专利名称:利用具有来源于外源物种的3-磷酸甘油醛脱氢酶活性的棒状杆菌属生产l-赖氨酸的方法
技术领域：
本发明涉及具有NADP依赖型3-磷酸甘油醛脱氢酶活性和L-赖氨酸产量 (productivity)提高的棒状杆菌属(Corynebacterium sp.)菌株，以及利用所述菌株生产 L-赖氨酸的方法。
2.背景技术：
一直以来，棒状杆菌是各种化学物质的生产中应用最为广泛的工业微生物，这些化学物质在动物饲料、医药和食品工业中很有用，包括氨基酸，如L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-精氨酸、L-苏氨酸和谷氨酸，以及核酸相关物质。这些微生物是革兰氏阳性的， 并且其生长需要生物素。棒状杆菌代表性的例子是棒状杆菌属(包括谷氨酸棒状杆菌 (Corynebacterium glutamicum))、短杆菌属(包括黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、 节杆菌属物种、细杆菌属物种等。
L-赖氨酸是一种L-氨基酸，由于其具有帮助身体吸收其他氨基酸从而提高饲料质量的能力，因此商业上被用作动物营养中的饲料添加剂。对于人体来讲，L-赖氨酸作为注射液的组分使用，在制药领域也有应用。因此，赖氨酸的工业生产在经济上是一个重要的工业工艺。
为了提高赖氨酸的产量，通常通过扩增赖氨酸生物合成途径上的基因或对这些基因的启动子进行修饰，来提高赖氨酸生物合成途径上的酶活性。此外，可以导入来源于其他细菌的外源基因，比如，在公开号为平7-1212 的日本专利文献中，描述了导入来源于大肠杆菌的编码柠檬酸合成酶的基因。
同时，为了提高赖氨酸的产量，可以对体内的中心碳代谢途径进行修饰。3-磷酸甘油醛脱氢酶是中心碳代谢途径中涉及的一个酶。在棒状杆菌中，它以gapA的形式存在，以 NAD作为辅酶，将3-磷酸甘油醛转化为1，3_ 二磷酸甘油酸，其中，pgk基因编码的酶将1， 3-二磷酸甘油酸转化为3-磷酸甘油酸。与之相反，在链球菌和芽孢杆菌中，它以非磷酸化的NADP依赖型GADPH(非磷酸化的NADP依赖型3-磷酸甘油醛脱氢酶，下文中称为gapN) 形式存在，其以NADP作为辅酶，将3-磷酸甘油醛转化为3-磷酸甘油酸，并产生NADPH。该过程是个单步的过程，在糖酵解中扮演重要角色，并受到NADPH/NADP比例的影响(Iddar，A 等人，Protein Expr Purif. 25(3) :519-26 (2002))
有报道指出，gapN酶在棒状杆菌中并不天生存在。目前也没有在培养棒状杆菌中使用gapN基因的报道。但是，已有通过导入gapN基因提高氨基酸产率的在先专利。例如，申请号为10-2004-0116999的韩国专利申请和US11/722，820的美国专利文献中描述了在大肠杆菌中表达gapN，以提高赖氨酸的产量，但是目前没有将其应用于棒状杆菌的报导。因此，为了达到gapN基因的效果，曾试图将源于醋酪酸梭状芽胞杆菌 (Clostridium acetobutyricum)的gapN在生产赖氨酸的棒状杆菌中表达，但是没有获得满意的结果。因此，本发明人通过文献搜索(Abdelaziz Soukri等人，INTERNATIONALMICROBIOLOGY (2005) 8 :251-258)，探索研究了存在于异源细菌中的三种类型的gapN基因。
本发明人发现，不使用NAD作为辅酶，而使用NADP作为辅酶，并为此对gapN进行表达，结果更高水平的NADPH可被用作赖氨酸生物合成的还原力来源。这样，棒状杆菌属菌株的L-赖氨酸的产量可以得到提高，由此完成了本发明。
发明概述
本发明的一个目的就是提供具有NADP依赖型3-磷酸甘油醛脱氢酶活性和L-赖氨酸产量提高的棒状杆菌属菌株，以及利用所述菌生产L-赖氨酸的方法。
附图简述
