/-转基因小鼠模型。脑组织用经rcas-pdgfβ或rcas-cre逆转录病毒转染的df-1细胞的混合物(1:1混合物，2μl)以立体定位方式注射。pdgfβ癌基因的过度表达和胶质瘤祖细胞中的肿瘤抑制基因ink4a-arf和pten的缺乏导致化成4-5mm直径肿瘤(图13a)，其中在21天内几乎完全渗透(如先前所确立(汉巴德祖米安d等人(2009)翻译肿瘤学2:89-95))。使用免疫荧光，肿瘤浸润(cd68+)巨噬细胞(图13b，在左侧第三个图中指示)证实存在于现有胶质瘤(绘示于左侧的第二个图中)中。流式细胞测量术揭露：f4/80+、cd11b+巨噬细胞群占肿瘤中总细胞的32.8％，其比年龄匹配的健康对照小鼠(3.7％)中所看到高9倍(图13c)。实验中的pdg小鼠表达连接到关键癌症基因启动子的萤火虫荧光素酶基因。来自这一报告子的生物发光已经证实与肿瘤级别正相关(乌尔博姆l(uhrboml)等人(2004)自然·医学10:1257-1260)，因此其用于在治疗开始之后每四天监测肿瘤发育。首先测试作为单一疗法的irf/ikkβnp：pdg小鼠接受9次剂量装载有irf5/ikkβmrna的nps的静脉内输注，或对照组中的pbs(3次剂量/周持续3周)。irf/ikkβnp处理仅适当地抑制肿瘤进展(与未处理对照组相比，仅产生平均5天的存活期优势；图13d)。然而，将放疗与irf5/ikkβnp注射组合作为标准护理，与pbs对照相比，大体上减少肿瘤生长并且将经处理小鼠的存活期加倍两倍以上(分别52天相对于25天；图13e、13f)。
总之，来自三个临床前实体肿瘤模型体内结果表明局部或全身性投与的纳米粒子可以将编码巨噬细胞极化的主调节因子的基因传递以将免疫抑制巨噬细胞再程序化成肿瘤清除表型。
从鼠类转变到人类巨噬细胞.
为了确认小鼠中获取的数据与治疗人类疾病具有相关性，制造传递编码人类irf5和ikkβ的ivtmrna的np(huirf5np)。人类单核细胞系thp-1用作公认的m1和m2巨噬细胞极化模型以测试这些纳米载体(李c(lic)等人(2016)科学报告6:21044；苏尔泽尔e(surdziele)等人(2017)公共科学图书馆·综合12:e0183679)。通过用pma处理thp-1细胞并且用il-4和il-13使其极化来产生m2型巨噬细胞(图14a)。为了确认huirf5np是功能性的并且活化irf路径，thp1-luciatmisg细胞用装载有huirf5/ikkβ或gfp对照mrna的纳米粒子转染。thp1-luciatmisg细胞在irf诱导型启动子的控制下分泌荧光lucia报告子。这种复合启动子包括与isg54最小启动子融合的五个ifn刺激反应要素(isre)，其对nf-κb或ap-1路径的活化因子无反应性。因此，thp1-luciatmisg细胞允许通过测定lucia荧光素酶的活性来监测irf路径。发现huirf5np剧烈上调荧光素酶在m2极化的thp-1细胞中的表达，指示mrna构建体在人类细胞中是功能性的(图14b、14c)。为了确定irf5路径活化是否可以将m2偏光的thp-1细胞朝向m1样表型再程序化，测量在np转染之后促炎性细胞因子il-1β的分泌。用huirf5np转染的thp-1细胞中的il-1β的产生相对于未转染的对照显著增加(平均21倍；p<0.0001，图14d)，其与m1巨噬细胞细胞表面标记cd80的稳固上调(mfi增加10.9倍，p<0.0001)相关(图14e)。
预测实例1：用t细胞引诱剂的预处理.
将重组ccl21(趋化因子(c-c基元)配体21)皮下注射到现有肿瘤中，并且一天后，肿瘤将用纳米粒子注射，所述纳米粒子用肿瘤特异性car、tcr或car/tcr杂合体再程序化募集的t细胞。ccl21已知诱导快速的t细胞浸润(例如，里德尔(riedl)等人,分子癌症(molecularcancer)2003)。
预测实例2：播散性卵巢癌.
