一种Cu₃BiS₃纳米药物及其制备方法和应用

一种Cu₃BiS₃纳米药物及其制备方法和应用
【专利摘要】本发明提供了一种Cu3BiS3纳米药物及其制备方法和应用，所述Cu3BiS3纳米药物是由吐温20包覆Cu3BiS3纳米粒子形成的。本发明的Cu3BiS3纳米药物的紫外吸收峰移至第二近红外窗口，通过第二近红外窗口激光照射可增加激光穿透深度，降低活体组织对激光的吸收，减小对正常组织的损伤，具有优良的成像功能，近红外区的强吸收赋予该纳米药物良好的光声成像信号，可以通过CT成像和光声成像诊断肿瘤的位置并监测治疗过程中的反应，本发明的纳米药物不仅可以基于尺寸效应排出体外，残留在体内的也可以在短时间内降解而从体内清除，大大提高了其安全性，为无机材料在肿瘤诊断和治疗中的应用提供了安全保障。
【专利说明】
一种Gu3B i S3纳米药物及其制备方法和应用
技术领域
[0001 ]本发明属于药物领域，涉及一种Cu3BiS3纳米药物及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 尽管在过去的几十年中，人类对癌症的认知和攻克取得了长足的发展，癌症却依 然是影响人类健康和寿命的主要疾病。世界卫生组织发布的《全球癌症报告2014》中指出 "全球面临癌症大暴发，中国发病率第一"。全国肿瘤登记中心指出，2012年我国新增300多 万癌症患者，每年约250万人死于癌症。如此之高的发病率和死亡率很大程度上是因为传统 的癌症治疗方法效果差，毒副作用大以及不能实现可视化监测等。在癌症治疗中，热疗的方 法已经被证明能够有效地提高癌症的治疗效果。一些能够将外界能量(激光、磁场、微波、超 声等)转化为热量的纳米粒子正在作为新型的热疗介质来研究和发展。利用这些纳米粒子， 热疗部位及其所需要的热量可以通过外界能量进行精确的控制，直接在肿瘤内部将外界能 量转化为热量，再由肿瘤内部向外扩散，因此可以有效地防止对肿瘤周围的正常组织造成 损伤。近几年来，近红外激光由于其对活体组织的穿透能力强而被广泛应用于热疗。其中， 大部分纳米粒子的吸收处于第一近红外窗口（750nm-900nm)，相较之下，血液和活体组织对 第二近红外窗口（1000nm-1400nm)激光的吸收和散射更小，对活体组织具有更强的穿透能 力。因此，研究具有第二近红外窗口吸收的热疗纳米粒子是一个值得探索和发展的方面。
[0003] 此外，癌症治疗的前期诊断以及治疗过程中的可视化监测对治疗效果有不可忽视 的影响。成像技术不仅能够为癌症的综合诊断提供指导，监测治疗反应，针对癌症提供具有 更高特异性和敏感性的方法，同时作为实时跟踪监测纳米粒子在体内代谢变化的有力武 器。由于每种成像方式都有其独特的优势，因此，结合多种成像方式的多模态成像不仅可以 充分利用每种成像方式的最优特征，同时也避免了它们的缺陷。
[0004] 在带来治疗效果的同时，脏器积累产生的毒副作用大大阻碍了热疗的发展和应 用。纳米粒子在动物体内积累会导致急性毒性，长期炎症反应，甚至纤维化和肿瘤。美国食 品及药物管理局指出，注入人体的制剂应该在一个合理的时间范围内被清除。因此，诊疗一 体化并且具有最佳的体内代谢的纳米探针是目前一个重要的研究任务。

【发明内容】

[0005] 针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种Cu3BiS3纳米药物及其制备方法 和应用。
[0006] 为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
[0007] 一方面，本发明提供一种Cu3Bi S3纳米药物，所述纳米药物是由吐温20包覆Cu3Bi S3 纳米粒子形成的。
[0008] 吐温20是一种非离子型表面活性剂，通常被认为是无毒、无刺激性的材料。包覆在 Cu3BiS3纳米粒子表面，不仅提高了纳米粒子在水溶液中的分散性和稳定性，生物相容性，同 时阻止了纳米粒子在生物体内的蛋白非特异性吸附，从而可以通过增强渗透与滞留效应 (EPR)更多地到达肿瘤部位。
[0009]优选地，所述 C113B i S3 纳米粒子的粒径为 10-15nm，例如 1 Onm、11 nm、12nm、13nm、14nm 或15nm〇
[0010] 优选地，所述Cu3BiS3纳米粒子的粒径为5~50nm，例如5nm、8nm、10nm、12nm、15nm、 18]1111、2〇11111、2211111、2411111、2811111、3〇11111、3211111、3511111、3811111、4〇11111、45111]1或5〇111]1。在本发明中，如果 Cu3BiS3纳米药物的粒径小于5nm，会使得肾脏毒性增大，影响成像效果及其光热转化性能， 这样既降低了治疗效果，同时产生很大的副作用;如果粒径过大，则影响该纳米药物在用于 肿瘤治疗后的代谢，容易长期富集在体内脏器中产生毒性及炎症反应，甚至会引发癌症。 [0011 ] 优选地，所述Cu3BiS3纳米药物的水合粒径为20~50nm，例如20nm、22nm、24nm、 26]1111、2811111、3〇11111、3211111、3511111、3811111、4〇11111、45111]1或5〇111]1。在本发明中所述(]1131^33纳米药物的 水合粒径是指将Cu3Bi S3纳米药物分散于水中形成的水合物的粒径。