图 1 显示了变异链球菌(Streptococcus mutans)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)或蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)的3_磷酸甘油醛脱氢酶(gapN)的表达质粒pECCG122-PCj7-gapN的切割图谱；和
图2显示了用于破坏gapA基因的染色体插入载体PDZ-gapA的切割图谱。
具体实施方式
在一个实施例中，本发明提供了一种具有NADP依赖型的3-磷酸甘油醛脱氢酶活性和L-赖氨酸产量提高的棒状杆菌属菌株。
本发明所述的L-赖氨酸产量提高的棒状杆菌属菌株，可以通过失活内源的3-磷酸甘油醛脱氢酶编码基因(gapA)和导入外源的NADP依赖型3-磷酸甘油醛脱氢酶编码基因(gapN)而获得。
在本发明中，外源的NADP依赖型3-磷酸甘油醛脱氢酶编码基因包括编码多肽的任何核苷酸，只要所述多肽具有以NADP作为辅酶，将3-磷酸甘油醛作为底物转化为3-磷酸甘油酸的活性。
外源的NADP依赖型3-磷酸甘油醛脱氢酶的编码基因例子包括来源于动物、植物和细菌的NADP依赖型3-磷酸甘油醛脱氢酶编码基因，优选地为来源于细菌的NADP依赖型3-磷酸甘油醛脱氢酶编码基因，最优选地为来源于变异链球菌、无乳链球菌或蜡样芽孢杆菌的NADP依赖型的3-磷酸甘油醛脱氢酶的编码基因。更具体地，变异链球菌、无乳链球菌和蜡样芽孢杆菌的基因可以分别具有如SEQ ID NO. 11 (GenBank登录号NC_004350)、 12 (GenBank登录号NC_004116)和13 (GenBank登录号NC_004722. 1)所示的核苷酸序列。
可以使用本领域广泛知晓的通用方法将外源NADP依赖型的3-磷酸甘油醛脱氢酶的编码基因导入棒状杆菌中。
具体来说，可以用以下方式实现通过将外源NADP依赖型3-磷酸甘油醛脱氢酶编码基因导入载体，从而获得NADP依赖型3-磷酸甘油醛脱氢酶的表达重组载体；以及将该重组载体导入内源3-磷酸甘油醛脱氢酶基因失活的棒状杆菌，以产生转化的棒状杆菌。
可以使用通用的方法制备NADP依赖型3-磷酸甘油醛脱氢酶的表达重组载体，例如，用限制性内切酶将外源的NADP依赖型3-磷酸甘油醛脱氢酶与合适的载体连接。在本发明中，载体可以是具有如
图1所示切割图谱的载体。在本发明的一个具体实施例中，用于导入变异链球菌、无乳链球菌和蜡样芽孢杆菌基因的载体分别是pECCG122-Pcj7-gapm、 pECCG122-Pcj7-gapN2 和 pECCG122_Pcj7_gapN3。
所述内源的3-磷酸甘油醛脱氢酶编码基因是指编码下述酶的基因在棒状杆菌中，所述酶具有将NAD作为辅酶，将3-磷酸甘油醛作为底物转化为1，3- 二磷酸甘油酸的活性，优选地，是指具有如SEQ ID NO. 14所示的核苷酸序列(NCBI登录号NC_003450、 NCgl 1526)的基因。
进一步，为了失活内源的3-磷酸甘油醛脱氢酶的编码基因，可以进行遗传操作， 如棒状杆菌gapA基因的敲除、替代或插入。优选地，棒状杆菌可以用包括部分gapA基因的重组载体进行转化，例如，具有失活的gapA活性的菌株可以通过导入具有图2所示切割图谱的载体进行制备。在本发明的一个具体实施例中，使用pDZ-gapA重组载体作为染色体插入载体，所述载体具有连续克隆出的一部分内源3-磷酸甘油醛脱氢酶编码基因的两个片段。优选地，用该染色体插入载体进行转化的棒状杆菌可以是(但不限于)谷氨酸棒状杆菌KFCC-10881。根据本发明的一个具体实施例，其内源3-磷酸甘油醛脱氢酶编码基因被破坏的棒状杆菌可以是谷氨酸棒状杆菌CA01-0096(保藏号KCCM 11012P)。