播散性卵巢癌将在具有免疫能力的小鼠中确立。动物将用ccl21腹膜内(i.p.)注射，接着一天后通过腹膜内注射传递编码间皮素(msln)特异性tcr的mrna的纳米粒子。卵巢癌细胞表达高含量的msln。将测量再程序化效率(具有或不具有ccl21预处理)并且将使用生物发光成像连续监测肿瘤进展。
预测实例3：hbv诱发的肝细胞癌的鼠类异种移植模型.
用hb核18-27抗原稳定转染的hepg2肿瘤细胞将以手术方式移植到nsg小鼠的肝脏中。用萤火虫荧光素酶标记hepg2肿瘤细胞，使得可以非侵入性地监测肿瘤进展。小鼠随后将用人类t细胞复原并且注射传递编码抗hbv特异性tcr(hb核18-27)的mrna的t细胞靶向纳米粒子或对照gfp。将比较经tcr纳米粒子处理与gfp纳米粒子对照的肿瘤进展。还将通过流式细胞测量术直接测量外周血的tcr再程序化。
除非另外指示，否则本公开的实践可以采用免疫学、分子生物学、微生物学、细胞生物学和重组dna的常规技术。这些方法描述于以下出版物中。参见例如萨布鲁克(sambrook)等人分子克隆：实验指南(molecularcloning:alaboratorymanual),第2版(1989)；f.m.奥斯贝(f.m.ausubel)等人编,现代分子生物学实验技术(currentprotocolsinmolecularbiology)(1987)；系列酶学方法(theseriesmethodsinenzymology)(学术出版社公司(academicpress,inc.))；m.麦克弗森(m.macpherson)等人,pcr∶切实可行的方法(pcr:apracticalapproach),牛津大学出版社处的irl出版社(irlpressatoxforduniversitypress)(1991)；麦克弗森等人编pcr2∶切实可行的方法(pcr2:practicalapproach)(1995)；哈洛(harlow)和兰尼(lane)编抗体实验指南(antibodies,alaboratorymanual)(1988)；以及r.i.弗瑞旭尼(r.i.freshney)编动物细胞培养(animalcellculture)(1987)。
由公共数据库提供的序列信息可以用于识别待靶向的基因序列和编码如本文所公开的表型改变蛋白质的核酸序列。示例性序列提供于图15中。
还包括本文中所公开和参考的序列的变异体。蛋白质的变异体可以包括具有一或多个保守氨基酸取代的那些。如本文所用，“保守取代”涉及在以下保守取代组中的一个中发现的取代：组1：丙氨酸(ala)、甘氨酸(gly)、丝氨酸(ser)、苏氨酸(thr)；组2∶天冬氨酸(asp)、谷氨酸(glu)；组3∶天冬酰胺(asn)、谷氨酰胺(gln)；组4∶精氨酸(arg)、赖氨酸(lys)、组氨酸(his)；组5∶异亮氨酸(ile)、亮氨酸(leu)、甲硫氨酸(met)、缬氨酸(val)；以及组6∶苯丙氨酸(phe)、酪氨酸(tyr)、色氨酸(trp)。
另外，氨基酸可以通过类似功能或化学结构或组成(例如酸性、碱性、脂肪族、芳香族或含硫)而分到保守取代组中。举例来说，出于取代的目的，脂肪族分组可以包括gly、ala、val、leu和ile。其它含有被视为彼此保守取代的氨基酸的组包括：含硫酸的：met和半胱氨酸(cys)；酸性：asp、glu、asn和gln；较小脂肪族非极性或微极性残基：ala、ser、thr、pro和gly；极性带负电残基和其酰胺：asp、asn、glu和gln；极性带正电残基：his、arg和lys；较大脂肪族非极性残基：met、leu、ile、val和cys；以及较大芳香族残基∶phe、tyr和trp。额外信息见于克赖顿(creighton)(1984)蛋白质(proteins),w.h.弗里曼公司(w.h.freemanandcompany)。
如其它地方所指示，基因序列的变异体可以包括密码子优化的变异体、序列多态性、剪接变异体和/或在统计学显著程度上并不影响编码产品的功能的突变。
本文所公开的蛋白质、核酸和基因序列的变异体还包括与本文所公开的蛋白质、核酸或基因序列具有至少70％序列一致性、80％序列一致性、85％序列一致性、90％序列一致性、95％序列一致性、96％序列一致性、97％序列一致性、98％序列一致性或99％序列一致性的序列。