[0012]本发明的Cu3BiS3纳米药物的紫外吸收峰移至第二近红外窗口，具有优良的光声成 像性能，同时能够将光能转化为热量，可用于近红外第二窗口肿瘤热疗;铋元素的X射线衰 减远大于临床所用X射线计算机扫描造影剂，具有优良的CT成像性能。
[0013]本发明的Cu3BiS3纳米药物可由于尺寸效应在短时间内通过肾脏途径快速代谢出 体外，同时，残留的进入细胞的纳米药物也可以在酸性环境下降解从而排出体外，这为纳米 药物在临床的推广提供了一个安全的平台。这种具有诊疗一体化且安全的纳米药物，克服 了传统肿瘤诊疗方法的缺陷，适合应用于肿瘤的诊断和治疗。
[0014] 另一方面，本发明提供如第一方面所述的Cu3B i S3纳米药物的制备方法，所述方法 包括以下步骤：
[0015] (1)将氯化铋和乙酰丙酮铜溶于油酸和油胺中，在惰性气体保护下反应得到溶液 A；
[0016] (2)将硫单质溶于油胺中得到溶液B;
[0017] (3)将溶液B注入溶液A中，反应得到溶液C;
[0018] (4)向溶液C中加入环己烷，降至室温，取上清液，加入无水乙醇，分离得沉淀；
[0019] (5)将沉淀用环己烷和无水乙醇混合溶液体系进行分离洗涤操作，得到Cu3BiS 3纳 米粒子；
[0020] (6)将Cu3BiS3纳米粒子分散于环己烷中，加入吐温20,向所得体系中加入去离子 水，分离得到沉淀，将沉淀分散于去离子水中得到所述Cu3BiS3纳米药物。
[0021 ] 优选地，所述氯化铋、乙酰丙酮铜与硫单质摩尔比为1: (2~5): (2~5)，例如可以 是1:2:2、1:2:3、1:2:4、1:2:5、1:3:2、1:3:3、1:3:4、1:3:5、1:4:4、1:4:2、1:4:3、1:4:5、1: 5:2、1 :5:3、1:5:4或1:5:5。将三者的摩尔比限定在上述范围是为了保证适量的硫、铋和铜 形成晶型适当的三元化合物，避免因某种元素过多或过少而引起二元化合物的形成。
[0022] 优选地，所述溶液A的浓度为0 · 069~0 · 089g/mL，例如可以是0 · 069g/mL、0 · 070g/ mL、0 · 075g/mL、0 · 079g/mL、0 · 080g/mL、0 · 083g/mL、0 · 085g/mL或 0 · 089g/mL。所述浓度为氣 化铋和乙酰丙酮铜在油酸和油胺中的总浓度，浓度过大或过小均会造成最终形成的纳米粒 子的产率变小。
[0023] 优选地，步骤（1)所述的油酸和油胺的体积比为1: (2~3)，例如可以是1:2、1:2.2、 1:2.5、1:2.8或1:3。将二者的体积比限定在上述范围是为了使铋被充分还原，从而保证后 续反应顺利进行。
[0024] 优选地，步骤（1)所述反应的温度为170~250 °C，例如可以是175 °C、180、185 °C、 190。(：、195。(：、200。(：、205。(：、210。(：、215。(：、220。(：、225。(：、230。(：、235。(：、240。(：、245。(：或 250 °C。只有在此温度范围内才能得到粒径均一的纳米颗粒，否则会造成粒径不均一，治疗及代 谢效果不佳。
[0025] 优选地，步骤（1)所述反应的时间为10~60min，例如可以是lOmin、15min、20min、 25min、30min、35min、40min、45min、50min、55mini^60min〇
[0026] 优选地，步骤(1)所述惰性气体为氮气或氩气。
[0027] 优选地，步骤(2)所述溶液B的浓度为0 · 015~0 · 025g/mL，例如可以是0 · 015g/mL、 0. 02g/mL或0.025g/mL。硫浓度过高会导致不能充分溶解，颗粒尺寸不均一，影响其肿瘤热 疗和代谢的功能。
[0028] 优选地，步骤(3)所述反应的时间为10~20min，例如可以是lOmin、12min、14min、 16min、18min或20min。将步骤(3)所述反应的时间限定在此范围内是因为其影响最终产物 的尺寸，时间过长会导致产物尺寸过大，影响其代谢的功能;时间过短会使产物尺寸过小或 不能形成产物，都会影响其肿瘤热疗的功能。
[0029] 优选地，步骤(4)所述的环己烷与溶液C的体积比为(0.5~1): 1，例如可以是0.5: 1、 0.6:1、0.7:1、0.8:1、0.9:1或1:1。将所述体积比限定在此范围是因为环己烷过多或过少 会影响反应体系的降温速度以及颗粒在环己烷中的溶解度，从而影响最终纳米粒子的产 率。