如本文所用，术语“转化”是指将DNA导入宿主，其中该DNA仍保持为染色体外的元件或整合入染色体中，并可进行复制。如本文所用，术语“转染”是指具有任意编码序列的表达载体被宿主细胞所接受，所述表达载体可以表达也可以不表达。如本文所用，术语“转染的宿主”和“转化的宿主”是指被导入DNA的细胞。该细胞称为“宿主细胞”，其可以是原核的或真核的细胞。典型的原核细胞包括各种菌株如“大肠杆菌”。术语“载体”是指具有一段DNA序列的DNA产物，所述DNA序列可操作地相连于一个调控序列，所述DNA产物可以在合适的宿主中表达DNA。所述调控序列的例子包括转录启动子，调控转录的任意操纵子序列；一段编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列，和调控转录终止翻译终止的序列。载体的例子可以包括质粒、噬菌体颗粒或简单的潜在基因组插入体。一旦转入合适的宿主，所述载体可以独立于宿主基因组进行复制并行使功能，或者在某些情况下，自身可以整合入基因组中。如本文所用，术语“质粒”和“载体”有时可以互换使用，因为质粒是目前最广泛使用的载体形式。术语“调控序列”是指一段DNA序列，所述的DNA序列对于在一个特定宿主生物体中可操作连接的编码序列的表达是必需的。例如，在原核生物中表达所必需的调控序列包括启动子、任选的操纵(子)序列和核糖体结合位点。已知真核生物使用启动子、 多聚腺苷酸化信号和增强子。
当一个核酸被设置在与另一核酸序列具有功能性关系时，它就“可操作地连接”于该核酸序列。这意味着基因以这样的方式连接当调节序列与合适的分子(如转录激活蛋白)结合，使基因表达。例如，当作为前导蛋白表达，参与多肽的分泌时，前导序列或分泌序列的DNA是可操作地连接于多肽的DNA ；当影响到编码序列的转录时，启动子或增强子是可操作地连接于编码序列；当影响编码序列的转录时，核糖体结合位点是可操作地连接于编码序列；或当促进翻译时，核糖体结合位点是可操作地连接于编码序列。通常，“可操作地连接”是指被连接的DNA是连续的，并且在分泌肽的例子中，是连续的并处于同一阅读框。但是，增强子并不需要与编码序列直接相连。序列之间的连接可以通过便利的限制性内切酶位点的连接来实现。但是，当没有限制性内切酶位点时，可以根据常用方法使用合成的寡核苷酸接头。
如本文所用，术语“载体”是指插入了异源DNA片段的重组载体，所述的DNA片段通常是双链的DNA片段。在这里，异源DNA是指在宿主细胞中并不天然存在的异种DNA。一旦导入宿主细胞，表达载体可以不依赖于宿主基因组DNA进行复制，产生若干拷贝及其所插入的(异源)DNA。
为了提高宿主细胞中转入基因的表达水平，相应的基因必须与在所选的表达宿主中执行转录和翻译功能的表达控制序列可操作地连接，这是本领域的普通技术人员所知晓的。优选地，表达控制序列和基因部包含在单个表达载体中，所述表达载体包括细菌选择标记和复制起点。当表达宿主为真核细胞时，表达载体必须还包括真核表达宿主中有用的表达标记。
可用于制备本发明重组载体的载体，可以来源于在棒状杆菌中可自主复制的载体，例如噬菌体载体或质粒载体。噬菌体载体或粘粒载体的例子包括pWE15、M13、λ EMBL3、 λ EMBL4, AFIXII, λ DASHII, λ ΖΑΡΙI, λ gtlO、λ gtll、Charon4A 禾口 Charon21A，质粒载体的例子包括pBR质粒、pUC质粒、pBluescriptll质粒、pGEM质粒、pTZ质粒、ρΕΤ质粒、pMal 质粒、PQE质粒等等。
进一步地，可用于本发明的棒状杆菌包括任何棒状杆菌，只要它能生产L-赖氨酸。棒状杆菌的例子包括谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、嗜热棒状杆菌(Corynebacterium thermoaminogenes)、黄色失显杆菌(Brevibacterium flavum)、禾口发酵短杆菌(Brevibacterium fermentum)。