“序列一致性％”是指如通过比较序列所测定的两个或更多个序列之间的关系。本领域中，“一致性”还意谓如通过这类序列串之间的匹配所测定的蛋白质、核酸或基因序列之间的序列亲缘关系程度。“一致性”(通常称为“相似性”)可以容易地通过已知方法计算，包括以下描述的那些方法：计算分子生物学(computationalmolecularbiology)(莱斯克a.m.(lesk,a.m.)编.)纽约州牛津大学出版社(oxforduniversitypress、ny),(1988)；生物计算：信息学和基因组计划(biocomputing:informaticsandgenomeprojects)(史密斯d.w(smith,d.w.)编)纽约州学术出版社(academicpress,ny),(1994)；序列数据的计算机分析(computeranalysisofsequencedata),第i部(格里芬a.m.(griffin,a.m.)和格里芬h.g.编)新泽西州胡马纳出版社(humanapress,nj),(1994)；分子生物学中的序列分析(sequenceanalysisinmolecularbiology)(范海涅g.(vonheijne,g.)编)学术出版社(1987)；以及序列分析引物(sequenceanalysisprimer)(格里布科夫m.(gribskov,m.)和德弗罗j.(devereux,j.)编)纽约州牛津大学出版社,(1992)。测定一致性的优选方法设计成获得所测试序列之间的最佳匹配。在公开可用的计算机程序中编码测定一致性和相似性的方法。序列比对和一致性百分比计算可以使用lasergene生物信息学计算程序组(威斯康星麦迪逊的dnastar公司(dnastar,inc.,madison,wisconsin))的megalign程序进行。也可以使用clustal比对法(希金斯(higgins)和夏普cabios(sharpcabios),5,151-153(1989)，具有默认参数(空位罚分＝10，空位长度罚分＝10)进行序列的多序列比对。相关程序还包括gcg编程程序组(威斯康星套装版本9.0(wisconsinpackageversion9.0),遗传学计算机组(gcg),麦迪逊(madison),威斯康星(wisconsin))；blastp、blastn、blastx(阿尔丘尔(altschul)等人,分子生物学杂志215:403-410(1990)；dnastar(威斯康星麦迪逊的dnastar公司)；以及并入史密斯-沃特曼算法(smith-watermanalgorithm)的fasta程序(皮尔逊(pearson),计算机方法基因组研究(comput.methodsgenomeres.),[国际学术会议(proc.int.symp.)](1994),会议日期1992,111-20.编辑人:舒豪伊(suhai),桑德尔(sandor).出版商:纽约州纽约的普雷纳姆(plenum,newyork,ny)。在本公开的情形内，应理解如果使用序列分析软件进行分析，那么分析结果是基于所提及程序的“默认值”。如本文所使用的“默认值”将意谓使用软件第一次初始化时原始载入的任何数值或参数组。
本领域普通技术人员将理解，本文所公开的每一实施例可以包含其具体陈述的要素、步骤、成分或组分或基本上由它们组成或由它们组成。如本文所用，过渡术语“包含(comprise/comprises)”意谓包括但不限于并允许纳入甚至呈主要量的未指定要素、步骤、成分或组分。过渡短语“由……组成”不包括任何未指定的要素、步骤、成分或组分。过渡短语“基本上由……组成”将实施例的范围限于指定要素、步骤、成分或组分以及不显著影响实施例的那些要素、步骤、成分或组分。如本文所用，材料效应将在向个体投与所公开的纳米粒子之后7天内引起治疗蛋白的表达的统计学显著降低。
在特定实施例中，对cdr序列的参考是根据卡巴特(kabat)编号。