[0030] 优选地，步骤(4)所述的无水乙醇与上清液的体积比为(0.5~1.5):1，例如可以是 0·5:1、0·6:1、0·7:1、0·8:1、0·9:1、1:1、1·1:1、1·2:1、1·3:1、1·4:1或1.5:1。将所述体积比 限定在此范围是由于无水乙醇的多少直接影响了颗粒尺寸的大小以及均一性。
[0031] 优选地，步骤(4)所述分离为离心分离。
[0032] 优选地，所述离心分离的转速为8000~12000rpm，例如8000rpm、9000rpm、 9500rpm、1OOOOrpm、10500rpm、11OOOrpm、11500rpm或12000rpm。
[0033] 优选地，所述离心分离的时间为3~7min，例如可以是3min、4min、5min、6minS 7min〇
[0034] 优选地，步骤(5)所述无水乙醇和环己烷的体积比为1:(0.5~1.5)，例如可以是1: 0·5、1:0·6、1:0·7、1:0·8、1:0·9、1:1、1:1·1、1:1·2、1:1·3、1:1·4或1:1.5。将该体积比限定 在此范围是由于无水乙醇的多少直接影响了颗粒尺寸的大小以及均一性。
[0035] 优选地，步骤(5)所述分离洗涤操作为离心分离。
[0036] 优选地，所述离心分离的转速为8000~12000rpm，例如8000rpm、9000rpm、 9500rpm、1OOOOrpm、10500rpm、11OOOrpm、11500rpm或12000rpm。
[0037] 优选地，所述离心分离的时间为3~7min，例如可以是3min、4min、5min、6minS 7min〇
[0038] 优选地，步骤(6)所述的吐温20与Cu3BiS3环己烷分散液的体积比为1:(90~120)， 例如可以是1:90、1:95、1:98、1:100、1:105、1:110、1:115或1:120。将所述体积比限在此范 围是因为吐温过多会使终产物毒性较大，吐温过少会影响终产物在水溶液中的溶解性。 [00 39] 优选地，步骤(6)所述体系中Cu3BiS3纳米粒子的浓度为l_3mg/mL，例如lmg/mL、 1 · 3mg/mL、1 · 5mg/mL、1 · 8mg/mL、2mg/mL、2 · 2mg/mL、2 · 5mg/mL、2 · 8mg/mL或3mg/mL，优选为 2mg/mL〇
[0040] 优选地，在步骤（6)所述加入吐温20后进行超声；优选地，所述超声的时间为1~ 1.511，例如可以是111、1.111、1.211、1.311、1.411或1.511。
[0041] 优选地，步骤(6)所述分离得到沉淀的方法包括以下步骤：
[0042] a、向加入吐温20后的体系中加入去离子水后，加热搅拌至溶液澄清，离心分离；
[0043] b、将沉淀分散至去离子水中，重复进行离心分离得到沉淀。
[0044] 优选地，步骤a所述去离子水与加入吐温20后的体系的体积比为（1.8~2.5): 1，例 如可以是 1.8:1、1.9:1、2.0:1、2.1:1、2.2:1、2.3:1、2.4:1 或 2.5:1。将该体积比限定在此范 围是由于去离子水的多少会影响吐温的修饰效果，从而影响终产物的分散性，进一步影响 其在肿瘤热疗和代谢的功能。
[0045] 优选地，步骤a所述加热的温度为60~80 °C，例如可以是60 °C、65 °C、70 °C、75 °C或 80°C。此温度范围下环己烷可以更好地蒸发掉而不达到其沸点。
[0046] 优选地，步骤a所述离心分离的转速为8000~12000rpm，例如8000rpm、9000rpm、 9500rpm、1OOOOrpm、10500rpm、11OOOrpm、11500rpm或12000rpm。
[0047] 优选地，步骤a所述离心分离的时间为5~lOmin，例如可以是5min、6min、7min、 8min、9min或10min。目的是去掉游离的吐温。
[0048] 优选地，步骤13所述离心分离的转速为8000~12000rpm，例如8000rpm、9000rpm、 9500rpm、1OOOOrpm、10500rpm、11OOOrpm、11500rpm或12000rpm。
[0049] 优选地，步骤b所述离心分离的时间为5~lOmin，例如可以是5min、6min、7min、 8min、9min或lOmin。目的是进一步去掉游离的吐温。
[0050] 优选地，步骤b所述离心分离重复进行2-5次，例如2次、3次、4次或5次。
[0051 ]作为优选技术方案，本发明所述的Cu3BiS3纳米药物的制备方法包括如下步骤： [0052] (1)将氯化铋和乙酰丙酮铜按照摩尔比1: (2~5)溶于体积比为1: (2~3)的油酸和 油胺的混合液中，在氮气或氩气保护下于170~250°C反应10~60min，得到溶液A;
[0053] (2)将硫单质溶于油胺中，使得氯化铋、乙酰丙酮铜与硫单质的摩尔比为1: (2~ 5): (2~5)，硫单质的浓度为0.015~0.025g/mL，得到溶液B;
[0054] (3)将溶液B注入溶液A中，170~250°C下反应10~20min，得到溶液C;