本发明的棒状杆菌包括具有L-赖氨酸产量提高的突变型菌株，也包括野生型菌株。例子包括需要蛋氨酸营养的菌株或对苏氨酸类似物(AHV α-氨基-β-羟基戊酸)、赖氨酸类似物(AEC :S-(2_氨乙基)-L_半胱氨酸)、异亮氨酸类似物(α -氨基丁酸)、蛋氨酸类似物(乙基硫氨酸)等具有抵抗性的菌株。另外，为了提高L-赖氨酸的产量，所述菌株可以是L-赖氨酸产量提高的突变株，所述突变株是通过提高导入基因的拷贝数或对基因的调节序列进行操作而制备的。优选地，它可以包括(但并不限于)谷氨酸棒状杆菌ATCC13032、嗜热棒状杆菌FERM ΒΡ-1539、黄色短杆菌ATCC14067、乳糖发酵短杆菌ATCC13869和由此制备的生产L-氨基酸的突变株或菌株，例如，谷氨酸棒状杆菌 KFCCl 1001，最优选地，谷氨酸棒状杆菌KFCC10881。
本发明的一个具体实施例中，提供了棒状杆菌属的菌株，谷氨酸棒状杆菌 CA01-0565(保藏号KCCM 11013P)，谷氨酸棒状杆菌CA01-0566 (保藏号、KCCM11014P)和谷氨酸棒状杆菌CA01-0567(保藏号KCCM 11015P)，所述菌株是通过分别将变形链球菌的基因、无乳链球菌的基因和蜡样芽孢杆菌的基因导入内源3-磷酸甘油醛脱氢酶编码基因失活的谷氨酸棒状杆菌KFCC10881而制备的。这些菌株于2009年7月2日保藏在KCCM (韩国微生物保藏中心，地址361-221育民大厦，洪济-1-洞，西大门区，首尔，韩国)。
L-赖氨酸产量的提高是由于通过激活NADP依赖型3_磷酸甘油醛脱氢酶，使得还原力得到提高。将外源的NADP依赖型3-磷酸甘油醛脱氢酶而不是内源NADP依赖型3-磷酸甘油醛脱氢酶导入产生L-赖氨酸的棒状杆菌中，使得NADP依赖型3-磷酸甘油醛脱氢酶被激活，从而使菌株利用NADP而非NAD作为辅酶，这样，NADPH水平的提高可以用作L-赖氨酸生物合成中还原力的来源。
本发明的另一个实施例提供了生产L-赖氨酸的方法，包括步骤培养具有NADP依赖的3-磷酸甘油醛脱氢酶活性和L-赖氨酸声量提高的棒状杆菌，和从培养细胞或培养液 (culture broth)中回收L-赖氨酸。
根据本发明，使用的棒状杆菌属菌株可以是连续或批次法培养，如分批处理、分批补料培养和重复的分批补料培养。在教科书[Chmiel，(Bioprozesstechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik(Gustav Fischer Verlag, Stuttgart,1991)； 禾口 Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/ Wiesbaden, 1994)]中概括描述了已知的培养方法。
使用的培养基必须以合适的方式满足特定菌株的需求。在手册[“Manual of Methods for General Bacteriology”，美国细菌学学会(华盛顿，美国，1981年)]中可以找到棒状杆菌培养基的描述。有用的碳源可以包括糖和碳水化合物，如葡萄糖、蔗糖、乳糖、 果糖、麦芽糖、淀粉和纤维素；油和脂肪，如大豆油、葵花油、花生油和椰子油，脂肪酸如棕榈酸、硬脂酸和亚油酸，醇类，如甘油和乙醇，以及有机酸，如乙酸。这些物质可以单独或以混合物的形式使用。有用的氮源可以包括含有机氮的化合物，如蛋白胨、酵母提取物、肉提取物、麦芽提取物、玉米浆、大豆粉和尿素，或无机化合物，如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵。氮源可以单独或以混合物的形式使用。有用的磷源可以包括磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或其相应的含钠盐。培养基还必须包括生长必需的金属盐如硫酸镁或硫酸铁。最后， 除上述提到的物质外，还可以使用基本生长物质，如氨基酸和维生素。合适的前体也可以添加到培养体系中。在培养中，所提到的物质可以以合适的形式连续地或分批地添加到培养体系中。