除非另外指明，否则本说明书和权利要求书中所用的表示成分量、特性(如分子量)、反应条件等的所有数量应理解为在所有情况下都由术语“约”修饰。因此，除非相反地指示，否则在本说明书和所附权利要求书中所阐述的数值参数是可能取决于试图通过本发明获得的所需特性而变化的近似值。最低限度地，并且不试图限制等同物原则应用于权利要求书的范围，至少应根据所报告的有效数字的数目并且通过应用一般四舍五入技术来解释每个数值参数。当需要进一步阐明时，在结合所陈述数值或范围使用时，术语“约”具有由本领域技术人员合理地归属至其的意义，即表示比所陈述值或范围略大或略小，在所陈述值的±20％的范围内；所陈述值的±19％的范围内；所陈述值的±18％的范围内、所陈述值的±17％的范围内；所陈述值的±16％的范围内；所陈述值的±15％的范围内；所陈述值的±14％的范围内；所陈述值的±13％的范围内；所陈述值的±12％的范围内；所陈述值的±11％的范围内；所陈述值的±10％的范围内；所陈述值的±9％的范围内；所陈述值的±8％的范围内；所陈述值的±7％的范围内；所陈述值的±6％的范围内；所陈述值的±5％的范围内；所陈述值的±4％的范围内；所陈述值的±3％的范围内；所陈述值的±2％的范围内；或所陈述值的±1％的范围内。
尽管阐述本发明广泛范围的数值范围和参数是近似值，但具体实例中阐述的数值是尽可能精确地报告的。然而，任何数值固有地含有某些必然由其对应测试测量中所发现的标准差造成的误差。
除非本文另有说明或明显与上下文相矛盾，否则在描述本发明的情形下(尤其在所附权利要求书的情形下)所用的术语“一(a/an)”、“所述”和类似指示物应解释为涵盖单数和复数。本文中值范围的叙述仅旨在充当个别地提及处于所述范围内的每个单独值的简写方法。除非本文另外指示，否则每个个别值并入到本说明书中，如同其在本文中个别地列举一般。除非在本文另外指示或以其它方式与上下文明显相矛盾，否则本文所描述的所有方法可以按任何适合的顺序进行。本文所提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“如(suchas)”)的使用，仅希望更好地阐明本发明，并且不对以其它方式所要求的本发明范围造成限制。本说明书中的任何语言都不应被解释为指示任何未要求的要素对于实践本发明而言是必需的。
本文所公开的本发明的替代性要素或实施例的分组不应解释为限制。每一组成员都可以个别地或以与所述组中其它成员或本文中所见其它要素的任何组合形式来提及和要求。预期组中的一或多个成员可以出于便利性和/或专利性的原因而包括于组中或由组删除。当任何这类纳入或删除发生时，本说明书被认为含有所修改的组，因此满足所附权利要求书中所用的所有马库什(markush)组的书面描述。
本文描述了本发明的某些实施例，包括本发明人已知的用于实施本发明的最佳模式。当然，在阅读以上描述之后，这些所描述实施例的变化形式对于本领域普通技术人员将变得显而易见。本发明人期望本领域技术人员在适当时采用这类变化，并且本发明人打算以不同于本文中具体描述的其它方式来实践本发明。因此，本发明包括适用法律允许的所附权利要求书中所列举主题的所有修改和同等物。此外，除非本文另有说明或者与上下文明显矛盾，否则本发明涵盖上述要素在其所有可能变化中的任何组合。
此外，在整个本说明书中已经对杂志文章、出版物、专利和专利申请案(包括专利申请公开案)(共同“引用”)进行了大量的参考。上述引用中的每一个是针对其特定引用目的和/或传授内容以引用的方式个别地并入本文中。
应理解本文所公开的实施例是对本发明的原理的说明。可以采用的其它修改处于本发明的范围内。因此，作为实例而非限制，可以根据本文中的传授内容来利用本发明的替代性配置。因此，本发明不限于如所精确展示和描述的内容。
本文中所展示的细节是作为实例的并且仅出于说明性论述本发明的优选实施例的目的，并且是为了提供被认为本发明的各种实施例的原理和概念方面的最有用并容易理解的描述而呈现。就这一点而言，没有尝试比基础理解本发明所必需的程度更详细地展示本发明的结构细节，本说明书加上图式和/或实例使得本领域技术人员很清楚如何在实际中实施本发明的几种形式。
除非在后续实例中清晰并明确地修改或当所述含义的应用使任何构造无意义或基本上无意义时，本公开使用的定义和解释意谓并且意图控制任何未来的构造。在术语构造将使其无意义或基本上无意义的情况下，定义应从韦氏辞典(webster'sdictionary)(第3版)或本领域普通技术人员已知的辞典，如生物化学与分子生物学牛津辞典(oxforddictionaryofbiochemistryandmolecularbiology)(安东尼史密斯(anthonysmith)编，牛津的牛津大学出版社,2004)获取。
在整个公开内容中，所引用的所有参考文献和专利文件都以全文引用的方式并入本文中。
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