[0055] (4)向溶液C中加入环己烷，环己烷与溶液C的体积比为(0.5~1): 1，降至室温，取 上清液，加入与上清液的体积比为(0.5~1.5):1的无水乙醇，8000~12000rpm下离心分离3 ~7min得沉淀；
[0056] (5)将沉淀分散于体积比为1: (0.5~1.5)的环己烷和无水乙醇混合溶液中，8000 ~12000rpm下离心分离3~7min，得到Cu3BiS3纳米粒子；
[0057] (6)将Cu3BiS3纳米粒子分散于环己烷中，加入吐温20,吐温20与Cu3BiS 3环己烷分 散液的体积比为1: (90~120)，超声1~1.5h，向所得体系中加入去离子水，60~80°C下搅拌 至溶液澄清，离心分离，将沉淀分散至去离子水中，重复进行离心分离得到沉淀，将沉淀分 散于去离子水中得到所述Cu 3BiS3纳米药物。
[0058]另一方面，本发明提供了如第一方面所述的Cu3BiS3纳米药物在制备用于诊断和/ 或治疗肿瘤的药物中的应用。
[0059]本发明所述的双金属三元硫化物纳米药物即Cu3BiS3纳米药物，具有诊断、第二窗 口热疗和可代谢等多种功能，这些功能可以联合应用于肿瘤的诊断和治疗。
[0060]与现有的技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0061 ] (1)本发明的Cu3BiS3纳米药物的紫外吸收峰移至第二近红外窗口，通过第二近红 外窗口激光照射可增加激光穿透深度，降低活体组织对激光的吸收，减小对正常组织的损 伤。
[0062] (2)本发明制备的双金属三元硫化物纳米药物具有多种优良的成像功能，相较于 临床使用的X射线断层扫描（CT)成像造影剂，铋具有更高的X射线衰减，因此本发明的 Cu3BiS3纳米药物具有优良的CT成像增强性质;近红外区的强吸收赋予该纳米药物良好的光 声成像信号。本发明制备的纳米药物可以通过CT成像和光声成像诊断肿瘤的位置并监测治 疗过程中的反应。
[0063] (3)本发明制备出量子点尺度的双金属三元硫化物纳米药物，不仅可以基于尺寸 效应通过肾脏途径排出体外，残留在体内的也可以在短时间内降解而从体内清除，大大提 高了其安全性。本发明制备的纳米药物为无机材料在肿瘤诊断和治疗中的应用提供了安全 保障。
【附图说明】
[0064] 图1为实施例1制备的Cu3BiS3纳米药物的透射电镜图；
[0065]图2为实施例1制备的Cu3BiS3纳米药物的紫外吸收光谱；
[0066]图3为实施例1制备的Cu3BiS3纳米药物的X射线衍射图；
[0067]图4为实施例1制备的Cu3BiS3纳米药物的水合粒径分布图；
[0068]图5为不同浓度的实施例1制备的Cu3BiS3纳米药物在同一激光功率照射下的升温 曲线；
[0069] 图6为CCK-8法测试的MCF-7细胞经过不同浓度（10~150yg/mL)的Cu3BiS3纳米药物 处理24h后的细胞活力结果图；
[0070] 图7为暗场成像下MCF-7细胞对Cu3BiS3纳米药物的摄入情况结果图；
[0071] 图8为不同浓度的Cu3BiS3纳米药物在不同激光功率下对MCF-7细胞的杀伤作用结 果图；
[0072] 图9为Cu3BiS3纳米药物尾静脉给药后对荷瘤小鼠的CT成像图；
[0073]图10为Cu3BiS3纳米药物尾静脉给药后对荷瘤小鼠肿瘤部位的光声成像图；
[0074]图11为Cu3BiS3纳米药物尾静脉给药热疗后肿瘤的生长曲线图；
[0075]图12为Cu3BiS3纳米药物尾静脉给药后在小鼠体内的代谢过程图。
【具体实施方式】
[0076] 下面通过【具体实施方式】来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明 了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
[0077] 实施例1
[0078]在本实施例中，通过以下方法制备Cu3BiS3纳米药物，具体包括以下步骤：
[0079] (1)将0.3153g氯化铋（lmmol)和0.7853g乙酰丙酮铜（3mmol)溶于4mL油酸和10mL 油胺中，在氮气或氩气的保护下升温至220°C并保持30min，得到溶液A;
[0080] (2)称取0.096g硫单质（3mmol)溶于5mL油胺中，得到溶液B;
[0081 ] (3)将溶液B快速注入溶液A中，在220°C下反应lOmin，得到溶液C;
[0082] (4)将20mL环己烧注入溶液C中，降至室温，8000rpm离心3min取上清液，加入与上 清液等体积的无水乙醇，8000rpm离心3min得沉淀；
[0083] (5)将沉淀分散于环己烷和无水乙醇混合溶液(环己烷和无水乙醇的体积比为1: 1)中，8000rpm离心3min，离心分离三次，得到CmBiS3纳米粒子；
[0084] (6)将lOOyL吐温20和10mL 2mg/mL的Cu3BiS3环己烷分散液混合，超声lh，向所得体 系中加入20mL去离子水，70°C水浴加热搅拌至溶液澄清，8000rpm离心5min，将沉淀分散至 去离子水中，重复进行离心分离三次得到沉淀，将沉淀分散于去离子水中得到所述Cu3BiS3 纳米药物。
[0085]利用透射电镜对实施例1制备的Cu3BiS3纳米药物进行表征，结果如图1所示，可以 看出，粒子粒径小且较均一，粒径大小约为l〇nm左右。
[0086]对实施例1制备的Cu3BiS3纳米药物进行紫外吸收光谱分析，结果如图2所示， CmBiS3纳米粒子的紫外吸收峰位于近红外第二窗口 1300nm左右，可用第二窗口的激光进行 照射，增加穿透深度，减小正常组织的吸收。
[0087]为了验证实施例1制备的纳米粒子为硫铋铜三元化合物及其化学式，对产物进行 了X射线衍射分析，结果如图3所示，每个特征峰都和标准卡片(JCPDS NO. 71 -2115)的特征 峰对应，证明其符合Cu3Bi &的晶型。
[0088]此外，对实施例1制备的Cu3BiS3纳米药物进行了水合粒径分布分析，结果如图4所 示，结果显示，本发明的纳米粒子粒径为21.95nm，具有良好的代谢优势，另外，图中峰值十 分突出，说明本发明的纳米粒子粒径分布均一。从图1到图4可以看出已经成功制备出 Cu3BiS3纳米药物。
[0089]对实施例1制备的Cu3BiS3纳米药物进行激光照射升温分析，结果如图5所示，从图 中可以看出，用1W cnf2的近红外激光照射不同浓度的Cu3BiS3纳米粒子，温度会随着纳米粒 子浓度和照射时间的增加而增加，在l〇min左右达到稳定状态。
[0090] 实施例2
[0091] 在本实施例中，通过以下方法制备CmBiS3纳米药物，具体包括以下步骤：
[0092] (1)将0.31538氯化铋（1111111〇1)和0.3288乙酰丙酮铜（2111111〇1)溶于2.511114由酸和511^ 油胺中，在氮气或氩气的保护下升温至170°C并保持60min，得到溶液A;
[0093] (2)称取0.16g硫单质（5mmol)溶于6.5mL油胺中，得到溶液B;
[0094] (3)将溶液B快速注入溶液A中，在250°C下反应10min，得到溶液C;
[0095] (4)将20mL环己烧注入溶液C中，降至室温，lOOOOrpm离心5min取上清液，加入与上 清液等体积的无水乙醇，lOOOOrpm离心5min得沉淀；
[0096] (5)将沉淀分散于环己烷和无水乙醇混合溶液(环己烷和无水乙醇的体积比为1: 1.5)中，12000rpm离心3min，离心分离三次，得到CmBiS3纳米粒子；
[0097] (6)将100yL吐温20和9mL 2mg/mL的Cu3BiS3环己烷分散液混合，超声1.5h，向所得 体系中加入20mL去离子水，60°C水浴加热搅拌至溶液澄清，lOOOOrpm离心7min，将沉淀分散 至去离子水中，重复进行离心分离三次得到沉淀，将沉淀分散于去离子水中得到所述 Cu3BiS3纳米药物。
[0098] 通过电镜观察本实施例制备的纳米药物粒径为30nm左右，粒子粒径小且较均一。 Cu3BiS3纳米药物的紫外吸收峰位于近红外第二窗口 1300nm左右，X射线衍射分析证明其化 学式符合Cu3BiS3的晶型，水合粒径分布分析的结果显示，其水合粒径峰值为40nm左右。对 Cu3BiS3纳米药物进行激光照射升温分析同样表明用1W cnf2的近红外激光照射不同浓度的 CmBiS3纳米粒子，温度会随着纳米粒子浓度和照射时间的增加而增加，在lOmin左右达到稳 定状态。
[0099] 实施例3
[0?00]在本实施例中，通过以下方法制备Cu3BiS3纳米药物，具体包括以下步骤：
[0101 ] (1)将0 · 3153g氯化祕（lmmol)和0 · 82g乙酰丙酮铜（5mmol)溶于4mL油酸和12mL油 胺中，在氮气或氩气的保护下升温至250°C并保持lOmin，得到溶液A;
[0102] (2)称取0 · 064g硫单质（2mmo 1)溶于4· 2mL油胺中，得到溶液B;
[0103] (3)将溶液B快速注入溶液A中，在170°C下反应20min，得到溶液C;
[0104] (4)将20.2mL环己烷注入溶液C中，降至室温，8000rpm离心7min取上清液，加入与 上清液等体积的无水乙醇，8000rpm离心7min得沉淀；
[0105] (5)将沉淀分散于环己烷和无水乙醇混合溶液(环己烷和无水乙醇的体积比为1: 0.5)中，8000rpm离心7min，离心分离三次，得到CmBiS3纳米粒子；（6)将100yL吐温20和12mL 2mg/mL的Cu3BiS3环己烷分散液混合，超声lh，向所得体系中加入20mL去离子水，80 °C水浴加 热搅拌至溶液澄清，SOOOrpm离心5min，将沉淀分散至去离子水中，重复进行离心分离三次 得到沉淀，将沉淀分散于去离子水中得到所述Cu 3BiS3纳米药物。
[0106] 通过电镜观察本实施例制备的纳米药物粒径为30nm左右，粒子粒径小且较均一。 Cu3BiS3纳米药物的紫外吸收峰位于近红外第二窗口 1300nm左右，X射线衍射分析证明其化 学式符合Cu3BiS3的晶型，水合粒径分布分析的结果显示，其水合粒径峰值为50nm左右。对 Cu3BiS3纳米药物进行激光照射升温分析同样表明用1W cnf2的近红外激光照射不同浓度的 CmBiS3纳米粒子，温度会随着纳米粒子浓度和照射时间的增加而增加，在lOmin左右达到稳 定状态。
[0107] 实施例4
[0108] 在本实施例中，通过CCK-8比色法对实施例1制备的Cu3BiS3纳米药物对MCF-7细胞 活力的影响进行考察，其方法如下：
[0109] 1)细胞培养
[0110] 将人源乳腺癌细胞MCF-7培养于含有10%胎牛血清的DMEM或1640液体培养基中， 置于37 °C、5 %二氧化碳的培养箱中培养。 2)细胞活力测定
[0112]以6000细胞/孔密度，将细胞接种于96孔板中。贴壁24h后，加入含浓度为10、20、 50、80、100、15(^8/11^的〇1册33纳米药物（来自实施例1)的01^]\1或1640液体培养基（含有 10%胎牛血清）。在处理24h后，撤掉培养基;每孔加入110yL，含10% (体积比）CCK-8的细胞 培养液，在培养箱中孵育2h后，在酶标仪上测定450nm处吸光度值，600nm作为参比波长。每 组吸光度值扣除空白溶液吸光度值后，每孔对应值除以对照组的吸光度值作为细胞活力。 每组设置6个平行孔。
[0113] 细胞活力测定结果如图6所示，与对照组相比，实施例1制备的粒子从lOyg/mL到 150yg/mL实验浓度范围内对MCF-7细胞的活力没有显著性影响，其细胞活力均在100%左右 范围小幅度波动，说明没有明显的细胞毒性，这表明本发明的Cu 3Bi S3纳米药物在该浓度范 围内具有良好的生物相容性。
[0114] 实施例5
[0115] 在本实施例中，对在暗场显微镜下MCF-7细胞对实施例1制备的Cu3BiS 3纳米药物的 内吞作用进行考察，其方法如下：
[0116] 1)细胞培养
[0117] 将人源乳腺癌细胞MCF-7培养于含有10%胎牛血清的DMEM或1640液体培养基中， 置于37 °C、5 %二氧化碳的培养箱中培养。
[0118] 2)细胞摄入
[0119] 盖玻片放于六孔板中，将步骤1中培养的细胞接种于盖玻片上，5万细胞每孔，加入 2mL DMEM或1640液体培养基(含10%胎牛血清），置于37°C、5 %二氧化碳培养箱中培养24h。 然后在新配置的含有10%胎牛血清的DMEM或1640培养基中分别加入50yg/mL的Cu 3BiS3纳米 药物(来自实施例1)，混匀后各取2mL加入6孔板中，37°C、5%二氧化碳的培养箱中培养24h。 撤去培养基，用PBS洗三次，倒扣于滴加了甘油的载玻片上，指甲油封片。
[0120]结果如图7所示，在暗场显微镜下可以看到，由于Bi元素的存在，Cu3BiS3纳米粒子 可以用作暗场成像，且细胞内吞后可以看清楚细胞轮廓。
[0121] 实施例6
[0122] 在本实施例中，对不同浓度的Cu3BiS3纳米药物在不同的激光功率下对人源乳腺癌 细胞MCF-7的杀伤作用进行考察，方法如下：
[0123] 1)细胞培养
[0124] 将人源乳腺癌细胞MCF-7培养于含有10%胎牛血清的DMEM或1640液体培养基中， 置于37 °C、5 %二氧化碳的培养箱中培养。
[0125] 2)细胞死亡方式检测
[0126] 将步骤1中培养的细胞接种于6孔板，5万细胞每孔，加入2mL DMEM或1640液体培养 基(含10%胎牛血清），置于37°c、5%二氧化碳培养箱中培养24h。然后在新配置的含有10% 胎牛血清的DMEM或1640培养基中分别加入20yg/mL和50yg/mL的Cu 3Bi S3纳米药物(来自实施 例1)，混匀后各取2mL加入6孔板中，37 °C、5 %二氧化碳的培养箱中培养24h。撤去培养基，用 胰蛋白酶消化细胞，800g离心去上清，PBS缓冲液重悬细胞，重复洗三次，分别用功率密度为 0.75W cm-2,1.5W cm-2激光照射细胞团块8min，再用PBS缓冲液洗三次，AnnexinV-PI试剂盒 染色(AnnexinV是一种磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴 露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此AnnexinV被作为检测细胞早期凋亡的 灵敏指标之一。碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞 膜，但凋亡中晚期的细胞和死细胞由于细胞膜通透性的增加，PI能够透过细胞膜而使细胞 核染红。因此将Annexin V与PI匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来），然 后用流式细胞仪检测。采集一万个细胞进行分区，统计每一个区域细胞百分比，Origin软件 作图，分析细胞死亡的方式。
[0127] 结果如图8所示，从图8可以看出，本发明所述的纳米药物可以造成细胞凋亡和坏 死，并随着药物浓度和激光功率的增加其杀伤力增加。
[0128] 实施例7
[0129]在本实施例中，对Cu3BiS3纳米药物的X射线计算机断层扫描成像性能进行测定，方 法如下：
[0130] 5-6周雌性BALB/c裸鼠，右后腿部位皮下接种1000万个鼠源乳腺癌细胞4T1，待肿 瘤长到合适的大小后，尾静脉注射l〇mg 纳米药物（由实施例1制备的）200yL。然 后马上用X射线计算机断层扫描成像。取未注射前的图像作为对照。
[0131] 图9为静脉给药后的活体CT成像图，可以看出铋元素具有很强的CT成像信号，可以 很清晰地呈现出肺静脉丛，腔静脉，肾静脉丛，腹壁静脉，肿瘤表面血管，甚至是肿瘤内部的 微血管。因此，本发明的Cu 3BiS3纳米药物可以作为一种CT成像造影剂来进行生物成像。
[0132] 实施例8
[0133]在本实施例中对CmBiS3纳米药物的光声成像性能进行测定，方法如下：
[0134] 5-6周雌性BALB/c裸鼠，背部皮下接种1000万个鼠源乳腺癌细胞4T1，待肿瘤长到 合适的大小后，尾静脉注射2mg 纳米药物（由实施例1制备的）200yL。观察 Cu3BiS3纳米粒子在肿瘤部位的代谢情况。未注射前的扫描图像(图中标注为Pre)作为对照。
[0135] 图10为静脉给药后肿瘤部位的光声信号变化，可以看出Cu3BiS3纳米药物具有良好 的光声成像信号，并且在肿瘤部位积累，因此可以作为一种光声成像造影剂用于生物成像。
[0136] 实施例9
[0137] 在本实施例中对Cu3BiS3纳米药物的抑瘤作用进行考察，具体方法如下：
[0138] 1)老鼠接种肿瘤
[0139] 5-6周雌性BALB/c裸鼠，右后腿部位皮下接种1000万个鼠源乳腺癌细胞4T1，使肿 瘤长到合适的大小。
[0140] 2)抑瘤实验
[0141] 200yL实施例1中的Cu3BiS3纳米药物（2mg ml/1)和roS尾静脉注射给步骤1中的小 鼠，然后马上用激光(880nm，lW cnf2)照射lOmin，用热像仪监测升温过程。尾静脉给药但不 照激光的小鼠作为对照。激光照射后第二天开始用游标卡出测量肿瘤大小，往后每隔两天 用游标卡尺测量肿瘤大小。
[0142] 图11是用肿瘤的生长曲线，可以看出Cu3BiS3纳米药物照激光组的肿瘤生长明显受 到了抑制。而只照激光组和只注射Cu 3BiS3纳米药物组和注射PBS组肿瘤生长情况相近，都不 能明显抑制肿瘤生长。说明Cu 3BiS3纳米药物热疗可以有效抑制肿瘤生长。
[0143] 实施例10
[0144] 在本实施例中对Cu3Bi S3纳米药物在小鼠体内的代谢进行考察，具体方法如下：
[0145] 将实施例1制备的Cu3BiS3纳米药物（100yL，10mg mL-4尾静脉注入小鼠体内，不同 时间点（lOmin、2h、6h和24h)进行X射线计算机断层扫描，未注射前的图像（图中标注为Pre) 作为对照。如图12所示，Cu 3BiS3纳米药物随着时间在体内积累的同时也在通过尿液外排，肝 脏和脾脏在6h积累较多。在24h的时候基本从体内排出体外。
[0146] 实施例11
[0147] 在本实施例中对Cu3BiS3纳米药物在体外降解过程以及存在形态进行考察，具体方 法如下：
[0148] 将实施例1中的Cu3BiS3纳米药物置于溶酶体模拟液(ALF)中，不同时间点（30min、 12h和24h)取出后用于同步辐射XANES分析，结果如表1所示，Cu 3BiS3纳米药物在溶酶体模拟 液中经过氯化亚铜的中间形态，最终变成Cu-COO-。
[0149] 表1
[0150]
[0151]
【申请人】声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的Cu3BiS3纳米药物及其制备方 法和应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能 实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等 效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
【主权项】
1. 一种CmBi S3纳米药物，其特征在于，所述纳米药物是由吐温20包覆CmBi S3纳米粒子 形成的。2. 根据权利要求1所述的CmBiS3纳米药物，其特征在于，所述CmBiS3纳米粒子的粒径为 10-15nm; 优选地，所述C113B i S3纳米药物的粒径为5~50nm; 优选地，所述C113B i S3纳米药物的水合粒径为20~50nm。3. 根据权利要求1或2所述的Cu3BiS3纳米药物的制备方法，其特征在于，所述方法包括 以下步骤： (1) 将氯化铋和乙酰丙酮铜溶于油酸和油胺中，在惰性气体保护下反应得到溶液A; (2) 将硫单质溶于油胺中得到溶液B; (3) 将溶液B注入溶液A中，反应得到溶液C; (4) 向溶液C中加入环己烷，降至室温，取上清液，加入无水乙醇，分离得沉淀； (5) 将沉淀用环己烷和无水乙醇混合溶液体系进行分离洗涤操作，得到Cu3BiS3纳米粒 子； (6) 将Cu3BiS3纳米粒子分散于环己烷中，加入吐温20,向所得体系中加入去离子水，分 离得到沉淀，将沉淀分散于去离子水中得到所述Cu 3BiS3纳米药物。4. 根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，所述氯化铋、乙酰丙酮铜与硫单质摩尔 比为1:(2~5):(2~5); 优选地，所述溶液A的浓度为0.069~0.089g/mL; 优选地，步骤(1)所述的油酸和油胺的体积比为1:(2~3); 优选地，步骤（1)所述反应的温度为170~250 °C ; 优选地，步骤(1)所述反应的时间为10~60min; 优选地，步骤(1)所述惰性气体为氮气或氩气。5. 根据权利要求3或4所述制备方法，其特征在于，步骤(2)所述溶液B的浓度为0.015~ 0.025g/mL； 优选地，步骤(3)所述反应的时间为10~20min; 优选地，步骤(4)所述的环己烷与溶液C的体积比为(0.5~1):1; 优选地，步骤(4)所述的无水乙醇与上清液的体积比为(0.5~1.5): 1; 优选地，步骤(4)所述分离为离心分离； 优选地，所述离心分离的转速为8000~12000rpm; 优选地，所述离心分离的时间为3~7min。6. 根据权利要求3-5中任一项所述制备方法，其特征在于，步骤(5)所述无水乙醇和环 己烷的体积比为1: (0.5~1.5); 优选地，步骤(5)所述分离洗涤操作为离心分离； 优选地，所述离心分离的转速为8000~12000rpm; 优选地，所述离心分离的时间为3~7min。7. 根据权利要求3-6中任一项所述制备方法，其特征在于，步骤（6)所述的吐温20与 Cu3BiS3环己烷分散液的体积比为1: (90~120); 优选地，步骤(6)所述体系中Cu3B i S3纳米粒子的浓度为1 _3mg/mL，优 选为 2mg/mL; 优选地，在步骤(6)所述加入吐温20后进行超声； 优选地，所述超声的时间为1~1.5h。8. 根据权利要求3-7中任一项所述制备方法，其特征在于，步骤(6)所述分离得到沉淀 的方法包括以下步骤： a、 向加入吐温20后的体系中加入去离子水后，加热搅拌至溶液澄清，离心分离； b、 将沉淀分散至去离子水中，重复进行离心分离得到沉淀； 优选地，步骤a所述去离子水与加入吐温20后的体系的体积比为（1.8~2.5): 1; 优选地，步骤a所述加热的温度为60~80°C ; 优选地，步骤a所述离心分离的转速为8000~12000rpm; 优选地，步骤a所述离心分离的时间为5~1 Omin; 优选地，步骤13所述离心分离的转速为8000~12000rpm; 优选地，步骤b所述离心分离的时间为5~1 Omin; 优选地，步骤b所述离心分离重复进行2-5次。9. 根据权利要求3-8中任一项所述制备方法，其特征在于，所述方法包括 以下步骤： (1) 将氯化铋和乙酰丙酮铜按照摩尔比1: (2~5)溶于体积比为1: (2~3)的油酸和油胺 的混合液中，在氮气或氩气保护下于170~250°C反应10~60min，得到溶液A; (2) 将硫单质溶于油胺中，使得氯化铋、乙酰丙酮铜与硫单质的摩尔比为1: (2~5): (2 ~5)，硫单质的浓度为0.015~0.025g/mL，得到溶液B; (3) 将溶液B注入溶液A中，170~250 °C下反应10~20min，得到溶液C; (4) 向溶液C中加入环己烷，环己烷与溶液C的体积比为(0.5~1):1，降至室温，取上清 液，加入与上清液的体积比为(0.5~1.5): 1的无水乙醇，8000~12000rpm下离心分离3~ 7min得沉淀； (5) 将沉淀分散于体积比为1: (0.5~1.5)的环己烷和无水乙醇混合溶液中，8000~ 12000rpm下离心分离3~7min，得到CmBiS3纳米粒子； (6) 将Cu3BiS3纳米粒子分散于环己烷中，加入吐温20,吐温20与Cu3BiS 3环己烷分散液的 体积比为1: (90~120)，超声1~1.5h，向所得体系中加入去离子水，60~80°C下搅拌至溶液 澄清，离心分离，将沉淀分散至去离子水中，重复进行离心分离得到沉淀，将沉淀分散于去 离子水中得到所述Cu 3BiS3纳米药物。10. 根据权利要求1或2所述的Cu3BiS3纳米药物在制备用于诊断和/或治疗肿瘤的药物 中的应用。
【文档编号】A61P35/00GK105833298SQ201610173299
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年3月24日
【发明人】陈春英, 刘晶, 谷占军, 张潇
【申请人】国家纳米科学中心