为了控制培养体系的pH值，宜使用碱性化合物如氢氧化钠、氢氧化钾和氨，或者酸类化合物如磷酸或硫酸。为了控制发泡，可以使用消泡剂如脂肪酸聚乙二醇酯。为了保持有氧的状态，可将氧气或含氧的气体如空气通入培养体系中。培养温度一般为20°C -45 优选为25°C-40°C。连续培养直至所需的L-氨基酸形成最高产量。该目标通常在10小时-160小时的期间内达到。
可以通过离子交换色谱法及其随后的茚三酮衍生作用对L-氨基酸进行分析 (Spackman 等人，(Analytical Chemistry，30，(1958)，1190)。
将根据下述实施例进行更详细地描述本发明。但是，本发明并不限于这些实施例。
实施例1.变形链球菌^tpN基因的研究和克隆
来源于链球菌的gapN基因序列已被清晰地揭示。变形链球菌gapN基因的信息 (登录号NC_004350)获自NIH基因银行。根据已报道的序列，合成了下面表1中描述的一对引物，使用变形链球菌ATCC25175菌株的染色体DNA作为模板，通过聚合酶链式反应(PCR) [Sambrook等人，分子克隆实验手册(1989)，冷泉港实验室]扩增1^8bp的gapN基因(PCR 条件变性=94°C、30秒/复性=50°C、30秒/聚合=72°C、1分钟30秒，30个循环)，使用 Τ0Ρ0克隆试剂盒(Invitrogen)将其克隆入大肠杆菌质粒pCR2. 1中，获得质粒pCR-gapm。
[表1]引物
权利要求
1.一种棒状杆菌属菌株，其特征在于，所述菌株具有NADP依赖型3-磷酸甘油醛脱氢酶活性并且具有提高的L-赖氨酸产量。
2.如权利要求
1所述的棒状杆菌属菌株，其特征在于，所述内源的3-磷酸甘油醛脱氢酶编码基因(gapA)是失活的，且导入了外源的NADP依赖型3-磷酸甘油醛脱氢酶编码基因 (gapN)。
3.如权利要求
2所述的棒状杆菌属菌株，其特征在于，所述外源的NADP依赖型3-磷酸甘油醛脱氢酶编码基因来自于变形链球菌(ATCC 25175)、无乳链球菌(ATCC BAA-611)或蜡样芽孢杆菌(ATCC 14579)。
4.如权利要求
3所述的棒状杆菌属菌株，其特征在于，变形链球菌的基因、无乳链球菌的基因和蜡样芽孢杆菌的基因分别具有SEQ ID NO. 11,12和13所示的核苷酸序列。
5.如权利要求
2所述的棒状杆菌属菌株，其特征在于，内源的3-磷酸甘油醛脱氢酶编码基因具有如SEQ ID NO. 14所示的核苷酸序列。
6.如权利要求
1所述的棒状杆菌属菌株，其特征在于，棒状杆菌属菌株是谷氨酸棒状杆菌CAO1-0565 (保藏号KCCM 11013P)、谷氨酸棒状杆菌CAO1-0566 (保藏号KCCM 11014P) 或谷氨酸棒状杆菌CAO1-0567 (保藏号KCCMl 1015P。
7.如权利要求
1所述的棒状杆菌属菌株，其特征在于，L-赖氨酸产量的提高是通过激活NADP依赖型3-磷酸甘油醛脱氢酶，使还原力提高获得的。
8.—种生产L-赖氨酸的方法，其特征在于，包括步骤培养权利要求
1-7之任一所述的棒状杆菌属菌株；和从培养的细胞或培养液中回收L-赖氨酸。
专利摘要
本发明涉及具有NADP依赖型3-磷酸甘油醛脱氢酶活性和L-赖氨酸产量提高的棒状杆菌属菌株，以及使用所述菌株生产L-赖氨酸的方法。根据本发明所述的棒状杆菌属菌株和使用所述菌株生产L-赖氨酸的方法，可以高产地生产L-赖氨酸。
文档编号C12N1/21GKCN102471758SQ201080030925
公开日2012年5月23日 申请日期2010年5月28日
发明者林相曹, 罗昭妍 申请人:Cj第一制糖株式会社导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan